1、談談固定液的使用作者: HYPERLINK /bbs/space.php?uid=2066250 t _blank liza3 HYPERLINK /bbs/space.php?uid=2066250 t _blank (站內聯系TA) 發布: 2013-01-11當前，應用于固定試劑的種類較多，它們對于固定不同的組織成分起著不同的作用，因此我們在使用時應該了解不同固定劑的效能，才能合理的固定組織。根據Bencroft的分類法，將不同的固定劑分為四種類型：類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。類：蛋白變性類，甲醇，乙醇

2、，醋酸等。類：其他，氯化汞，苦味酸等。上述四種類型的固定劑，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技術方面中用到。下面根據使用的需要，將著重介紹幾種常用的固定劑。（1）甲醛甲醛商品名為福爾馬林，一般市售的含甲醛3740%，由甲醛氣體飽和于水而成，比重為1.12。它也可以穩定的固體形式存在，它的成分為高分子量的聚合體，稱為多聚甲醛。甲醛溶液較難純化，在每批市售商品中，都含有不少的雜質如甲醇，這種在組織化學方法當中，能使酶鈍化，影響其反應。甲酸，它可使固定液變酸，在陳列標本或長時間固定的組織，由于酸的作用，往往細胞核染色欠佳。甲醛有效固定作用的要點是，在蛋白質末端基團之間形成交聯鏈。參與甲醛固定蛋白

3、質的基團，主要為氨基，亞氨基及酰氨基，肽，胍基，羥基，SH和芳香環。甲醛與組織蛋白類的反應是多樣和復雜的，因為它能和多種不同的功能基團結合，在多數情況下在其間形成橋鍵。甲醛有這種交聯的功能，也是它的缺點，在用甲醛固定過的組織中，需要做免疫組化的，往往提倡用酶消化或熱抗原修復法來使蛋白與甲醛交聯的醛鍵斷裂開，以利于后來的染色。甲醛可配成簡單的或混合的固定液，最簡單和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，這就是10%的福爾馬林.當然,現在使用的固定液要求較為嚴格些,最好是使用緩沖福爾馬林固定液,這將有利于后來的免疫組化染色的需要.從組織學的觀點來說,甲醛是一種良好的固定劑,它有很多

4、的優點:1. 組織收縮較少,損傷少,保存固有物質好.2. 固定均勻,穿透力強.3. 能使組織硬化,增進組織彈性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂類物質.5. 成本較低.雖然甲醛有上述的優點,但這都是相對而言,任何物質都不可能十全十美的,它也有許多缺點:1. 雜質含量較多,如甲醇,可鈍化酶類,影響反應.2. 含有微量甲酸,導致固定液酸變,影響染色.3. 可產生福爾馬林色素,影響觀察.4. 不能固定尿酸和糖類物質.5. 容易揮發,污染環境,可導致標本干涸.6. 可長期存在于固定過的組織上.有人做過實驗,組織用甲醛固定后在流水中沖洗5小時后,仍留有相當多的甲醛與蛋白質相結合,但需要經過長時間的流水沖

5、洗(24天的沖洗)方能除去.可見存在于組織上的甲醛是不可能除去的.因為臨床活檢不可能有這么長的時間來沖洗組織.因此要特別指出的是,在其后的各種技術操作中,要特別注意到甲醛的存在,必須要想辦法除去它,否則將會給各種染色造成影響,甚至導致失敗。應用甲醛,可以配成許多種固定液:1. 10%緩沖福爾馬林固定液甲醛 100ml蒸餾水 900mlNaH2PO44gNa2HPO4 6.5g該固定液是當今流行的固定液,因它對組織固定較好,損傷較少,因對其后的各方面的研究都較好,尤其是對免疫組化的染色.2、10%福爾馬林固定液甲醛100 ml自來水900ml這是一種最簡單的固定液，適合于邊遠地區攜帶的固定液，但

6、由于它的單一性，因此，只要有條件的單位都不要求使用這種固定液。3、10%福爾馬林鹽固定液甲醛 100ml自來水 900mlNacl 9克先將Nacl溶于水，再加入甲醛。這也是一種較為簡單的固定液，但由于加入Nacl，它是一種重金屬鹽物質，加入了它可促進和改善染色，增加染色的強度。4、Bouin氏固定液苦味酸飽和水溶液 75ml甲醛 2 ml冰醋酸 5 ml該固定液中的冰醋酸，對膠原纖維等組織有膨脹作用。而甲醛對組織有收縮作用。兩種試劑的混合使用，用以抵消彼此間的副作用。使組織固定達到優良的固定水平。5醛糖鈣固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸鈣20g蒸鎦水90ml先將蔗糖和乙酸鈣溶于蒸鎦水，

7、后加入甲醛。該固定液對于做酶的組織化學的研究效果較好，組織固定后，做冰凍切片，再給予顯示。當前國內外基本上都還是要用甲醛來固定組織。從免疫組織化學的角度來說，甲醛固定的組織大部分都可以用免疫組化的手段來檢測，據多人認為，它對IgA ，IgM，J鏈，K鏈和鏈的標記效果較好，且背景清晰。但美中不足的是：經它固定的組織，可與蛋白形成醛交聯蛋白，這種醛鍵可封閉抗原。固此，在免疫組化實際檢測中，應根據不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修復如微波、高壓等的方法，以便破壞醛鍵重新暴露抗原。（2）酒精：又稱乙醇，為無色透明的液體，沸點是78度，工業酒精是95%。酒精它有許多優點：1、 可保存尿酸結晶和糖

8、原等物質。高濃度的酒精如95%，無水酒精可保存上述兩種物質，因它們易溶于水，因此，要證明上述兩種物質的存在，就不能用含水的固定液來固定組織。2、 能在任何比例的情況下與水混合，在病理技術中，酒精是一種十分重要的試劑，它起著關鍵的作用。如果沒有酒精，將會無法完成必要的工作。如組織的脫水，切片染色前后都離不開酒精，在常規的工作中，通常都用95%的工業酒精來配成60%、70%、80%、90%等不同的濃度來使用。3、 可溶解苯類物質為染色步驟中的橋梁試劑。常規活檢等切片上的石蠟必須除去，才能進行染色，能除去石蠟的物質有苯及汽油等，常用的有苯類試劑，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在這里充擔著除去苯和連接

9、水的作用，為切片入水架起了橋梁，因此稱它為橋梁試劑。4、 能除去切片上的水份，使切片無水化。切片經染色后，由于所用的試劑都為水溶液，因此在切片上含有大量的水份，這些水份經系列梯度酒精的置換吸附后，到無水酒精中已完全無水，這樣處理對于切片的保存是有好處的，否則，切片將會褪色。5、 可用來保存標本。大體標本經福爾馬林固定后，如為了陳列保存，必須取出沖冼。然后移入75%的酒精中。如果用福爾馬林作陳列標本的固定液，則因為福爾馬林含有雜質較多，液體容易酸化，時間一長，會逐漸變為微黃*色或淡黃*色，影響美觀，影響陳列的效果。6、 可與其它試劑配成多種的混合固定液，有時為了加快固定，常采用酒精和其它試劑來配

10、成混合固定液，這種固定液在固定的同時，兼有對組織脫水的作用。應用酒精配成的混合固定液有： Carnoy氏固定液氯仿 300ml冰醋酸 100 ml95%酒精 600 ml該固定液固定組織快速，在固定的同時兼有脫水的作用。溶液中的氯仿和酒精，對組織的收縮較厲害，但應用了冰醋酸，這種現象便被中和去。 AF固定液甲醛 100 ml冰醋酸 50 ml95%酒精 850 ml這種固定液的作用與上液有相似之處，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脫水用具不能使用銅制的脫水盒，因冰醋酸跟銅離子起反應，生成醋酸銅，這種物質可沉淀于組織間，可破壞組織中的抗原，造成免疫組化檢測的失敗。應用時應多加注意。酒精也

11、有許多不足之處，它的缺點是：1、 可溶解脂類物質，凡要證明組織是否含有脂類和類脂物時，切不能用含有酒精的固定液去固定組織，也不能用石蠟切片，因為酒精可將它們溶解去，而石蠟切片組織中含有的脂類物質，則在組織脫水時被溶解去，只留下脂類或類脂物所占有的空間。2、 對組織收縮較大，不宜作單純固定液。高濃度的酒精，對組織有顯著的收縮作用，造成組織發硬易脆，難以切片等現象。因此，它不作為單純的固定液。3、 滲透力不強。當用酒精固定組織時，組織表面很快就被固定，并形成了一層蛋白膜，這層膜可阻擋固定液向里滲透，造成了中間組織固定不佳的現象。4、 可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡經酒精固定的組織，核的染色都不好

12、。5、 可脫去切片上已著染的各種顏色，切片經染色后，一是必須洗去多余的染液，二是必須脫去切片上的水。在用酒精洗切片時，必須仔細地掌握顯微鏡下觀察，還要掌握酒精的濃度，低濃底的酒精脫色力強，稍不注意，便可脫去切片上大部分的顏色。切片脫水時，要較快地通過低濃度的酒精，以免使已著染的顏色被脫去。6、 價格較貴。從經濟學的角度，應用酒精固定組織劃不來，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例標本需要100ml計，可固定50例標本，而一瓶 500ml的酒精，即使配成80%酒精，也只能固定6例標本，因此，若用酒精固定組織，其價格比用甲醛固定組織的要高8倍。（3） 冰醋酸。冰醋酸為無色透

13、明的液體，易揮發，氣味大，一打開瓶蓋，整個文章都可聞其味道，純醋酸在17時常為結晶狀，因稱為冰醋酸，在冬天使用時，可用微波爐進行解凍，再行使用，它的優點有：1、 能迅速固定染色質，助于染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均勻，對于染色質的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明礬蘇木素和伊紅時，常常需加入一定量的醋酸，以促進染色。2、 能使組織尤其是富含纖維的組織膨脹。各種固定液對組織都有收縮的作用，尤其是對富含纖維的組織。而它不但不會使組織收縮，而且還會令許多組織發生膨脹的作用。根據這個特點，用它配成許多種不同的混合固定液，以達到固定好，收縮少，易切片，效果好等目的。

14、用它配成的混合固定液有：（1） Zenker氏固定液：重鉻酸鉀 25G升汞 50G蒸餾水 1000ml冰醋酸 50ml先將重鉻酸鉀和升汞溶于水中，尢其是重鉻酸鉀，應用熱水或加溫的方法將其溶解，然后過濾貯存于帶蓋的玻璃瓶中，如暴露于空氣中，該溶液將會被慢慢氧化而便顏色加深，導致失效。臨用時，取貯存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。應用該固定液固定的組織，一般不要超過24h，取出組織，流水沖冼12小時以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必須用碘除去汞鹽的沉著。應用該固定液的組織，細胞核及細胞漿染色十分清晰，特別是要顯示骨骼肌的橫紋時，應用本液可獲得滿意的結果，但由于其

15、含有醋酸，故不能用于保存細胞顆粒，紅細胞及含鐵血黃素。（2） Flemming氏液2%酸水溶液 200ml1%鉻酸水溶液 700ml冰醋酸 100ml該液中的奧酸對脂肪組織既有固定作用，又有染色作用，對有髓神經纖維也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色，該液不適合。應用該液固定的組織，切片不能太大過厚，一般1-2毫米厚固定時間1-3天，后經水洗，保存于80%酒精中，除上述兩液體外，還有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有許多不足之處：1、 不能作為單一的固定劑。冰醋酸在實際應用中，常被作為添加劑來使用，如許多種固定液，都加入了冰醋酸。另外，在蘇木素和伊紅染液中，也常加入了冰醋酸。2

16、、 不能凝固蛋白質，不能保存白細胞顆粒，紅細胞及含血鐵黃素等。3、 價格較貴。(4) 重鉻酸鉀是一種固體，粉末狀，桔紅色，具有毒 性，較難溶解于涼水，因此在配制時用較高溫度的水來溶解，也較易發生沉淀。它的優點是：1、 能固定脂肪及類脂物。2、 為髓鞘及嗜鉻細胞優良的媒染劑。3、 可配成多種的混合固定液（1） Helly氏液重鉻酸鉀 25g升汞 50g蒸餾水 1000ml甲醛 50ml臨用時加入甲醛，因其加入后于24小時后可發生沉淀而失效，因用時應特別注意。該液是白細胞顆粒的優良固定劑，因此凡為白細胞或造血器官如骨髓，脾臟及患先天性梅毒之肝臟等，可用此液固定。此液原配方要求加入硫酸鈉，但據我們經

17、驗認為，硫酸鈉在液中對組織無任何作用，故省去。（2） Orth氏液重鉻酸鉀 20g蒸餾水 1000ml甲醛 100ml該液固定組織較緩慢，不適合于作臨床的活檢固定液，4毫米厚的組織固定時間需36-72小時，該液對于染色質的固定好，顯示清晰，但可溶解部分紅細胞和含鐵血黃素。重鉻酸鉀的不足之處有：1、 不能沉淀蛋白質，它必須和醋酸配成混合固定液，方能發揮作用，產生鉻酸，沉淀蛋白質。2、 具有毒性及產生高溫。在配制液體時，如清洗劑，當加入硫酸時，可產生很高的溫度，并揮發出刺鼻的氣體，應特別注意。3、 它不能長期固定組織，經它固定的組織應充分水洗后保存于80%酒精中。（六） 氯化汞又稱升汞，具有毒性。

18、單獨用于固定組織，對組織有較大的收縮力，故很少單獨使用。它可使組織蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，這是由于它穿透力極弱所致，因此它不適合固定較厚的組織。它常與其它的試劑配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足，使固定組織的效果非常好。應用升汞配成的固定液的優點有：1、 細胞核及細胞漿染色清晰。2、 對白細胞顆粒，造血器官如骨髓和脾臟等是優良的固定劑。3、 可配成許多混合固定液如：Zenker氏、Helly氏和Stieve氏等。它的不足之處是：1、 容易產生汞鹽沉淀。經升汞配成的混合固定液固定的組織，一是不能固定太長時間，經24h后沖水，然后保存于70%或80%的酒精中，二是在洗色前，都必須用碘

19、除去汞鹽的沉淀，以免由于汞鹽沉淀在切片上而影響對切片的觀察。2、 對組織有較大的收縮力且穿透力弱，用它不能固定過厚的組織，因穿透力弱，組織中間部分固定不好。3、 具有毒性。（五）、微波輻射固定組織。組織固定的結果是組織中的蛋白質凝固，以保存組織中原有的微細結構。常規固定用的是甲醛或酒精等。但是這些固定劑從某些方面來說其穿透力不很強，因而需要較長時間的固定，另者，臨床上的冰凍切片，有的應用快速加熱法預先固定組織，造成福爾馬林的極度揮發，污染環境，影響人們的身體健康，因此尋找其它固定組織的方法就成為研究的重點。微波輻射固定組織，就是在這種情況下產生的。微波是一種具有能量的電磁波，在其運動期間可產生瞬間熱。由于微波的快速運動，也導致了物體內部極性分子的快速運動，產生了熱量，致使組織蛋白凝固，因此，舊的叫法稱微輻射固定組織。按實際的應稱為微波輻射凝固蛋白。1、 組織固定溫度和時間的選擇。究竟微波產生的熱量需要多高，才級使蛋白凝固的呢：Masson氏等人的研究表明，700-90，對沒有固定的蛋白可發生變性。Bernard經過一系列的研究后認為，肝、腎、肺的最佳固定溫度是70，和77，因為各種組織的結構不同，成分不一，電子