1、微生物發酵工程實驗環境與生物工程實驗教學中心1實驗六、機械攪拌罐培養大腸桿菌 一、實驗目的二、實驗原理三、實驗材料四、實驗步驟五、實驗結果六、注意事項 七、思考題2 1、學會發酵參數的設置。 2、掌握發酵液參數的測定方法。一、實驗目的3 微生物在發酵培養的過程中其體系參數會發生變化。本實驗通過使用機械攪拌罐發酵培養大腸桿菌后測定其發酵液的菌體量、葡萄糖濃度、pH值。 采用分光光度計法在波長620nm下測定其濁度進行菌體量分析；利用pH計測定其pH值；葡萄糖濃度的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法，其原理為 3，5一二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內，棕紅色物

2、質顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。二、實驗原理4三、實驗材料1. 菌種：大腸桿菌。2.培養基： 種子活化培養基：牛肉膏3g/L ；蛋白胨10g/L ； 氯化鈉5g/L ；pH7.0-7.2。 發酵培養基：6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/LNH4Cl，0.5g/LMgSO47H2O，0.011g/L CaCl2 ，10g/L葡萄糖, pH 7.0 。 3.葡萄糖標準溶液和3，5-二硝基水楊酸試劑。 5四、實驗步驟（一）種子培養 用接種環從保存斜面中接一環至盛有種子活化培養基的三角瓶中，37振蕩培養。（二）大腸桿菌的培養 調小氣量，燃燒酒精，旋松接種口

3、蓋，在火焰保護下，打開接種口蓋，倒入種子，旋緊接種口蓋子。開始發酵，發酵條件為35、300r/min。每隔2小時取樣。6（三）取樣 每次取樣時將管口先流出的10ml培養液作為廢液，取隨后流出的20ml。（四）發酵結束處理 剩余菌液進行滅菌處理，排放到指定地點，進行罐的清洗。 四、實驗步驟7（五）取樣分析 1.取樣菌體量的分析：測定620nm濁度。 2.葡萄糖濃度的測定：3,5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法） （1）標準曲線的制作 取九支試管，編號，按下表加入各種試劑。將各管快速搖動混勻，在沸水浴中加熱 5min,取出后立即用水冷卻到室溫，再向每支試管中加入21.5ml蒸餾水,搖勻,于520

4、nm波長測A值,以葡萄糖mg數為橫坐標,光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。 四、實驗步驟8 （2）樣品測定 取離心的上清夜稀釋，取1ml于試管中，加蒸餾水1ml，加3,5-二硝基水楊酸試劑1.5ml，加完試劑后同以上操作，測定吸光值，在標準曲線上查出葡萄糖的含量，計算培養基中葡萄糖的量。項目0123456781mg/ml溶液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.43,5-二硝基水楊酸試劑(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5 3. pH值的測定 將不同時段取樣離心的上清夜用pH計進行測量,觀察發酵過程中pH值的變化,并以時間為橫坐標,相應pH值為縱坐標作圖。9 (1) 以時間為橫坐標，菌體數量，濁度，葡萄糖濃度，pH為縱坐標作圖，觀察各參數的變化。 (2)計算最大比生長速率和葡萄糖的比消耗速率。五、實驗結果10 1.機械攪拌罐培養大腸桿菌接種和取樣過程中應注意避免造成污染和正確使用設備。 2.注意正