1、結構生物學第3章核磁共振波譜學X射線晶體學和NMR波譜學測定的最大結構的比較NMR相對于晶體學的優點：NMR使用溶液樣品，因此，它不局限于那些能很好結晶的樣品。NMR可以測定不同溶液條件下的分子結構。NMR也使得研究分子的性質相當容易，例如，研究分子的柔性、分子與其它分子的反應或相互作用、分子的動態特征等。NMR技術的原理簡述 NMR技術依賴于一個外加磁場和某些原子核中的天然“小磁鐵”之間的相互作用。用NMR技術解析一個蛋白質的結構就象一件出色的偵探工作。 NMR使用的磁場大多數強度范圍在500mHz(11.7tesla)-800mHz(18.8tesla)之間。NMR磁體是超導磁體Vrian

2、公司的NMR波譜儀（見圖）強度為900mHz的Vrian公司的NMR波譜儀 NMR波譜儀連續波譜儀：60-70年代產品結構示意圖（見圖）射頻振蕩器磁場系統探測系統記錄裝置靈敏度低，已基本淘汰。脈沖傅里葉核磁譜儀：目前流行結構示意圖3.2 NMR的基本原理3.2.1 原子核的自旋與核磁共振原子核的自旋量子數II與原子核的質量數和原子序數有關核自旋量子數I與質量數和原子序數的關系I=0的原子核，如12C, 16O, 32S等，沒有自旋，不產生核磁共振現象。I0的原子核，具有自旋，可產生核磁共振現象。結構生物學中，經常研究的原子核有：1H, 13C, 15N, 31P, 它們的自旋量子數I=1/2。

3、其中，1H核在生物分子中廣泛存在，13C, 15N是稀有同位素。原子核的自旋與進動原子核都具有電荷和質量，自旋量子數I0的原子核由于能夠自旋因而還具有自旋動量或角動量。旋轉的電荷有磁場，有自旋的核就有與角動量有關的磁矩。在一個強大而均勻的外加磁場H0中，自旋核的磁矩將沿外磁場的方向進行取向。自旋核將產生進動。（見圖）核磁共振的產生原子核自旋軸在外加磁場H0中的取向是量子化的，每一個取向相當于一個自旋能級。 H0的增加不能產生自旋能級的躍遷。在與H0相垂直的方向上再施加一個比H0弱很多的附加磁場H1（稱為射頻場），當H1的頻率與原子核的進動頻率相同時，原子核從附加磁場（射頻場）吸收能量，產生自旋

4、能級的躍遷。這就是核磁共振（見圖）。核磁共振條件的理論推導在外加靜磁場H0的作用下，核自旋量子數不為零的原子核會發生能級分裂。 以1H為例，其I=1/2，在靜磁場H0中，它的進動可以有2I+1=2個方向，即有2個能級，分別為順磁場和逆磁場兩種取向。如圖所示。 b DE H0=0 a H00 能級裂分圖順磁場的1H核居較低能態，逆磁場的1H核居較高能態，二者能級差： DE = g h H0其中，g 為旋磁比，是各種核的特征常數，不同原子核的旋磁比不同。h = h/2p，h 為普朗克常數。H0為外加靜磁場的強度。 自旋核繞外磁場方向進動的頻率為： n0 = gH0/2p以上兩個方程合起來得： hn

5、0=g (h/2p) H0=DE當外加一個與靜磁場H0垂直的射頻電磁場 H1，使其頻率滿足： hn=DE=hn0時，低能態核吸收射頻場能量而躍遷到高能態，于是 n=n0=gH0/2p從以上公式可以看出：發生核磁共振的條件是：照射到自旋核上的電磁波的頻率（n）應等于自旋核的進動頻率（n0），它不僅與核的特性（g）有關，也與外磁場的強度（H0）有關。3.2.2 弛豫弛豫是高能態的自旋核釋放能量返回低能態的過程。通過弛豫過程可以獲得穩定的核磁共振信號。弛豫過程有兩種：自旋晶格弛豫，也稱縱向弛豫。以弛豫時間T1表示。自旋-自旋弛豫，也稱橫向弛豫。用弛豫時間T2描述。3.2.3 吸收的測量所有NMR波譜

6、儀都采用測定與吸收有關的正信號。可通過改變輻射電磁波的頻率（掃頻）或改變外加磁場的強度（掃場）的辦法來達到共振的目的。掃頻在技術上有困難。NMR譜儀都是保持射頻振蕩器的頻率恒定，而連續改變H0的辦法達到共振的目的。見圖。3.2.4 化學位移由電子云的屏蔽作用所引起的共振時磁場強度的移動，稱為化學位移。見圖化學位移與原子的核外電子云密度有關，后者又與原子核的化學環境有關。因此，可根據化學位移的大小，來考察原子核所處的化學環境，從而對化合物進行結構分析。為了確定化學位移的大小，選一個參比核，規定其化學位移為零。對于1H譜常以四甲基硅烷（TMS）為參比。參比核的屏蔽作用很強，在最高場有一個強的尖峰，

7、定義其化學位移為0，在其低場區（左方）的化學位移為正值。化學位移的大小用下式計算： d = (H參-H樣)/H參 x 106 = (n樣-n參)/n參 x 106 d的單位為ppm, 即10-6，大多數質子的d 在1-12之間。影響化學位移的三種效應：1) 磁各向異性效應：苯環p電子云的影響，使處于環上方和四周的氫核的化學位移有極大的差別，見圖。2）順磁效應：順磁離子如Mn2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+的存在對周圍核的化學位移影響很大。3）化學交換：與O, N, S 等原子相連的氫原子，在溶液中常常發生質子交換。在pH值變化時，這類可交換氫的化學位移的變化非常大（見圖）。氫鍵的形成，

8、使這種交換變慢，化學位移向低場變化。3.2.5 譜線強度在常規一維譜中，譜線強度與參與共振的粒子數成正比。（見圖）3.2.6 自旋耦合與自旋裂分自旋核的核磁矩通過成鍵電子影響鄰近核，引起其共振譜線增多，這種現象稱為自旋裂分，自旋核之間的相互作用稱為自旋耦合。見圖。裂分的共振譜線的能量差，稱為自旋耦合常數，以J表示。J與分子結構有關。自旋耦合與自旋裂分可提供相互作用的核的數目、類型及相對位置等結構方面的信息。3.3 多維NMR一維NMR譜是一個頻率變量的函數：S(w) ，見圖二維NMR譜是兩個頻率變量的函數：S(w1,w2), 見圖二維NMR譜的原理二維NMR譜中的對角線峰和交叉峰不同類型的二維

9、NMR波譜：二維分解譜、二維相關譜（COSY)、二維自旋回波相關譜（SECSY）、二維NOE譜（NOESY）。NOESY譜核歐沃豪斯效應波譜反應的結構信息三維NMR是三個頻率變量的函數：S(w1,w2,w3), 四維NMR是四個頻率變量的函數：S(w1,w2,w3,w4)。見圖。多維NMR譜的特點：多維譜可以把一維譜中的重疊峰在二維或三維方向展開，便于NMR譜的解析。多維譜包含了比一維譜豐富得多的信息。實驗方法靈活多樣，可以設計出多種實驗脈沖程序，從而產生各種有用的多維NMR技術。可以利用多維譜，間接地檢測到在普通NMR譜中得不到的躍遷，如多量子躍遷。3.4 多維NMR確定蛋白質溶液三維結構的

10、基本原理3.4.1 蛋白質的結構信息不同二級結構提供了具有不同結構特征的原子間距離及肽鍵二面角。a螺旋中，相鄰兩個殘基的酰胺質子(1HN)在空間距離上很接近；而前一位殘基的a質子（1Ha）與后一位殘基的酰胺質子在空間上相距甚遠；但是在b折疊中情況正相反。a螺旋肽鏈上的每一亞氨基與前面第四位殘基的羰基形成氫鍵，而反平行b折疊的兩條單鏈上相對的亞氨基與羰基之間形成氫鍵。b折疊的肽鍵二面角f遠大于a螺旋中的f。三級結構中，幾個b折疊相對集中的區域會形成一個比較剛性的疏水區，而空間位置比較靠近的幾個環可能成為比較柔性的活性部位。這些具有不同結構特征的原子核間距、肽健二面角、肽鏈的動態特性等都是多維NM

11、R所要提取的蛋白質的結構信息。3.4.2 核磁共振的波譜信息直接用于測定蛋白質溶液三維結構的主要波譜參數為：（1）化學位移：反映了空間結構及局域微環境的結構情況。（2）J耦合常數：酰胺質子與a質子之間的耦合常數3JNa與主鏈的二面角f有關，a質子與b質子之間的耦合常數3Jab與側鏈二面角c有關。（3）NOE（核歐沃豪斯效應）：NOE信號強度提供了蛋白質中氫原子對之間的距離信息。3.4.3 波譜信息與結構信息之間的對應化學位移參數可用于判斷蛋白質氨基酸序列中，a螺旋和b折疊等二級結構單元的位置。 化學位移索引法（CSI）J耦合常數可由Karplus方程直接推算出相應的主鏈和側鏈的二面角f和c:

12、NOE信號可以導出質子間距離，這是計算蛋白質溶液三維結構的最主要實驗依據。 3.5 蛋白質溶液三維結構的計算由核磁共振數據計算蛋白質溶液三維結構的流程圖3.5.1 建立核磁共振波譜數據的約束文件距離約束文件：由NOE導出的NOE距離約束 下限取1.8， 上限：強NOE，2.5-2.7, 中等NOE, 3.0-3.5，弱NOE, 5.0， 很弱NOE, 6.0由氫鍵提供的距離約束 1HN與羰基氧的距離：2.3-1.8 亞氨基15N與羰基氧的距離：3.4-2.4二面角約束文件主鏈f角和側鏈c角的約束3.5.2 獲得蛋白質三維結構的不同構象集合計算NMR三維結構的軟件：DGII, Xplor, DI

13、ANA等。具體計算蛋白質三維結構時，必須要獲得一個蛋白質構象的集合，包括40-50個蛋白質三維結構。為什么要獲得構象集合？3.5.3 蛋白質NMR結構的精確性和正確性結構的精確性： 用均方根偏差（RMSD）來衡量 目前，多維NMR方法測定結構的精度可與分辨率為2-2.5的X射線晶體結構相比較。結構的正確性：將蛋白質NMR結構與晶體結構相比較。對NMR結構進行反計算，計算可能產生的NOE交叉峰，并與NMR實驗結果相對照。近年來，發展了PROCHECK軟件來判斷NMR結構的正確性。3.6 多維NMR方法測定蛋白質溶液三維結構的實例胰島素的NMR結構研究胰島素生化性質： 胰島素的晶體結構：胰島素的N

14、MR結構： B鏈羧端去七肽(B24B30)胰島素：一種新晶型的結構胰島素,作為治療糖尿病的制劑，其結構和功能已被進行了廣泛的研究.胰島素存在締合的問題.它可以締合成二體、四體、六體甚至六體復合物.然而，在生理條件下，在濃度為納摩爾時，胰島素將解聚成單體并發揮生理功能. 因此，胰島素六聚體解聚成單體的過程就成為人體吸收注射胰島素的速控步.為了獲得速效而保持較高活性的胰島素制劑，人們設計了許多突變體或類似物，并對這些制劑的物理化學和生物化學特性進行了深入的研究.3.7 蛋白質折疊的NMR研究蛋白質折疊是很迅速的過程研究蛋白質折疊的意義研究蛋白質折疊的方法肌紅蛋白的折疊研究： The Sweetes

15、t Puzzle Getting a protein structure using NMR is a lot of fun, says Chele DeRider, a graduate student at the University of Wisconsin-Madison. Youre given all these pieces to a puzzle and you have to use a set of rules, common sense, and intuitive thinking to put the pieces together. And when you do

16、, you have a protein structure. DeRider is working at UW-Madisons national NMR facility. She is refining the structure of brazzein, a small, sweet protein. Most sweet-tasting molecules are sugars, not proteins; so brazzein is quite unusual. It also has other remarkable properties that make it attrac

17、tive as a sugar substitute. It is 2,000 times sweeter than table sugar with many fewer calories. And, unlike aspartame (NutraSweet?), it stays sweet even after 2 hours at nearly boiling temperatures. In addition to its potential impact in the multimillion-dollar market of sugar substitutes, brazzein

18、 may teach scientists how we perceive some substances as sweet. Researchers know which amino acids in brazzein are responsible for its taste changing a single one can either enhance or eliminate this flavor but they are still investigating how these amino acids react with tongue cells to trigger a s

19、ensation of sweetness. Getting a protein structure using NMR is a lot of fun .You start out with just dots on a page and you end up with a protein structure. Chele DeRider Graduate Student University of Wisconsin-Madison The plum-sized berries of this African plant contains brazzein, a small, sweet

20、protein. Photo Credit: H. M. Hadik Ming and Hellekant（1994）從西非洲熱帶野生植物 Pentadiplandra brazzeana Baill的果實中，分離出一種甜味蛋白質，命名為brazzein，它是由54個氨基酸殘基組成的單鏈多肽；甜度是蔗糖的2000倍。The fruit of Pentadiplandra brazzeana Baillon contains a small, sweet-tasting protein named brazzein. The structure of brazzein in solution was determined by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy at pH 5.2 and 22 C.Caldwell, Abildgaard, et al. 1998 ID: 2437 The brazzein fold, which contains one alpha-helix and three strands of antiparallel beta-sh