1、2 主要核酸操作技術核酸凝膠電泳技術核酸分離技術PCR技術mRNA的純化和文庫的構建基因克隆技術DNA序列分析技術突變位點的檢測主要內容遺傳標記DNA遺傳標記基因突變SNPSNP檢測技術遺傳標記遺傳標記：形態學標記、細胞學標記、生化標記、分子標記分子標記（Molecular Markers）廣義：可遺傳并可檢測的特異DNA序列、RNA或蛋白質。狹義：指DNA或RNA標記。DNA遺傳標記：指以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。DNA遺傳標記的種類（P436）：限制性片段長度多態性RFLP、簡單重復序列（SSR）、SNP。主要內容遺傳標記DNA遺傳

2、標記基因突變SNPSNP檢測技術DNA遺傳標記(P437)第一代標記： 限制性片段長度多態性（RFLP）定義：用限制性內切酶特異性切割DNA鏈，由于DNA的一個“點”上的變異所造成的能切與不能切兩種狀況，可產生不同長度的片段，可用凝膠電泳顯示多態性。優點：廣泛用于檢測已知DNA點突變，可以檢測大到幾千個堿基對DNA片段；對SNP位點檢測和基因分型均能較準確的判斷。缺點：限制性酶切過程中不可避免的遭遇到酶切不完全或DNA降解的現象，且只能檢測已知多態位點，不能罕見的或未知的突變位點；每次酶切2-3個片段，信息量有限；限制性內切酶價格較昂貴。DNA遺傳標記第二代標記：簡單重復序列（SSR）定義：真

3、核生物基因組中散布有由大量由簡單重復序列所組成的微衛星和由串聯重復短序列組成的小衛星。在小衛星或微衛星的兩端往往是相對保守的限制性內切酶位點。通過特異性引物進行PCR擴增、凝膠電泳和放射自顯影（或銀染），可以檢測到在簡單重復序列中由于重復單位數不同而造成的DNA區域的多態性。優點：與RFLP標記相比SSR檢測的多態性頻率高得多。應用：基因定位、DNA指紋分析、遺傳分析和疾病診斷等。缺點：要克隆足夠數量的SSR并進行測序，需要投入足夠的資金、人力和時間。DNA遺傳標記第三代標記：SNP 定義：基因組DNA序列中單個核苷酸的突變引起的多態性。SNP是基因組中最簡單、最常見的多態形式，具有很高的遺傳

4、穩定性。 已經在人類基因組中發現了超過1000萬個SNP位點，平均約每300bp就有一個SNP。絕大多數SNP位于非編碼區。優點：可用于檢測未知突變；可以與DNA芯片技術相結合實現自動化檢測。缺點：存在假陽性和假陰性；檢測效果受檢測條件影響。DNA遺傳標記依據DNA遺傳標記進行基因分型。P473基因型（genotype）： 人：除性染色體外，人類細胞內的染色體都有兩份，一個人所擁有的一對等位位點的類型被稱為-。 泛指：同一基因座位上多個等位位點的類型?；蚍中停╣enotyping）：確定某個個體基因型的實驗。等位位點（P66）：指染色體DNA同一位置上的每個堿基類型。主要內容遺傳標記DNA遺

5、傳標記基因突變SNPSNP檢測技術基因突變定義：由于體內外各種因素使基因特定的DNA序列的堿基組成或排列順序發生改變，導致DNA一級結構改變。根據分子機制不同分為：插入突變、缺失突變、點突變 。插入/缺失突變：DNA序列插入/缺失一個或多個核苷酸的突變。eg. 轉座子（復制型轉座子、非復制型轉座子）。基因突變點突變：指一種堿基通過化學修飾、遺傳變異、復制錯誤等引起的單一堿基的改變。分為轉換（transition）和顛換（transversion）。轉換最常見，約占SNP的2/3。主要內容遺傳標記DNA遺傳標記基因突變SNPSNP檢測技術SNP (P66)SNP廣泛存在于人類基因組中。單倍/體型

6、（haplotype）：位于染色體上某一區域的一組相關聯的SNP等位位點被稱為-。相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代（圖2-42）。34個相鄰的SNP標記構成的單體型就可有816種。SNPSNP分類：根據SNP在基因組中的分布位置，可分為： cSNP（1/5）、pSNP、rSNP。從對生物遺傳性狀的影響上看，cSNP又可分為： 同義cSNP、非同義cSNP 。SNP的應用（P69）：人類基因單體型圖的繪制SNP與疾病易感基因的相關性分析指導用藥與藥物設計動物、植物、微生物的遺產改造/育種主要內容遺傳標記DNA遺傳標記基因突變SNPSNP檢測技術SNP檢測技術（課下拓展，各技術有何

7、優缺點）限制性酶切片段長度多態性分析-RFLP單鏈構象多態性分析-SSCP 毛細管電泳變性高效液相色譜-DHPLC異源雙鏈分析-HA變性梯度凝膠電泳分析-DGGE DNA芯片技術-DNA chip 實時熒光PCR分析 直接序列測定， PCRSNP檢測技術 PCR-RFLP： 原理：先用PCR技術擴增目的基因片段，由于DNA個別堿基的突變，致使DNA分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割目的片段，所產生的片段數目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性。P427： 突變位點的檢測技術 單鏈構象多態性（SSCP）： 是一種基于單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈D

8、NA如果順序不同，甚至單個堿基不同，就會形成不同的構象，在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性后，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個堿基替換等改變時，就會出現泳動變位。 優點：簡單快速，價廉，特別適合大樣本的篩選；用SSCP法檢測小于200bp的PCR產物時，檢出率可達70-95。 缺點：存在假陽性和假陰性；檢測效果受凝膠交聯度、電泳溫度、片斷長度等條件影響，當片段大于400bp時，檢出率僅為50左右；同時該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。突變位點的檢測技術 異源雙鏈分析法（HA） 原理： 由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，

9、在非變性凝膠中電泳時，會產生與相應的同源雙鏈DNA不同的遷率。 優點：HA是SSCP法鮮為人知的姊妹篇，操作也比較簡便。 HA和SSCP兩種方法突變檢測模式不同，兩種方法可以同時在同一張凝膠上進行，二者可以相互掩蓋對方的缺點與不足，使突變檢出率提高到近100。 缺點： 只能分離雙鏈DNA；也只適合于小片段的分析。SNP檢測技術 實時熒光PCR分析 原理：使用針對核酸中不同多態性序列的熒光探針，只有與靶序列完全匹配的探針才能被相應的切割，它們在PCR擴增中被水解切割釋放出熒光信號，不同探針標記不同的熒光報道信號。 優點：操作方便簡單，實驗時間是現有方法中最短的，重復性強，適合于大量樣本的檢測；同

10、時整個實驗是在閉管的狀態下完成，可以非常有效避免污染；結果判斷借助儀器軟件自動判讀，客觀性強。缺點：只能對已知的多態性位點進行分析；需要專門的儀器、試劑。SNP檢測技術 基因芯片法 (DNA chip) ： 原理：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的已知序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與芯片特定位點上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列。 優點：快速簡單、自動化程度高，使SNPs的分析更加便捷，具有很大的發展潛力；還可用于基因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構建等。 缺點

11、：需要專門的儀器、試劑，費用較高。 直接測序測定： 是診斷未知突變基因最直接的方法，其方法是將PCR產物在自動測序儀上直接測序。 優點：操作簡便，測序時間短。 缺點：費用昂貴，僅適合于小樣本量分析。SNP檢測技術思考簡述DNA遺傳標記的種類？突變位點的檢測技術 變性梯度凝膠電泳法（DGGE） 原理：當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發生部分解鏈，電泳遷移率下降；當解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程度不同而被分離。 優點：檢測片段可達1kb，最適范圍為100bp-500bp，如果突變發在最先解鏈的DNA區域，檢

12、出率可達100；檢測結果無假陽性重復性好，準確率高，可判斷基因型；該法一經建立，操作也較便，適合于大樣本的檢測篩選。 缺點：由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測發生于高熔點區的突變。突變位點的檢測技術 變性高效液相色譜檢測（DHPLC） 原理：含有突變位點的PCR 擴增產物經變性、退火，將形成同源和異源雙鏈兩種DNA 分子。在部分變性條件下，發生錯配的異源雙鏈DNA 更易于解鏈為單鏈DNA，與DNASep 柱結合力降低，比同源雙鏈DNA 分子更易于被乙腈洗脫下來，從而與同源雙鏈DNA 分離。 優點：分離DNA分子快速，操作自動化、簡便，經濟； PCR產物無須進行純化處理即可用于突變檢測；能準確測定DNA片段大小，基因突變檢出率高（達95-100%） 。 缺點： DHPLC 檢測的靈敏性、特異性受PCR引物、PCR 體系及反應條件、檢測溫度、DNASep柱質量以及流動相梯度等多重影響。突變位點的檢測技術 蛋白截斷技術（PTT） 由于基因的非缺失型突變多可能造成翻譯過程的提前終止(突出表現為點突變形成終止密碼子)，其蛋白質產物為截短肽鏈；在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這種突變雜合子電泳