1、 ENU誘變與疾病動物模型 邵義祥人類遺傳性疾病人類群體中約20%25%的人都患有不同種類、不同程度的遺傳相關疾病。人類遺傳學研討闡明： 45%新生兒患有遺傳病，40%的低智能兒童是由遺傳要素呵斥。現代醫學研討已證明：癌癥、糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓病和精神分裂癥等常見病與遺傳要素親密相關。人類疾病動物模型的用途 由于個體遺傳背景的差別及研討資料的限制，人類遺傳疾病的深化研討必需經過動物模型實現。利用動物模型進展遺傳疾病機理的深化研討借助動物模型進展實驗性矯正或治療獲得人類遺傳病動物模型的方法自發性動物模型基因組改造和修飾基因組誘變基因驅動法與表型驅動法基因敲除與插入基因驅動 特點：

2、基因構造明確； 時間長，代價高， 效率低。誘導點突變表型驅動 特點：高通量，大規模，表型明確；隨機。小鼠是第二個完成全基因組測序的哺乳動物。人類疾病有關的遺傳基因中的90%在小鼠身上有類似的效果。小鼠容易獲得，世代間隔短，豢養、管理、實驗操作方便。 小鼠是研討人類疾病和基因功能的最為理想的方式動物，成為研討人類疾病和實驗新的治療手段的理想模型。小鼠在人類遺傳病研討中的獨特作用ENU誘變技術隨著越來越多的基因和微衛星標志被定位，突變基因的定位也會隨之變得容易，因此對小鼠進展化學誘變將越來越變得低本錢而高效益。ENUethylnitrosourea致突變技術是高通量大規模挑選新基因及發育突變技術的

3、化學誘變方法。ENU誘變是一種表型誘變技術，研討者無需知道哪個基因以及這些基因的突變類型，即可直接針對某一未知基因突變導致的特定表型或疾病進展研討 ENU的構造 N-ethyl-N-nitrosoureaENU誘變機制烷基化反響作用位點： A：N1、N3、N7 G：O6、N3、N7 C：O2、N3 T：O2、O4、N3復制、錯配、未修復導致單堿基突變screening and testing for dominant mutantsscreening and testing for recessive mutants指標分類具體指標一般狀況精神狀態、體重、體形、營養狀況神經行為步態、搖頭、轉圈

4、、震顫、活動狀況皮膚、毛發皮色、皮質、毛色、毛質、胡須、斑點、淤斑、紋理眼位置、大小、形態、顏色、角膜、虹膜、有無白內障耳耳廓位置、形態、大小、外耳道是否閉鎖尾長短、粗細、形態、顏色骨骼頭形、有無下頜、脊柱側彎、四肢長短粗細、趾數多少，趾長短、并趾口腔牙齒長短、色質、質地、角度；舌的形態、色質；有無腭裂尿、糞尿液顏色、渾濁度；糞便顏色、質地血生化血糖、膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮血常規白細胞數、紅細胞數、血紅蛋白、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量其它水腫、腦積水、腹水、脊柱裂誘變小鼠的篩查工程ENU誘變的歷史和現狀 ENU誘變開場于上個世紀70年代，初期主要運用在

5、腫瘤研討領域； 在1985年左右，開場有報道用ENU誘變雄鼠而在后代當中獲得突變系小鼠，這些突變小鼠某些酶的活性發生了改動 ；1995年以后，開場在世界范圍內得到開展并主要用于基因功能的研討；1994年King等經過誘變獲得生活規律異常的小鼠，1997年克隆了clock基因，這是闡明ENU誘變技術獨特優勢的里程碑。 國外進展德國GSF 1997-2003年期間共建立突變系小鼠267種，其中隱性突變50種，半顯性突變5種，其他均為顯性突變； 到2000年英國MRC篩查突變小鼠26000只，得到突變系小鼠500種；到目前為止，世界上ENU誘變獲得的突變系小鼠已有1000多種。 國內進展南京大學和揚

6、州大學共同承當的“國家小鼠遺傳資源庫工程，其中一項重要任務就是開展小鼠ENU誘變研討。2002-2004年資源庫共建立了具有自主知識產權的轉基因/基因剔除/化學誘變小鼠共167種，其中ENU誘變獲得的有117種，在此根底上克隆了7個突變基因。清華大學生物科學與技術系發育生物學實驗室用ENU 誘導斑馬魚突變一共得到 35 種突變體 。ENU誘變建立疾病動物模型 心血管疾病、代謝性疾病、神經系統疾病、免疫性疾病、腫瘤和出生缺陷等遺傳高度相關性疾病已成為國際上生物醫學研討的最搶手領域，相應的實驗動物學支撐，特別是相關疾病的動物模型的獲得和建立成為了實驗動物學研討的熱點。 小鼠疾病模型的開發與保種美國

7、的Jackson實驗室保管了近2500多個品系的小鼠模型；英國MRC的哺乳類遺傳學中心保管了1000多個品系的小鼠資源；意大利的歐洲小鼠突變系保管中心每年以開發150個突變系小鼠的速度建立了數百個基因工程小鼠模型；日本的熊本大學實驗動物資源開發研討中心(CARD)自2000年建立以來，已搜集保管了700多個轉基因和基因剔除小鼠模型。國家遺傳工程小鼠資源庫建立以來，已搜集、開發了264種小鼠模型品系。 模型種類包括：糖尿病模型、生殖缺陷模型、心衰模型、生長緩慢模型、骨密度異常模型、肢體發育缺陷模型、聽力異常模型、眼發育異常模型、稀毛、毛色變異模型等等。目前，世界上數以千計新的小鼠品系，模擬人類代

8、謝性疾病、本身免疫疾病、老年性疾病和神經系統疾病的動物模型正在不斷經過ENU誘變這個高通量挑選技術建立起來，進而相關基因被定位和克隆。隨著基因組方案的進展，從表型到基因克隆的方法目前也日漸成熟和簡化。 ENU在建立人類疾病動物模型和開展基因功能研討中的主要優勢在相對短的時間內誘導產生較多的突變系小鼠，獲得許多基因包括新基因的功能信息；只需得到可以遺傳某種表型的突變小鼠，就可以經過配種構成恣意控制的“超大家系；小鼠近交系有數百種，其中12個品系的微衛星數據曾經建庫且免費開放，便于對突變基因的定位及克隆；小鼠與人類病理過程的類似性，經過克隆小鼠的致病基因就可以經過同源檢索得到人類的相應疾病的基因；

9、ENU誘變無需知道哪個基因以及這些基因的何種突變導致特定的表型或疾病，這也使得發現新基因成為能夠。ENU誘導的某些突變，導致非致死的表型和改動蛋白質的部分功能，而不是完全廢棄，因此添加了研討者鑒定突變體的時機，而該突變體含有對某個基因座的豐富信息。 總之，以ENU誘變為手段，經過方式小鼠研討功能基因或人類疾病已成為一種很有前景的手段和捷徑。我們的部分研討任務突變系小鼠的獲得兩種突變小鼠突變基因的定位兩種突變小鼠模型性狀的初步研討ENU誘變、突變表型挑選及遺傳實驗技術道路ENU處置C57BL/6雄鼠3個月后與同品系母鼠配種子代小鼠G1離乳G1豢養至2月齡陽性突變小鼠G1同品系配種得G2具有親代G

10、1突變表型顯性遺傳突變基因的定位技術道路B6突變系與DBA/2交配，獲得陽性表型的F1F1回交 DBA得到F2代提取陽性表型的F2鼠 尾DNA選擇相關基因附近的微衛星優先連鎖分析計算LOD值確定連鎖在 G1 代小鼠中，針對肉眼可見的神經行為、皮膚、毛發、五官、骨骼等可見表型篩查突變個體。篩查 G1 小鼠 1650只，獲得突變小鼠 48 只。在對G1突變小鼠的遺傳實驗及突變系小鼠保種過程中，繁衍小鼠1468只，確認可以穩定遺傳的只需短尾、角膜渾濁和瞳孔異形突變小鼠等共 7 種，經卡方檢驗都屬于單基因顯性遺傳。 小 鼠 的 ENU 誘 變結果突變基因的微衛星定位體系D1Mit372、D1Mit84

11、、D1Mit273、D2Mit6、D2Mit17、D2Mit528、D3Mit268、D3Mit15、D4Mit17、D4Mit54、D5Mit352、D5Mit168、D6Mit274、D6Mit339、D7Mit246、D7Mit333、D8Mit4、D8Mit320、D9Mit325、D9Mit243、D10Mit3、D10Mit73、D11Mit163、D11Mit258、D12Mit、D12Mit17、D13Mit18、D13Mit262、D14Mit50、D14Mit205、D15Mit226、D15Mit34、D16Mit189、D16Mit100、D17Mit33、D17Mit

12、39、D18Mit52、D19Mit128、D19Mit33。 泳道1： 野生型D2品系小鼠對照；泳道 217：F2角膜渾濁小鼠的檢測結果，其中第9泳道發生重組，其他連鎖。F2代 B6角膜渾濁小鼠的微衛星檢測角膜渾濁小鼠突變基因的連鎖分析角膜渾濁小鼠突變基因的染色體定位D17Mit33與D17Mit143聚丙烯酰胺凝膠電泳結果 上圖：第4泳道發生重組 以下圖：無 1 例發生交換，12、13、14分別為D2、F1、B6 F2代 短尾小鼠的微衛星檢測短尾鼠的突變基因連鎖分析228只F2 B6D2 D2 109只短尾短尾突變基因與各微衛星的連鎖分析短尾小鼠突變基因的染色體定位角膜渾濁突變小鼠的生物學

13、特性初步研討突變品系的建立及其模型性狀研討的技術道路突變雜合子繁衍學目的生長發育血常規血液生化免疫學目的病理組化建立新的模型品系形狀行為察看角膜渾濁小鼠角膜渾濁小鼠和野生型小鼠的繁衍學目的比較 角膜渾濁小鼠后代的性別比(:)為：1.07 有角膜渾濁表型的性別比(:)為：1.44B6-Co與正常B6小鼠的臟器系數 角膜渾濁突變系與正常B6小鼠血常規的比較 角膜渾濁突變系與正常B6小鼠血液生化值的比較 角膜渾濁小鼠的角膜病理學特征1角膜渾濁小鼠的角膜病理學特征2角膜渾濁小鼠的角膜病理學特征3角膜渾濁小鼠的模型價值 我國盲人數約670萬人，角膜渾濁是僅次于白內障的主要致盲緣由約占15.4% 。人類角

14、膜病有多種類型，它們的致病緣由更有許多假說，但由于缺乏適宜的動物模型，相關研討不斷未能深化。 突變小鼠角膜中有大量鈣質和異物堆積，類似于人的斑點狀營養不良，而角膜上皮細胞和基質成纖維細胞的形狀學變化又類似于人的先天性角膜化生癥。目前尚不能確定其對應的人類角膜病類型，但遺傳要素在其中的決議作用是毫無疑問的。 對該小鼠的研討能夠會對人類角膜病的正確分型及發病機制提供科學實際根據。短尾突變小鼠的生物學特性初步研討短尾小鼠后代尾巴的不同形狀短尾小鼠的繁衍學目的 不同尾形小鼠的統計結果 各尾形所占百分比：短尾 33.8 %，中尾 9.9 %，正常尾 56.3 %。性別 (:) 比值：0.75 臟 器 系

15、 數 比 較 表血 常 規 比 較 表血 液 生 化 值 比 較 表短尾小鼠臟器系數、血常規、血液生化結果短尾小鼠的脾、腦、子宮、卵巢的臟器系數與B6有顯著差別。短尾小鼠白細胞、單核細胞顯著高于B6。 結果闡明，短尾小鼠的血紅蛋白、堿性磷酸酶、血清總蛋白、白蛋白、白蛋白、血清總膽固醇都顯著低于B6小鼠。 所獲短尾小鼠屬于縱形肢體缺陷，與人類心手綜合征holt-oram syndrome，HOS屬于同一類型，其突變基因與人類TBX5基因高度同源。心手綜合征在人類的發病率約為十萬分之一。短尾小鼠無疑是一個很好的骨骼畸形研討的動物模型。 短尾小鼠的模型價值短尾突變基因T的序列鑒定與分析短尾突變基因序

16、列鑒定與分析技術道路RT-PCR及巢式PCR抽提RNA膠回收測序測序結果比對確定突變位點基因組突變位點鑒定實 驗 方 法 8.5天小鼠胚胎的獲取RNA抽提：參照 RNAR Total RNA Isolation System ( Promega 公司 )的闡明書，在超凈任務臺內進展操作RT引物設計 逆轉錄：參照 Invitrogen 公司 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒闡明書操作 高保真PCR擴增PCR產物回收：fastgene 膠回收試劑盒回收。搜集濾液,送上海生工測序。 8.5天 B6-St 小鼠胚胎總 RNA RT-PCR擴增產物，得到了 1494 bp 的特異性產物 突變T基因RT-PCR產物電泳圖T基因、突變T基因的cDNA序列與數據庫序列的比對 巢式 PCR 驗證結果 1：正常小鼠胚胎T基因PCR電泳結果。2：短尾小鼠胚胎T基因PCR