1、 生物技術 2011051838即使往人類的知識寶庫里投入一顆沙子也是偉大的居里夫人基因工程原理(yunl)作業1.同裂酶和同尾酶有何區別(qbi)？同尾酶：切割不同的DNA片段(pin dun)但產生相同的粘性末端的一類限制性內切酶。同裂酶：識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可能不同。不同的地方：同裂酶識別相同的核苷酸序列，可能切割產生不同的末端；同尾酶識別不相同得核苷酸序列但產生的末端相同。2.基因工程常用的各種酶的催化活性與用途。表1 基因工程常用的工具酶核酸水解酶核酸合成酶核酸修飾酶其它分子克隆工具酶核糖核酸酶DNA聚合酶甲基化酶依賴于DNA的RNA聚合酶脫氧核糖核酸酶RN

2、A聚合酶激酶連接酶限制性核酸外切酶連接酶 基因轉移酶T4多核苷酸激酶限制性核酸內切酶磷酸酶堿性磷酸酶 核酸酶核酸酶抑制劑瓊脂糖酶DNA結合蛋白 其他酶 表2 基因工程各種工具酶活性及用途工具酶名稱活性及用途甲基化酶生原核物甲基化酶將 DNA 甲基化后，就不被相應的限制酶所切割。Dam 甲基化酶在a處甲基化。E.coli DNA聚合酶I53外切酶活性（DNA復制）；35和53外切酶活性（較正和切除）。Klenow DNA 聚合酶DNA聚合酶I經蛋白酶裂解而從全酶中除去具53外切酶活性得到的肽段。T4 噬菌體DNA聚合酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌；53聚合酶活性，效率為pol I的兩倍；35外

3、切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA。 T7 噬菌體 DNA 聚合酶來源于T7 噬菌體 感染的大腸；53DNA聚合酶活性和外切核酸酶活性；35外切核酸酶活性為klenow酶的1000倍。 Sequenase（測序酶）切除了 99% 以上的 3-5 外切活性的 T7 噬菌體 DNA 聚合酶； Sequenase Version 2 切除了所有的 3-5 外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進行測序的理想用酶。 耐熱 DNA 聚合酶分離自水生棲熱菌，最適反應溫度75， 對95高溫具良好穩定性；主要用于DNA的體外擴增，經25次循環后才進入酶的反應穩定期，一個DNA 分子因而可被擴增4106倍

4、。反轉錄酶依賴于RNA的DNA聚合酶，來自AMV（禽成髓細胞瘤病毒）。末端轉移酶（terminal transferase）一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結合到DNA分子的3羥基端；用于催化DNA的3末端添加同聚物、DNA的3末端標記等。連接酶 （Ligase）連接酶就是將兩段核酸連接起來的酶，相當于基因工程中的“糨糊”。T4 多聚核苷酸激酶（polynucleotide kinase）多核苷酸激酶是由T4噬菌體的pseT基因編碼的一種蛋白質，最初也是從T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞中分離出來的，因此又叫做T4多核苷酸激酶。 堿性磷酸酶催化除去DNA或RNA 5-磷酸的反應；2通過去

5、除5-磷酸基團，可以防止DNA片段自首連接，或標記5端前除去DNA或RNA的5磷酸。核酸酶核酸分解的第一步是水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在高等動植物中都有作用于磷酸二酯鍵的核酸酶。核酸酶抑制劑抑制的RNase；用途：cDNA合成反應中，如反轉錄，RT-PCR，體外轉錄和體外翻譯 。瓊脂糖酶瓊脂糖水解酶，將瓊脂糖亞單位水解呈新瓊脂寡糖。對熱很穩定，反應不需緩沖液；用于從低熔點瓊脂糖凝膠中分離純化大片段DNA或RNA片段。單鏈DNA結合蛋白SSB 協同的和單鏈DNA結合而不與dsDNA結合，維持單鏈DNA的穩定。拓撲異構酶是指通過切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來更正DN

6、A連環數的酶。RecA蛋白 可促進dsDNA對同源ssDNA的吸收作用，是依賴于DNA的ATP酶。蛋白酶K常用的蛋白酶，用于去除殘留的酶類及樣品中的蛋白質。溶菌酶是一類水解細菌細胞壁中肽聚糖的酶。分子克隆中常用的是卵清溶菌酶，用于破碎細胞。解旋酶*在DNA或RNA復制過程中催化雙鏈DNA或RNA解旋的酶光解酶*在DNA的修復中起作用，由于DNA序列中TT在光照下容易形成嘧啶二聚體，加入光解酶后就可以避免形成二聚體。顆粒酶B*是殺傷性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶，引起的細胞凋亡。基質金屬蛋白酶*水解細胞外基質的蛋白裂解酶，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關

7、鍵性作用。核酸酶*一種人工構建的核酸酶，介導基因定點修飾的酶，如基因的定點敲除。 *表示(biosh)從網上找到的書上沒有的新酶基因工程(jyn gngchng)常用(chn yn)載體 表3 基因工程常用的載體載體名稱用途質粒載體以質粒為載體，將目的基因通過轉化或轉導的方法導進宿主細胞，進行重組、篩選和擴增。噬菌體載體以噬菌體作載體，將外來目的DNA替代或插入中段序列，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。單鏈絲狀噬菌體載體大腸桿菌絲狀噬菌體M13、f1和fd均為單鏈環狀DNA噬菌體。M13載體制備單拷貝，用于測序，定點誘變及合成探針等。由于其重組體趨于不穩定，故這類載體不用作常規克隆

8、的載體。噬菌粒噬菌粒實際上是帶有絲狀噬菌體大間隔區的質粒載體，是集質粒和絲狀噬菌體的有利特征于一體的載體；代表：pUC118和pUC119酵母人工染色體載體模擬酵母菌染色體的復制而構建的載體，是第一個可保持為線性分子的載體，從而模擬了染色體。這樣的載體稱為酵母人工染色體 。當裝載外源DNA片段后，在酵母菌中可像酵母的染色體一樣復制，從而達到克隆大片段DNA的目的。細菌人工染色體載體細菌人工染色體是基于大腸桿菌的F質粒構建的高容量低拷貝質粒載體P1 人工染色體載體結合了 P1 載體和 BAC 載體的最佳特性，包括陽性選擇標記 sacB 及噬菌體 P1 的質粒復制子和裂解性復制子。穿梭載體（Shu

9、ttle vector）穿梭載體是能夠在兩類不同宿主中復制、增殖和選擇的載體。整合載體在生物學研究和基因工程應用中，會涉及將某個基因或某些基因插入到染色體中去的工作，承擔這部分工作的載體，可稱為整合載體pYEJ001一種以pBR322為基礎的酵母質粒昆蟲桿狀病毒如核型多角體病毒ACNPV ，昆蟲體系的優點是表達效率高，目的基因插入的容量相對大，使用安全等； 目前在農業基因工程上應用較多。如攜帶殺蟲基因的病毒對農作物進行生物防治。4.基因工程相關章節(zhngji)習題。第二章1.限制性內切酶可劃分為哪幾個類型(lixng)，各有何特點？。限制性內切酶依據酶的亞單位組成、識別序列的種類、是否需要

10、輔助因子分類，可分三類(I, II III)，也有分四類(s li),IIs類,即II亞類，其特點如下表。 酶分子三亞基多功能酶 內切酶與甲基化酶分子不在一起 二亞基雙功能酶識別位點二分非對稱4-6bp, 大多數為回文對稱結構5-7bp 非對稱切割位點無特異性，至少在識別位點外 1000bp 在識別位點中或靠近識別位點在識別位點下游 24-26bp限制反應與甲基化反應互斥分開的反應同時競爭限制作用是否需用 ATPYesNoYes2.哪些(nxi)酶可用于DNA片段的末端標記？Pol、Klenow DNA 聚合酶、T4 噬菌體 DNA 聚合酶、T4多核苷酸激酶(jmi)、末端脫氧核苷酸轉移酶。

11、3.DNA聚合酶有哪些類型，各有什么活性？。類型：大腸桿菌 DNA 聚合酶、Klenow DNA 聚合酶、T4 噬菌體 DNA 聚合酶、T7 噬菌體 DNA 聚合酶、耐熱DNA聚合酶 、反轉錄酶 、末端脫氧核苷酸轉移酶。DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶結構基因polApolBpolC(dnaE)不同種類的亞基數目1710相對分子量103000880008300035核酸外切酶+53核酸外切酶+-聚合速度（核苷酸/分）1000120024001500016000持續合成能力32001500500000功能切除引物，修復修復修復4.分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？限制性內切酶作用底物：識

12、別和切割雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列。連接酶作用底物：將雙螺旋DNA分子的某一條鏈上兩個相鄰核酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現的單鏈缺口封閉起來。修飾酶作用底物：能催化稀有堿基參入RNA或DNA，或對原有堿基進行修飾，以防止限制性內切酶的破壞。第三章1.作為一個最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？ 將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞并能自我復制的工具稱為載體。 作為一個最基本的克隆載體，它必須具備復制起點、酶切位點、篩選標志；作為一個最基本的表達載體，必須具備的功能元件有啟動子、酶切位點、轉錄終止序列、篩選標志、原核表達載體和SD序列。 作為-互補(h b)，在載體構建中有何作用？ -互補

13、：是指lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現互補。-互補是基于在兩個(lin )不同的缺陷-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現的功能互補而建立的。將缺失編碼的第11-41位氨基酸的-半乳糖苷酶基因稱為lacZM15基因，將半乳糖苷酶基因的調控序列和編碼-半乳糖苷酶N段140個氨基酸的序列稱為lacZ。這兩個基因的產物單獨存在是都無酶活性，但混合之后卻有酶活性。在載體上加lacZ，在受體菌中引入lacZM15基因，IPTG作為誘導物，底物X-gal被-半乳糖苷酶分解后可以產生藍色。如果質粒載體中插入外源基因，則不能產生互補，不可能產生藍色

14、。白色菌落是含有插入外源DNA的重組質粒，因此可利用菌落顏色變化來篩選插入外源DNA的重組質粒。 這種方法是根據組織化學的原理還篩選重組體的。主要是在載體(zit)的非必要區插入一個帶有大腸桿菌-半乳糖苷酶基因片段，重組成功則形成白色菌斑，非重組噬菌體則形成藍色菌斑。3.請簡要描述噬菌體溶源狀態和裂解循環的基因調控模式及其在構建載體中的作用 當噬菌體DNA進入宿主細胞后，其兩端的互補單鏈通過堿基配對形成環狀DNA分子，后在宿主細胞的DNA連接酶和旋促酶作用下形成封閉的環狀DNA分子充當轉錄的模板。噬菌體進入溶原狀態或是裂解生長狀態。 作用：噬菌體可作為基因工程操作中的載體，用于目的基因的克隆和

15、儲存。其溶源狀態為該作用提供了基礎。4 噬菌體發育調節（1）感染周期：吸附、立即早期轉錄、延遲早期轉錄、溶原和裂解的感染分化、進入裂解生長、溶源化。（2）克隆原理噬菌體載體屬于克隆載體，主要用于克隆DNA片段。構建cDNA文庫和基因組文庫，并從中篩選目的基因是噬菌體載體的一般用途，也可以用于亞克隆在大容量載體（如粘粒載體）中增殖的外源DNA片段。（3）克隆步驟（噬菌體克隆外源目的基因） 通過裂解過程增殖載體回收、純化載體；載體與外源DNA的酶切；載體與外源DNA連接；重組噬菌體的體外包裝；包裝噬菌體的感染infect；篩選。5.簡單描述M13KO7輔助噬菌體的遺傳學特征和生物學功能及其在制備單

16、鏈DNA中的作用。遺傳學特征：是M13的衍生株，大小為8.7kb，帶有來自p15A質粒的復制起點。還帶有一個來自轉座子Tn903的卡那霉素抗性基因，用作選擇標記。基因帶有一個G-T的突變，導致該基因蛋白的第40位氨基酸由甲硫氨酸變為異亮氨酸。生物學功能：當M13KO7感染帶有噬菌粒的大腸桿菌后，進入宿主細胞內的單鏈DNA在宿主細胞內酶的作用下轉變為雙鏈，后者可在質粒p15A的復制起點(qdin)控制下進行復制。由于細胞內M13KO7雙鏈DNA的積累并不需要噬菌體基因產物的作用，細胞內的噬菌粒幾乎沒有機會干擾所進入的M13KO7噬菌體基因組的早期復制。M13KO7基因組雙鏈DNA可表達產生子代單

17、鏈DNA所必需的所有蛋白。但M13KO7中突變的基因產物與自身攜帶的噬菌體復制起點的作用尚不如它與克隆于噬菌粒pUC118和Puc119中噬菌體復制起點的作用有效，這就使得噬菌粒正鏈DNA能夠優先合成，以確保在細胞所產生的病毒顆粒中來自噬菌粒的單鏈DNA能夠占據(zhnj)優勢。當不含噬菌粒的宿主菌被M13KO7感染后，突變基因產物則完全可與自身的殘缺復制起點作用，并產生足夠量的M13KO7噬菌體，以作為產生噬菌粒單鏈DNA的種子。第四章思考題1.大容量克隆(k ln)載體有哪些種類，各有何特點？種類：粘粒載體（cosmid） 、酵母人工染色體載體（yeast artificial chrom

18、osome ,YAC） 、細菌人工染色體載體（bacterial artificial chromosome,BAC）、P1噬菌體載體和P1人工染色體載體（P1 artificial chromosome ,PAC），其特點如下表所示。載體容量(kb)復制子宿主拷貝數重組DNA導入宿主的方式篩選標記克隆DNA獲取方法黏粒30-45ColE1E.coli高轉導-堿抽提P170-100P1E.coli1轉導sacB堿抽提PAC130-150P1E.coli1電轉化sacB堿抽提BAC120-300FE.coli1電轉化a-互補堿抽提YAC250-400ARSyeast1轉化ade2脈沖場電泳2.簡

19、述利用YAC克隆載體構建基因文庫的原理。YAC 載體主要是用來構建大片段 DNA 文庫，特別用來構建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規的基因克隆。 當用 BamH切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復制的必要順式元件，如自主復制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅動染色體的復制和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。YAC的轉化過程(1)宿主酵母菌： trp- 和 ura-；(2）選擇方式:只有同時得，才能在基本培養基（不加TRP和URA）上生長。對于 BamH切割后形成的微型酵母染色體，當用 EcoR或 Sma 切割抑制基因

20、 sup4 內部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉化進入到酵母菌后可象染色體一樣復制，并隨細胞分裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目的。3.BAC克隆載體(zit)有哪些顯著優點？ BAC 與 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色體 ）相似，沒有包裝限制，因此可接受的基因組 DNA 大小也沒有固定的限制。大多數 BAC 文庫中克隆的平均大小約 120kb ，然而(rn r)個別的 BAC 重組子中含有的基因組 DNA 最大可達 300kb。第五章1.以大腸桿菌為例，表

21、達載體比克隆載體多了哪些功能元件(yunjin)，各有什么生物學功能？大腸桿菌表達載體都是質粒載體。作為表達載體首先必須滿足克隆載體的基本要求，即能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中。在基本骨架的基礎上增加表達元件，就構成了表達載體。各種表達載體的不同之處在于其表達元件的差異。 大腸桿菌表達載體應有的結構成分：復制起始點；抗性基因；多克隆位點；表達系統元件。2.簡述利用T7噬菌體啟動子的pET系列表達載體的工作原理。表達載體pET-5a是典型的pET載體（見下圖）其組成是在載體的基本結構上加入了T7噬菌體啟動子序列及其下游的幾個酶且位點。當外源基因插入到這些酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表

22、達。 T7噬菌體啟動子只能由T7噬菌體RNA聚合酶識別并啟動轉錄，而大腸桿菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌體啟動子。因此要求用于表達(biod)的宿主細胞必須能表達T7噬菌體的RNA聚合酶。 3.何為(h wi)穿梭載體，在遺傳結構上有何特點？穿梭載體（Shuttle vector）：是能夠在兩類不同(b tn)宿主中復制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細胞中復制又能在真核細胞中復制，或能在 E.coli 中復制又能在革蘭氏陽性細菌中復制。這類載體主要是質粒載體。遺傳結構特點：至少含有兩套復制單元和兩套選擇標記。第六章1.印跡分子雜交有哪些類型，并說明在什么情況下需要使用這些方法。印

23、跡分子雜交根據其檢測對象的不同可分為 Southern 雜交(DNA-DNA)、Northern 雜交(DNA-RNA)和 Western 雜交(蛋白質和蛋白質)等,以及由此而簡化的斑點雜交、狹線雜交和菌落雜交等。（1）Southern blotting：檢測混合樣品中特定DNA分子是否存在，以及其分子量大小。（2）Northern印跡雜交：檢測細胞或組織樣品中是否存在與探針同源的 mRNA 分子，從而判斷在轉錄水平上某基因是否表達，在有合適對照的情況下，通過雜交信號的強弱可比較基因表達的強弱。 （3）Western印跡雜交：檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，用特異的抗血

24、清對蛋白質進行鑒定及定量的方法。（4）原位雜交：用來從用質粒或 Cosmid 構建的基因文庫中尋找陽性克隆子，當得到陽性克隆子后，再通過 Southern 雜交進一步驗證。（5）斑點雜交：將 DNA 或 RNA 分子以斑點的形式固定在濾膜上，然后進行分子雜交以檢測目的核酸。 2.核酸分子的標記有哪些方法，各有何特點？DNA （或 RNA ）探針的標記方法很多，主要(zhyo)有均勻標記、單鏈探針標記、末端標記，不同的標記方法適用于不同的分子，標記方法不同要求的工具酶也不一樣。常見的標記物有放射性同位素和生化酶兩種。（1）均勻(jnyn)標記是指間接標記不是標記探針分子本身(bnshn)，而是復

25、制一段新的探針分子，在復制過程中摻入標記的核苷酸（如 - 32 PdATP），從而使整個新分子被均勻地標記。缺口平移標記（Nick Translation）：這種標記方式目前只有通過大腸桿菌 DNA 聚合酶 來完成，只有該酶具有 5-3 外切活性。通過在待標記的 DNA 分子上產生切口，該酶引發 5-3 外切反應，在隨后的 5-3 DNA 聚合反應中若存在標記的脫氧三磷酸核苷酸 （dNTP），新合成的核酸鏈就帶有標記物。缺口平移法 ：利用體系中 DNA聚合酶I 5 3外切酶活性、5 3的聚合酶活性的兩種作用隨機摻入標記單核苷酸，從而使新合成的核酸鏈帶有標記物。在整個標記反應體系中，待標記的 DNA 分子的任何一條鏈中的任何位點（除靠近 5 端外）都可能作為標記反應的起始點，并持續到該鏈的 3 末端。因此，新合成的被標記的分子可以代表該待標記的 DNA 分子的絕大部分核苷酸序列。 隨機引物標記：利用由 6 個核苷酸組成的序列隨機的寡核苷酸為引物，在 Klenow 酶的作用下對目標 DNA 進行隨機擴增。在擴增中加入標記的 dNTP ，擴增出來的 DNA