1、QPCR實(shí)驗(yàn)過程一、細(xì)胞培養(yǎng)1.1不同配比的SA-GG/TMP復(fù)合水凝膠支架的制備四種水凝膠的配比按照之前的實(shí)驗(yàn)方案操作，將制備的復(fù)合墨水用0.5M的 氯化鈣交聯(lián)24h，然后利用模具將其切成直徑15mm*5mm的圓柱凝膠盤。1.2凝膠樣品的滅菌處理將制備好的凝膠樣品放到無菌的50m離心管中，然后加入無菌的生理鹽水至蓋 過樣品。然后密封，放入80C烘箱中加熱30分鐘，然后在冷卻30分鐘，如此 往復(fù)3-5次即可。1.2水凝膠樣品的接板將滅菌的樣品放入6孔板中，每個(gè)樣品三個(gè)平行樣，然后加入3-5ml培養(yǎng)基，培 養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基，10%FBS，1%雙抗，培養(yǎng)12h，去除水凝膠中的水 分和多余的

2、鈣離子。然后去除舊的培養(yǎng)基，用生理鹽水清洗 3次，按每個(gè)孔 5*104/cell細(xì)胞密度接板，接板時(shí)間分別為1、3、5、7d進(jìn)行培養(yǎng)，每?jī)商爝M(jìn)行 換液。二、PCR操作過程M-RNA的提取2.1細(xì)胞裂解將培養(yǎng)到時(shí)間的細(xì)胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml （實(shí)際 可以加入500微升即可），輕輕吹打1min左右，然后將孔板直接放到-80 C的冰 箱中至少冷凍12小時(shí)。M-RNA 提取2.2.1將冷凍的細(xì)胞裂解液解凍并且移到1.5mL的離心管中，然后按照Trizol與 氯仿（三氯甲烷）比例為5:1的比例，即取0.2ml的氯仿，上下顛倒劇烈震蕩15s, 再冰上室溫放置3分鐘。

3、然后2-8 C，12000*g離心15min。離心后樣品分為三 層：底層為紅色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中， 水相體積約為所用TRizol試劑的60%。2.2.2把水相轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相。 此處盡量洗干凈水相，以1mlTRizol為例，約為500 pl的水相，如果吸到紅色無 機(jī)相，此樣品重新進(jìn)行上部離心。然后向離心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml 的異丙醇，在冰上放置10min。2.2.3劇烈混勻后2-8 C，12000*g離心10min，離心前看不到RNA沉淀，離心 后可能也看不到，屬于正常現(xiàn)象。劇烈磕去上清

4、液。2.2.4加入75%的乙醇洗滌RNA。沒1ml TRzol加入1 ml75%乙醇。2-8 C，不超 過7500*g離心5分鐘，用力磕去上清液，然后在冰面上進(jìn)行干燥30min.2.2.5加入40似的DEP水進(jìn)行稀釋，然后混勻，離心后備用。若不立即使用可 以存放在-80 C。三、逆轉(zhuǎn)錄操作過程本逆轉(zhuǎn)錄過程使用的是Thermo Scientific的K1622試劑盒。3.1按照操作說明書預(yù)先配好逆轉(zhuǎn)錄試劑前驅(qū)液(每個(gè)樣品用量)加入引物為 Random Hexamer : 1 pl加入 5X Reaction Buffer : 4 pl加入 RiboLock RNase Inhibitor (20

5、 U/pl) : 1 pl加入 10 mM dNTP MiX : 2 pl加入 RevertAid M-MulV RT (200U/pl): 1 pl加入 Water， nulease-free : 3 pl加入 Template RNA : 8 pl1-6步驟可以多個(gè)樣品同時(shí)配好，在分裝。以上所有物質(zhì)加在一起共20 pl反應(yīng) 體系。(也可以參考試劑盒說明書)3.2逆轉(zhuǎn)錄過程及程序設(shè)計(jì)將3.1步的所有樣品加入PCR小管子中，然后渦旋震蕩30 s，再用小離心機(jī)離心30 s.然后將其放到PCR儀器中。3.3逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置第一步：在25 C保溫5 min，然后在42 C保溫60 min，最后在70

6、C反應(yīng)5min。(參照試劑盒說明書)3.4逆轉(zhuǎn)錄完成后取出樣品，如不立即使用放置在-80 C。四、RT-PCR操作過程4.1反應(yīng)體系配置具體配比按照下表(單個(gè)樣品)：試劑名稱使用量Bestar SybrGreen qPCR mastermix10 pl12.5 pl25 plPCR Forward Primer (10 pM)0.5 pl0.5 pl1 plPCR Reverse Primer (10 pM)0.5 pl0.5 pl1 plDNA模板1 pl1 pl2 plddH2O8.0 pl10.5 pl21 plTotal20 pl25 pl50 pl總反應(yīng)體系選擇為20 m，由于樣品較

7、多，為了省時(shí)間和方便添加試劑，可以分 為三步走的方法。首先配置所有樣品所需要的熒光染液，其次配置不同引物的各 自總含量，最后加入所需要的CDNA含量。（我實(shí)驗(yàn)選擇的為20 m）4.2實(shí)驗(yàn)的布板將上述三種試劑加到PCR專用孔板中，然后封膜，不能有氣泡。最后進(jìn)行渦旋 混勻30 s，然后利用孔板離心機(jī)離心30 s。具體樣品布板說明案例，以4個(gè)樣品， 每個(gè)樣品三個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣分出兩個(gè)樣。共檢測(cè)5個(gè)基因，一個(gè)內(nèi)參基因。 具體布板如下圖iSmpleGene 、.1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-3CollagenCollagenALPALPOCNOCNGAPDGA

8、PDSampleGene1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-3OPNOPNRUNRUNGAPDGAPD注意，加樣品時(shí)要非常小心，避免出錯(cuò)，且孔板要在冰上，內(nèi)參基因每個(gè)板子單 獨(dú)存在。4.3三步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序預(yù)變性95 C，2 min；PCR反應(yīng)95 C，10 s;50-60 C，30-34 s; 40 cycles72 C，30 s；溶解曲線（判斷特異性）95 C，1 min；55 C，1 min；55-98 C（10 sec/cycle 0.5 C/cycle） 86 cycles o五、儀器操作開機(jī)：先開電腦，然后開啟PCR儀器電源，帶出現(xiàn)DNA分子

9、鏈，按PCR儀器 中間按鈕立刻打開艙門。然后開啟相應(yīng)程序，逆轉(zhuǎn)錄按照程序進(jìn)行即可。PCR過程操作：打開程序后，確認(rèn)參數(shù)，然后點(diǎn)擊下一步；點(diǎn)擊create，選擇板 子，在sample位置選擇Unknow，然后選擇帶有樣品的板子（可以直接全選），最后對(duì)孔板進(jìn)行命名，分為橫向樣品名稱和縱向基因名稱，然后保存程序文件， 點(diǎn)擊運(yùn)行，保存數(shù)據(jù)文件位置，然后開始PCR擴(kuò)增程序，預(yù)計(jì)等待2-3個(gè)小時(shí)， 結(jié)束實(shí)驗(yàn)，取出樣品。六、結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，進(jìn)行PCR定量分析。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)7.1安全性主要實(shí)驗(yàn)使用的Trizol，氯仿、異丙醇、熒光染料等具有一定的揮發(fā)性和毒性，要戴 手套和口罩，以