1、第 五 章蛋白質結構與功能轉錄因子 目 錄引 言第一節 轉錄因子的結構第二節 轉錄因子的作用特點及其研究方法第三節 一些常見的植物轉錄因子 第四節 動物中的轉錄因子MyoD 第五節 熱休克轉錄因子HSF 第六節 一些轉錄因子的實例第七節 人工轉錄因子 引 言轉錄因子是細胞內一類重要的基因表達調控蛋白質，它通過與基因上游啟動子區中特異的DNA序列的相互作用，來決定被調控基因的開啟和關閉以及表達量。一個轉錄因子可調控數百個基因的表達，而一個基因的表達又可受數個轉錄因子的調控。轉錄因子水平的輕微變化，即會對細胞功能產生重大影響。 引 言轉錄因子的結構和功能缺陷，與人類的一些疾病（如腫瘤和炎癥）相關；

2、許多轉錄因子還是藥物作用的靶點。所以，轉錄因子活性的檢測對疾病的研究和藥物開發都具有非常重要的意義。人工轉錄因子的研究和開發，將在基礎研究、腫瘤等疾病的基因治療以及抗病毒治療等領域開辟一個嶄新的途徑。 第一節 轉錄因子的結構 轉錄因子（Transcription Factor，TF），也稱反式作用因子，是指那些具有同真核生物啟動子特定DNA序列結合活性的蛋白質分子，或者是具有已知DNA結合域結構特征的蛋白質分子。通過它們之間以及與其它相關蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉錄。第一節 轉錄因子的結構轉錄因子一般含有4個功能區：DNA結合域、轉錄調控域（包括激活和抑制域）、核定位信號以及寡聚化位點。

3、但是，不同的轉錄因子可能缺少某一結構域（如轉錄調控域或特異的DNA結合域）。轉錄因子通過這些功能區域，在特定的時間進入細胞核內，與啟動子順式作用元件或與其它轉錄因子的功能區域相互作用，來調控基因的轉錄及表達。第一節 轉錄因子的結構一、轉錄因子常見的基本結構二、轉錄因子的種類一、轉錄因子常見的基本結構 轉錄因子有一個共同的特性，即由不同的功能結構域組成可調變的蛋白質結構，而這些功能結構域從蛋白總體分離出來后，無論是單獨作用還是與其它來源的蛋白連接后，仍保持原有的功能。一、轉錄因子常見的基本結構1、DNA結合域2、轉錄調控域3、核定位信號4、寡聚化位點1、DNA結合域DNA結合域，是指轉錄因子識別

4、順式作用元件，并與之結合的一段氨基酸序列。通常由60100個氨基酸殘基組成。在相同類型的轉錄因子中，DNA結合域氨基酸序列較為保守。DNA與蛋白質之間的相互識別，取決于DNA堿基對的外緣和氨基酸側鏈之間的相互作用。在DNA雙鏈中，互補堿基的外緣暴露于雙螺旋結構外側，形成具有氫鍵供體和氫鍵受體的復雜結構。這種結構可以被氨基酸側鏈所識別，并且是DNA-蛋白質之間進行特異性識別所必需的。1、DNA結合域DNA結合域帶共性的結構主要有以下幾種： HTH和HLH結構：-螺旋可與DNA的溝槽相互作用。 鋅指結構：見于TF IIIA和類固醇激素受體中。鋅指上的堿性氨基酸與DNA的磷酸基有相互作用。鋅指結構家

5、族的蛋白又可分為鋅指、鋅紐、鋅簇三類。 幾種鋅指結構 1、DNA結合域 Leu-拉鏈結構：見于真核生物DNA結合蛋白的C端。兩條肽鏈呈鉗狀與DNA相結合；拉鏈兩側的堿性氨基酸與DNA的磷酸基有相互作用。有的轉錄因子含有多個DNA結合結構域。轉錄因子DNA結合域的特定氨基酸序列，決定了它們與順式作用元件識別及結合的特異性。 Leu-拉鏈結構與DNA結合2、轉錄調控域同一家族轉錄因子的主要區別在于：它們的轉錄調控結構域各不相同。轉錄調控結構域可以分為兩種： 轉錄激活域（transcription activation domain） 轉錄抑制域（transcription repression d

6、omain）它們決定了轉錄因子功能的差異。 2、轉錄調控域該結構域常見有4種特征類型： 富含酸性氨基酸； 富含脯氨酸； 富含谷氨酰胺； 富含絲氨酸/蘇氨酸。有的轉錄因子可同時具有幾個激活結構域，這些結構域可能是轉錄因子與其它蛋白質接觸作用的區域。 3、核定位信號核定位信號（NLS），是轉錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的核定位區域，轉錄因子進入細胞核的過程受該區域的調控。不同轉錄因子的核定位信號序列、所處的位置、數量有所不同。有些轉錄因子進入細胞核的過程，是通過1至數個核定位信號進行的；而沒有NLS區的轉錄因子則借助于與具有NLS區的轉錄因子相互作用進入細胞核。4、寡聚化位點寡聚化位點，是不同轉

7、錄因子借以發生相互作用的功能區域。它們的氨基酸序列很保守，大多與DNA結合域相連，并形成一定的空間構象。不同轉錄因子通過寡聚化位點發生相互作用，形成異源或同源寡聚化物，以影響其DNA結合特異性、結合能力以及在細胞核內的定位。 二、轉錄因子的種類 各種不同的轉錄因子，依據它們所具有的特殊的DNA結合模式而分成不同的大家族。因為許多轉錄因子可形成同二聚體和異二聚體，所以各大家族據此可進一步細分成亞家族。正是由于許多轉錄因子能異二聚體化，從而極大地增加了轉錄調節的多樣性和特異性。 二、轉錄因子的種類在真核生物中，基因的轉錄起始涉及兩類轉錄因子： 一般性轉錄因子（general transcripti

8、on factor，非特異性轉錄因子或基本轉錄因子）：是RNA聚合酶結合啟動子所必需的一組因子，為所有mRNA轉錄啟動共有。它們的主要作用是，在啟動子的TATA-box區與RNA聚合酶組裝，形成轉錄的起始復合物，激活所有基因的轉錄。二、轉錄因子的種類真核生物中存在的三種RNA聚合酶，分別有相應的轉錄因子，即TF I、TF II、TF III。其中，TF II有幾個亞類：TF II A、B、D、E、F、G/J、H和I；TF II D是唯一能識別啟動子TATA-box，并與之結合的轉錄因子；而TF II B則可促進聚合酶II與啟動子的結合。 二、轉錄因子的種類 特異性轉錄因子（specific t

9、ranscription factor）：也是一種DNA結合蛋白，是能夠選擇性調控某種或某些基因轉錄表達的蛋白質因子。它和DNA上其它調節元件結合，只能激活特定的基因轉錄，為個別基因轉錄所必需，決定該基因的時間、空間特異性表達。第二節 轉錄因子的作用特點及其研究方法 一、轉錄因子的作用特點二、轉錄因子的研究方法 轉錄因子作用示意圖一、轉錄因子的作用特點 同一DNA順式作用元件可被不同的轉錄因子所識別； 同一轉錄因子也可識別不同的DNA順式作用元件； TF與TF之間存在相互作用； 當TF與TF、TF與DNA 結合時，可導致構象改變； TF在合成過程中，有較大的可變性和可塑性。二、轉錄因子的研究方

10、法根據轉錄因子的作用特點，可采取不同方式來研究各種轉錄因子。DNA芯片技術，也稱DNA微列陣技術（DNA microarray），是研究轉錄因子的方法之一。它是將不同序列的核酸樣品高密度排列在載體上，然后將各種可能的轉錄因子與之進行結合，通過分析結合信號來研究二者相互作用的特點。 二、轉錄因子的研究方法與傳統的“單基因” 技術比較，微陣列具有無可比擬的優勢。該技術能在同一時間內對數千個基因表達譜的差異進行平行分析，從而可以對基因進行大量、快速、平行研究，實現高通量篩選；而且，還可得出其所篩選出的特異性配基的相對親和力信息。 轉錄因子的DNA芯片技術研究第三節 一些常見的植物轉錄因子 一、植物中

11、常用的特異性轉錄因子二、植物中特有的轉錄因子Dof一、植物中常用的特異性轉錄因子不同逆境相關基因的啟動子往往含有相同的順式作用元件，顯示可以受到相同轉錄因子的調控，即轉錄調控基因可以通過調控一系列與逆境相關的功能基因的表達，從而明顯提高植物對逆境的抵抗能力。因此，應用轉錄因子提高植物的抗逆性研究己經成為當今的研究熱點。一、植物中常用的特異性轉錄因子 1、bZIP類轉錄因子2、ERF類轉錄因子3、WRKY類轉錄因子4、MYB類轉錄因子1、bZIP類轉錄因子堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉錄因子是普遍存在于動、植物及微生物中的一類轉錄因子。bZIP類轉錄因子，可識別含核心序列ACGT的順式作用元件，如

12、CACGTG（G盒）、GACGTC（C盒）、TACGTA（A盒）等。一些受光或脫落酸（ABA）誘導的基因的啟動子區都含有這些元件。1、bZIP類轉錄因子G盒元件普遍存在于受ABA、生長素、茉莉酸、水楊酸誘導的基因中，這證明它與植物的抗逆性有關。G盒元件還是光誘導基因中最常見的順式作用元件之一，能激活光誘導基因的轉錄。2、ERF類轉錄因子乙烯應答元件結合因子（ERF），最先是從煙草中，作為GCC-box結合蛋白分離出來的。ERF蛋白具有一個高度保守的含58或59個氨基酸的DNA結合域。在擬南芥基因組中，有124個ERF 基因，參與對低溫、干旱、病原體及其誘發因子的反應，構成一個轉錄因子基因家族。

13、這類基因家族在植物的生長、發育、抗病、抗脅迫以及次生代謝等方面起著非常重要的作用。該家族現只在高等植物中被發現。3、WRKY類轉錄因子WRKY是近年來發現的又一種植物特有的轉錄調節因子。這類蛋白含有12個保守的60個氨基酸的WRKY結構域。幾乎所有WRKY轉錄因子對 （T）（T）TGACC（C/T）（即W框）都有結合特性。從歐芹中分離到的Pc WRKY I 基因的啟動子，即含有3個TTGACC/T核心序列的類W框，這說明WRKY蛋白具有自我調節能力。3、WRKY類轉錄因子許多WRKY蛋白在病原體侵染反應和其它應激反應中起作用。有的WRKY蛋白在調控衰老中起作用，它們高水平的超表達可引起生長遲緩

14、和其它抗性相關基因的表達。4、MYB類轉錄因子MYB類轉錄因子家族，是指含有MYB結構域的一類轉錄因子。MYB結構域是一段約51或52個氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。MYB蛋白的共同特征是：N-端高度保守，通常由2個MYB結構域（R2、R3）或3個MYB結構域（R1、R2、R3）構成。4、MYB類轉錄因子絕大多數的MYB轉錄因子可以起到轉錄激活的作用，但有的MYB轉錄因子也可以降低目的基因的表達。在擬南芥和玉米中都存在著大量的MYB轉錄因子，它們是植物轉錄因子中最大的家族之一，并在轉錄調節中起著多方面的重要作用。4、MYB類轉錄因子從轉錄層面上來說，同一種脅迫可能會同

15、時激活多條途徑（多個轉錄因子參與）；而同一轉錄因子也可能會由多種脅迫激活。從功能基因層面上來說，同一轉錄因子可能會同時激活多種功能基因；而同一功能基因也可能由多個轉錄因子調控，因為它的啟動子區域可能存在不止一種順式作用元件。 二、植物中特有的轉錄因子Dof Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物所特有的一類轉錄因子。Dof類轉錄因子在植物中發揮著多種功能。其N末端是獨特和保守的，富含Cys殘基的單鋅指Dof結構域，是既與DNA又與蛋白相互作用的雙重功能域，識別 的核心序列是AAAG；其C末端氨基酸序列較為多變，是Dof蛋白的特異轉錄調控結構域。擬南芥和水稻的

16、Dof轉錄因子家族為Aa、Bb、Cc、Dd這4個同源基因群，而同類群間可能有相似或相反的功能。二、植物中特有的轉錄因子Dof1、Dof蛋白的結構2、與Dof蛋白結合的DNA序列特異性 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用4、Dof蛋白的生物學功能 1、Dof 蛋白的結構Dof蛋白僅在其N末端有1個52個氨基酸組成的高度保守的Dof結構域，在此結構域中CX2CX21CX2C基序形成一個單鋅指結構，在此單鋅指結構中，1個Zn2+與4個Cys殘基共價配位結合。Zn2+和Cys殘基對Dof蛋白的活性是必需的，二價離子螯合劑的存在以及對Cys殘基的任何替換都會使Dof蛋白失活。1、Dof 蛋白的結構不同D

17、of蛋白，在與DNA結合的Dof結構域中，除了單鋅指與DNA結合外，在鋅指旁邊C側鏈狀結構中，某些特定氨基酸也參與和DNA的結合，這些細微的特征有可能決定和不同的DNA序列的結合。Dof蛋白的轉錄調控結構域位于C末端，如玉米的ZmDof1的轉錄激活結構域是位于C末端的44個氨基酸殘基；其它Dof蛋白，如擬南芥的OBP1、OBP2、OBP3和大麥的BPBF在C末端也有轉錄激活結構域。1、Dof 蛋白的結構轉錄調控結構域的氨基酸序列較為多變，不具保守性，這與Dof蛋白功能的多樣性是一致的。綜上所述，Dof蛋白通常包含2個主要的結構域：一個位于N末端的保守的DNA結合結構域和一個位于C末端的調控結構

18、域。在這兩個結構域之間通常還有1個Ser骨架，可能作為分子鉸鏈，連接這兩個結構域。Dof蛋白的基本結構 2、與Dof蛋白結合的DNA序列特異性Dof蛋白以其Dof結構域與不同的植物特異性基因的啟動子相互作用。在每一個Dof蛋白的DNA結合序列中，均存在AAAG序列（只有個別例外，如南瓜中的Dof蛋白AOBP識別AGTA序列），而且在這個序列上的任何單個突變都會取消Dof蛋白與DNA結合的特性，這說明AAAG序列是Dof蛋白識別的核心序列。2、與Dof蛋白結合的DNA序列特異性而AAAG的數目對Dof與DNA的結合能力也有影響：2個串聯重復的AAAG基序表現出的DNA親和 力比1個AAAG基序約

19、高2倍。外側序列對Dof-DNA相互作用也有影響，不過，是有限的，僅在某種程度上影響二者相互作用。其它轉錄因子與之發生蛋白-蛋白之間的相互作用，以及轉錄后的修飾對Dof蛋白與其靶序列的特異性相互作用也有影響。 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用Dof結構域是一個雙功能的結構域，它不僅介導與DNA的結合，而且還介導蛋白與蛋白之間的相互作用。這種作用通常影響與DNA的結合，有時Dof與其它轉錄因子通過與DNA的協同結合作用共同調節基因的轉錄。3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用Dof蛋白與高遷移性染色質蛋白（chromatin-associated high mobility group，HMG）之

20、間有相互作用，不同HMG蛋白提高Dof蛋白的DNA結合性的程度不同。不同家族的轉錄因子進行的復合調控，可能是對轉錄因子在體外與體內作用有差異的一個比較合理的解釋。Dof結構域的雙重功能可能有助于其在體內對靶基因的正確激活或抑制。3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用除Dof結構域外，Dof蛋白的C端區域也是與其它蛋白作用的區域。與保守的Dof結構域不同，C末端變化多樣，它很可能通過與不同類型調控蛋白或物質的反應，受不同途徑信號的調控而激活或抑制基因的轉錄。這種多樣性可能是Dof功能多樣性的基礎之一。 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用玉米Dof1、擬南芥OBP13和大麥PBF的轉錄激活區域定位于每

21、個蛋白多變的C末端。玉米Dof1的轉錄激活區不僅作用于植物細胞，也作用于動物和酵母細胞。大麥PBF和SAD（scutellum and aleurone-expressed Dof）還與動、植物中均存在的MYB轉錄因子相互作用。MYB結合位點和Dof結合位點對MYB蛋白激活靶基因的轉錄都是必需的，這表明靶基因轉錄調控受多個調控因子協同作用。 3、Dof蛋白與其它蛋白的相互作用作為轉錄因子，Dof蛋白不僅通過Dof結構域直接與DNA結合，并在此區域與其它調控因子或蛋白結合，通過調節與DNA結合而調控基因的轉錄，而且與其它許多轉錄因子一樣，在C末端專門有與其它蛋白或因子結合激活或抑制基因轉錄的區域

22、。這些不同位點調控的組合可能是Dof蛋白功能多樣性的結構基礎。4、Dof蛋白的生物學功能在多種植物特異性基因的啟動子中都發現有Dof蛋白結合元件，這表明Dof蛋白有多種功能，參與植物多種生命活動的調控。第四節 動物中的轉錄因子MyoD 轉錄因子家族，通常是由各種同源和異源的二聚體亞基組成。它們在細胞內具有不同的調控作用，這取決于細胞接受的刺激和信號因子的存在。因此，可通過檢測在細胞內調控作用中含有哪些轉錄因子家族成員，以幫助鑒定和提供潛在的基因有用信息。第四節 動物中的轉錄因子MyoDmyoD 基因的全稱是myogenic differentiation antigen（成肌分化抗原），是以其

23、命名的一個調控成肌細胞分化的轉錄因子家族的重要成員。該家族成員的時空表達具有特異性，但是都參與成肌細胞的分化和特化過程，是對于肌肉組織發育具有重要作用的轉錄因子家族。單向分化（肌細胞分化涉及轉錄因子的次序表達）示意圖 第四節 動物中的轉錄因子MyoD通過結構比對的方法，確定了人的MyoD家族的4個成員：MyoD、Myogenin （Myf4）、 Myf5和Mrf4。它們在結構上類似的區域就是與DNA結合并且激活成肌作用的區域。從體節細胞分化為成肌細胞時，需MyoD和Myf5兩種蛋白，而從成肌細胞合并發育分化為成熟的骨骼肌細胞則依賴于myogenin 基因。細胞融合前只有myoD 及myf5基因

24、表達，myogenin 基因只有在細胞融合發生后，才能表達，且受myoD 及myf5表達的誘導。 myoD 家族基因敲除對小鼠骨骼肌細胞分化發育的影響 第四節 動物中的轉錄因子MyoDMyoD家族在肌肉細胞系的分化特化過程中有重要作用，它們只表達在骨骼肌細胞和它們的前體細胞中，非肌肉細胞系中MyoD家族成員的表達會被其它特異性的基因抑制。但myoD 基因可以激活自身的表達，這對于保持成肌作用具有重要意義。 第四節 動物中的轉錄因子MyoD一、myoD 基因的定位二、myoD 基因的結構與功能一、MyoD基因的定位 利用分子雜交的方法，將myoD 基因定位于人類的第11號染色體上，還利用小鼠的探

25、針做了檢測并顯示出相同的結果。進一步研究將其定位在染色體11p15.4p15.1區域，但是利用熒光原位雜交（FISH ）的方法定位，結果是其位于11p14.3區域。 在不同生物中的這些表達和定位的結果顯示了，標志性基因都包含myoD ，這為研究myoD 基因的表達和具體功能提供了方法和方向。 小鼠11.5天的胚胎圖（示myoD 基因的表達分布） 熒光原位雜交定位人類myoD 基因示意圖 非洲爪蟾發育尾芽時期X-myoD 的表達 原位雜交顯示myoD在斑馬魚中的表達 免疫染色和DAPI染色共定位二、myoD 基因的結構與功能MyoD家族蛋白結構上的最大特點是含有b-HLH結構域。其中，Basic

26、結構域是HLH螺旋結構的延伸，也是這一家族蛋白與DNA相互作用的區域；而HLH螺旋結構則是與許多其它因子相互作用的位點，是調控的重要區域。 MyoD的b-HLH結構域 二、myoD 基因的結構與功能在哺乳動物中，MyoD能誘導肌細胞特異性基因轉錄，與肌肉發育有緊密的相關性。MyoD家族蛋白在形成同源及異源二聚體后，可與基因調控區中的CANNTG序列（又稱E-box）相結合，通過DNA-protein相互作用，MyoD構象發生改變，從而誘導肌細胞特異性的基因轉錄。 MyoD的作用過程 形成轉錄起始復合體，促進靶基因的轉錄 二、myoD 基因的結構與功能前圖表明：MyoD及其它MRF（muscle

27、-related factor）與其它非組織特異性bHLH蛋白（如E2A）結合而成的異源二聚體，以及MEF （muscle-enhancer factor）同源二聚體，與調控元件E-box或MEF-box，或同時與二者結合形成轉錄起始復合體，促進靶基因的轉錄。 總之，myoD 基因家族是一個與肌肉發育分化特化過程密切相關的轉錄因子，它可以被多個信號通路調控，對于維持體內肌肉的生成和替代起著關鍵的作用。肌細胞分化與細胞周期 分裂中的成肌細胞不能分化 分化中的肌細胞不能分裂 第五節 熱休克轉錄因子HSF 熱休克基因表達的調節主要發生在轉錄水平，熱休克基因的表達受到一個重復DNA序列的可逆的順式負調

28、節（negative cis-acting control）。熱休克轉錄因子（ HSF，熱激蛋白）的結構和功能在進化中較少變異，因此具有廣泛的同源性，在真菌、果蠅、雞、人類等真核生物中都存在。熱休克蛋白（HSP）還可作為“分子伴侶”（molecular chaperone）參與其它蛋白的折疊。 第五節 熱休克轉錄因子HSF一、HSF的類別與功能二、HSF的結構三、HSF活化及作用過程一、HSF的類別與功能 從HSF發現到現在，隨著研究的深入及新技術的采用，在不同生物體內，發現了越來越多的HSF及其基因，例如：人體內有hHSF1、2、4，雞體內有cHSF1、2、3，小鼠體內有mHSF1、2；西紅

29、柿有3種HSF；而只有一種HSF的生物也 很多。HSF在熱應激反應中的主要功能是：在熱休克基因的表達過程中，與相應啟動子結合，啟動基因的轉錄過程，最終促進HSP的表達。 一、HSF的類別與功能但在高等真核生物（如脊椎動物及哺乳動物）體內，不同種類的HSF，雖然結構上很相似，但功能上卻出現了不同程度的差異，在不同的應激狀態下起作用。其中，只有HSF1是最有代表性、最具有完全意義的HSF，能在熱休克、氧化應激、重金屬應激等狀態下起作用，而其它HSF則不然，如：HSF2。HSF2對熱刺激信號耐受，能在精子形成和胚胎發育中起作用；它對代表生長、發育、分化的信號更為敏感。一、HSF的類別與功能cHSF3

30、雖然也對熱刺激信號起反應，但其活化閾值卻高于cHSF1，在較高溫度時仍能保持活性。而hHSF4似乎是一個通過減少熱休克蛋白效應元件（HSE）結合位點，而專門起抑制作用的HSF，其生物學意義在于控制熱應激反應的動態平衡。 二、HSF的結構 雖然從不同生物體內分離出來的HSF分子種類和大小各有不同（如從酵母菌、果蠅、人類體內分離出來的HSF，其分子量分別為：150、110、80 ku），但其結構卻極為相似，共同具有一個極為保守的核心區域DNA結合區域（DNA binding domain）和三聚區域（trimerization domain）。 二、HSF的結構DNA結合區域，靠近HSF的N末端，

31、位于HSF最保守的區域中。其晶體結構與溶解狀態的結構比較一致，都具有DNA結合蛋白特征性的helix-turn-helix motif，由3個螺旋（H1、H2和H3）和4個反向平行的片層（-sheet）（1、2、3和4）組成，其排列順序如下： 二、HSF的結構DNA結合區域通過螺旋-轉角-螺旋結構形成一個緊密的球形結構。但與其它DNA結合蛋白（如：CAP）的DNA結合區域不同的是：HSF的DNA結合區域有一個螺旋凸起（-helical bulge）；一個由脯氨酸誘導的扭結（proline-induced kink），該扭結使H2發生明顯扭曲；在H2和H3之間有一段57個氨基酸的間隔。 二、HS

32、F的結構對于非植物性來源的HSF，在3和4之間還有一個暴露的、易曲的可溶性環狀結構。HSF的DNA結合區域，與DNA結合的部位起始于H1的N端后數個氨基酸處；終止位置對于不同的HSF并不一致，但多數終止位置位于4末端 之后的16個氨基酸處。二、HSF的結構這16個氨基酸的功能，一方面是通過與疏水核心的相互作用，在空間結構上封閉DNA結構區域的一個側面；另一方面，是使HSF三聚體中各HSF單體的DNA結合區域相互協調，以獲得對熱休克元件（HSE）的高親和力。 DNA通過主溝與HSF結合，具體結合位點就是DNA上的HSE。HSF能識別HSE上特異性的“-nGAAn-”結構，HSF單體與“-nGAA

33、n-”結構以1:1的比例結合。熱激蛋白調控的基因表達二、HSF的結構HSE上“-nGAAn-”結構的數目，對HSF與HSE親和性有很大的影響。一個完整的HSE結構上通常有3個“-nGAAn-”結構，而完整的HSF也是以三聚體的形式與HSE結合，這樣的結合具有最大的親和力。若HSE上只有2個“-nGAAn-”結構，兩者的親和力只能達到中等水平。許多物理學與遺傳學證據都表明，DNA結合區域螺旋-轉角-螺旋結構上的第3個螺旋（H3）起識別HSE上“-nGAAn-”結構的作用。 二、HSF的結構H3通過其極性及陽性氨基酸殘基，在溶液中形成一個典型的雙岐性螺旋（Amphipathic helix），與D

34、NA通過離子鍵相互作用。當HSF活化時，相互間需通過三聚區域結合形成HSF三聚體。相對于DNA結合區域，三聚區域位于HSF中部。三聚區域的特征性結構是3個疏水七氨基酸重復序列（Hydrophobic heptad repeat array）。 二、HSF的結構這3個序列由數目不等的七氨基酸重復（Heptad repeat）構成。第1個序列較長，有56個七氨基酸重復；第2和第3個序列較短，且基本上重疊在一起，前后只差一個氨基酸；第1個序列與 后兩個序列之間由QQQ基元（QQQ motif）隔開。 每個七氨基酸重復單位的第一和第四個疏水氨基酸殘基，是螺旋型卷曲螺旋結構（Helical coiled

35、-coil structure）所特有的，可用于形成亮氨酸拉鏈（leucine zipper）。二、HSF的結構但具有亮氨酸拉鏈的蛋白，通常形成同二聚體或異二聚體，像HSF這樣形成三聚體的非常少見。三聚體的空間結構比預期的緊密。因此，HSF三聚區域的空間結構并非如所想像的是一個簡單的連續卷曲-螺旋（coiled-coil）。其構型可能與流感病毒血凝素的三聚區域相似：較長的七氨基酸重復序列內部相互作用，形成一個三鏈螺旋型卷曲螺旋（triple-stranded -helical coiled-coil），其外部由較短的七氨基酸重復序列形成一個螺旋，以穩定其結構。 二、HSF的結構除DNA結合區域

36、與三聚區域外，促進熱休克基因轉錄的活化區域（activator domain）也是HSF較重要的結構之一。但活化區域與上述兩個結構區域不同，其物種間的同源性不高，位置也不很確定。通過遺傳學方法，可將Kl HSF（Kluyveromyces lactis HSF）的C末端活化子（carboxy-terminal activator，CTA）定位于C末端的32個氨基酸殘基內；而Sc HSF（Saccharomyces cerevisiae HSF）的CTA則散布于180個氨基酸殘基內。二、HSF的結構N-末端活化子（N-terminal activator，NTA）的具體位置尚未確定。高等真核生物

37、的活化區域可能位于C末端的某些區域。例如：hHSF1有2個獨立的活化區域，位于靠C端1/3處，受所謂中心調節區域（central regulatory domain）調節；該調節區域位于三聚區域與該活化區域之間，對熱刺激信號敏感。CE2是位于HSF的C末端的一小段序列，也是HSF最保守的序列之一，能夠抑制HSF的轉錄促進功能。但CE2僅見于酵母菌，高等生物缺乏這一結構。 三、HSF活化及作用過程 多種內、外界刺激因素均可活化HSF，其中以熱休克為最典型、最傳統的活化方式。細胞受到高溫刺激后，促進HSF活化。 HSF從無活性到有活性，通過以下3個步驟被活化：（1）HSF由單體形式變成磷酸化的三聚

38、體形式而被激活；（2）三聚體與HSE結合；（3）轉錄活化區域開放，促進HSP轉錄。 （1）HSF由單體形式變成磷酸化的三聚體形式而被激活在無應激狀態下，HSF以無活性的單體形式存在。單體是在常溫時，HSF內1區與C末端4區形成亮氨酸拉鏈維系高級結構。當細胞處于應激狀態時，細胞內環境發生變化，解除了對HSF的活性抑制，促進HSF由單體向三聚體轉換。HSF之間通過三聚區域結合，具體位點是三聚區域的3個七氨基酸重復序列，主要依賴三個單體 彼此的1區、2區、3區，形成單體之間的亮氨酸拉鏈。 （1）HSF由單體形式變成磷酸化的三聚體形式而被激活在無應激時，這3個序列在HSF內部形成穩定的卷曲螺旋結構，以

39、維持其單體狀態；在應激時，在不明機制的作用下，卷曲螺旋結構打開，相鄰HSF的七氨基酸重復序列之間相互作用，形成分子間的卷曲螺旋。在此結構幫助下，每3個HSF單體結合在一起，形成一個三聚體。 （2）三聚體與HSE結合HSF單體基本上不能結合HSE，只有形成三聚體后，兩者的親和性才大大增強。HSF與HSE親和力的大小不僅與HSE內的“-nGAAn-”數目有關，而且HSF三聚體之間的協作也能極大地促進兩者的結合。在熱休克基因轉錄起點上游數百bp處，往往有多個拷貝的HSE；HSF與2個緊鄰HSE的親和力比與單個HSE的親和力高出近2千倍。 （3）轉錄活化區域開放，促進HSP轉錄對Kluyveromyc

40、es lactis 等較低等的真核生物而言，HSF與HSE的結合過程與HSF促進轉錄過程是偶聯的；兩者結合后，隨HSF上活化區域的暴露，即可促進熱休克基因的轉錄。但高等真核生物的情況比較復雜，雖然通常兩者也能偶聯，但在一定的條件下，HSF與HSE結合并不能促進熱休克基因的轉錄，即這兩者是兩個相互獨立而非偶合的過程。這說明：在高等真核生物體內，對HSF的DNA結合功能和轉錄促進功能的調節各有其機制。 HSF活化后，促進HSP轉錄示意圖 （3）轉錄活化區域開放，促進HSP轉錄在通常情況下，兩者互相協調；但是在一定條件下，可將兩者分開。與HSF活化緊密相關的還有HSF的定位及HSF的磷酸化等過程。

41、生物體內、外多種調節因素對HSF的調節基本上是圍繞這3個HSF在熱應激反應中發揮功能的關鍵步驟進行的。HSF除了在熱應激反應中能調節HSP的合成外，有的還能在某些生理和病理狀態下發揮作用。第六節 一些轉錄因子的實例 一、腸特異性轉錄因子CDX2二、轉錄因子Blimp-1三、FOXP3四、免疫相關轉錄因子GATA-3五、核轉錄因子B（NF-B）六、Spl七、PAX5一、腸特異性轉錄因子CDX2 CDX2是腸表皮細胞早期分化和特性維系的關鍵轉錄因子，不僅控制著胚胎的發育和分化，而且在成人組織的分化和增殖中起著重要作用。而作為腸型特異性基因的表達產物，CDX2表達于正常腸道組織，在小腸和盲腸中表達較

42、高，在遠端結腸中表達降低，在腸道腫瘤組織中表達則明顯下降。CDX2具有抑制結腸癌的功能，過表達明顯抑制結腸生長，而促進其分化。 一、腸特異性轉錄因子CDX2CDX2通過核移位和翻譯后磷酸化水平修飾，調節其轉錄活性，發揮對靶基因的調控作用。腸型胃腺癌的發生，與腸特異性轉錄因子的轉錄調控失常密切相關。 CDX2蛋白在不同胃粘膜病變中的表達（超敏SP法） ABCD一、腸特異性轉錄因子CDX2CDX2蛋白主要表達于胃粘膜腸化生（intestinal metaplasia）灶中的杯狀細胞及柱狀上皮細胞（前圖A），以及腸型胃癌細胞的細胞核（前圖B），呈淺棕黃色顆粒樣著色，近核周的胞漿中也有少量細顆粒樣著色

43、；在部分彌漫型胃癌細胞胞漿及胞核中也有弱到中等程度的著色（前圖C）；在少部分CAG病例的胃腺凹上皮中也有棕黃色粗大顆粒樣胞漿著色（前圖D）。 二、轉錄因子Blimp-1 轉錄因子Blimp-1（B lymphocyte induced maturation protein 1）（人的蛋白被稱為PRDI-BF1）是具有5個鋅指結構的蛋白，它可誘導成熟B淋巴細胞發育為漿細胞并分泌抗體，因此被稱為“B淋巴細胞終極分化的主調控子”。 Blimp-1至少通過3個基因表達程序誘導了漿細胞發育：（1）Blimp-1阻斷B細胞增生程序，主要包括直接抑制c-myc，下調E2F-1及抗凋亡基因A1，上調cdk 抑

44、制子p18和p21；（2）Blimp-1上調促使Ig分泌的基因，包括重鏈及輕鏈基因、J鏈、XBP-1、CHOP、hsp70等；（3）Blimp-1下調在形成生發中心和B細胞激活中起重要作用的基因，包括Pax-5、Bcl-6、AID、BCR 信號傳導相關基因、CD72、CXCR5等。 二、轉錄因子Blimp-1Blimp-1在生發中心B細胞和邊緣區B細胞分化為漿細胞的過程中發揮了關鍵的作用，它在漿細胞發育中的作用是不可缺少的。多發性骨髓瘤病人中B細胞表達Blimp-1，而 正常人B細胞不表達Blimp-1。未成熟Blimp-1的表達加上Pax-5表達的缺失，使B細胞過早增生和分化，可能與多發性骨

45、髓瘤的發生相關。三、FOXP3 FOXP3是FOX（forkhead box）家族（叉頭樣轉錄因子家族）轉錄因子中的一員。FOX轉錄因子最初在果蠅中被發現，如今FOX轉錄因子家族具有100多個成員。FOX轉錄因子在免疫調節的各個方面（包括從淋巴細胞的存活到胸腺的發育）發揮著重要作用。FOXP3主要是一個與調節性T細胞的生成及功能有關的轉錄因子。 三、FOXP3在小鼠體內，僅表達于CD4+CD25+T細胞，在人類則不僅可表達于CD4+CD25+T細胞，還可表達于CD8+CD28-T細胞，但以前者為主。它的表達及功能與調節性T細胞（regulatory T cells，TR細胞）密切相關。調節性T

46、細胞，是體內非常重要的T細胞亞群，在自身免疫、腫瘤免疫及移植免疫中均能發揮作用。三、FOXP3胸腺中未成熟T細胞及外周調節性T細胞在其受體被結合后，以及在TGF-和雌激素刺激下，FOXP3表達均增高，并可通過抑制IL-2的表達及上調血紅素加氧酶-1的表達等而發揮免疫抑制作用。如果FOXP3 基因發生突變，將影響TR細胞的發育成熟，導致IPEX綜合征（immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) 。 四、免疫相關轉錄因子GATA-3 轉錄因子GATA-3屬鋅指家族轉錄因子，主要調節T細胞等免疫細胞發育

47、、增殖和分化。GATA-3是T祖細胞發育中所必需的轉錄因子，被稱為“T細胞的特異性活化子”，并可調節TCR 基因的表達。CD8+基因的啟動子及增強子上具有GATA-3的結合位點，且GATA-3在胸腺細胞發育過程中調控CD8+基因的表達。四、免疫相關轉錄因子GATA-3GATA-3參與維持正常骨髓造血及微環境造血調控。在再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)的病理狀態下，骨髓微環境中GATA-3 基因的表達明顯受到影響，GATA-3的異常表達上調可能與AA的骨髓中出現異常活化的淋巴細胞有關。四、免疫相關轉錄因子GATA-3GATA-3通過影響CD8+等相關基因表達和/或調控Th細

48、胞亞群來影響機體免疫功能。AA的骨髓基質細胞（BMSC）和骨髓細胞中GATA-3的表達異常，可能是導致AA骨髓中T細胞功能異常和自身反應性T細胞產生的主要原因之一。GATA-3的異常上調表達對AA的骨髓微環境和造血細胞均有影響，GATA-3可能從調控微環境基質細胞和免疫細胞兩方面參與AA的發病機制，也說明在骨髓微環境中存在著AA致病的免疫素。 五、核轉錄因子B（NF-B） 核轉錄因子B（NF-B）是一類在動物細胞中廣泛表達的轉錄因子，能與某些基因的增強子上B位點結合，并啟動、促進相應基因轉錄。在B細胞核蛋白提取物中，有能與免疫球蛋白輕鏈基因的增強子B序列特異結合的蛋白。B位點還廣泛存在于淋巴細

49、胞、病毒、細胞因子的增強子上，其調控的基因大都與免疫應答及炎癥反應有關。因此，NF-B是參與這類應激反應的蛋白質基因轉錄的調控因子。 NF-B參與的信號傳導五、核轉錄因子B（NF-B）有生理功能的NF-B是由P50和P65兩個亞單位構成的異源二聚體。其主要生理功能之一是：通過誘導凋亡抑制基因的轉錄，拮抗細胞凋亡的發生，它們幾乎存在于所有細胞中。調節一系列的病理和生理反應，在細胞生長、分化、增殖、凋亡，尤其在炎癥反應和免疫應答中處于重要地位。抑制NF-B的過度表達可阻斷其靶基因產物的產生。NF-B除了能介導多種炎性介質轉錄表達外，它也參與細胞凋亡的調控，主要通過調控凋亡相關的重要基因表達。五、核

50、轉錄因子B（NF-B）當NF-B激活時，可抑制細胞凋亡并延長細胞生存周期，所以細胞凋亡及NF-B活化的異常會導致多種人類疾病。例如：NF-B在肝纖維化過程中一方面形成“炎性瀑布”，造成肝臟損傷；另一方面促進HSC的增生、活化，并且抑制其凋亡，從而推進肝纖維化的進程。目前，許多研究者試圖通過改變NF-B活性來調節細胞的應激感染性，尤其在腫瘤及抗炎癥治療領域，這一思路引起了廣泛的興趣。 六、Spl Spl是序列特異性的DNA結合蛋白，可調控某些啟動子中富含GC序列的細胞和病毒基因的轉錄過程。近來，與Spl具有相似結構及轉錄特性的轉錄因子（Sp2、Sp3、Sp4）也相繼被發現和克隆，由此構成了Sp

51、多基因家族。對許多可調控腫瘤細胞生存、生長和血管生成的基因而言，Spl是一個重要和必需的轉錄因子。 六、SplSpl的異常表達和活化，可通過促進相關腫瘤生長因子和血管生成基因表達等機制，營造適宜腫瘤生長的局部微環境，正向調節腫瘤增殖、轉移潛能和血管生成。可受Spl蛋白調節的基因有：成纖維細胞生長因子受體-1、類上皮生長因子受體、類胰島素生長因子受體-1、類胰島素生長因子結合蛋白-2、血管內皮生長因子（VEGF）、胸腺嘧啶激酶等。 六、SplSpl還可調節Bcl-2、Bax等細胞凋亡相關蛋白的啟動子，通過調控細胞凋亡影響腫瘤細胞的生存和轉移潛能。在正常胃黏膜和胃癌組織中，Sp1蛋白表達具有不同的

52、分布特征。Sp1可作為判斷胃癌患者預后的一個獨立指標，并可能通過除淋巴結轉移以外的其它機制促進腫瘤的侵襲和發展。 七、PAX5 PAX（paired box）5基因是配對區PAX 基因家族的成員，該家族產生的蛋白都含有一個編碼128個氨基酸的配對結構域。它編碼的核反式作用因子B細胞特異性激活蛋白（B-cell specific activator protein，BSAP）在發育的中樞神經系統、成人睪丸和B淋巴細胞中表達。 七、PAX5比較不同化療階段B-ALL（兒童急性白血病）患兒PAX5 mRNA的表達發現，初診化療前組患兒與復發組患兒的平均PAX5 mRNA表達差異無顯著意義（P 0.0

53、5），而化療緩解組患兒的平均PAX5 mRNA表達下降（最小殘留白血病細胞，即MRD0.01%），與初診化療前組和復發組患兒的差異均具有顯著意義（P 0.05）。在B-ALL中，PAX5通過調控其目標基因CD19 表達，來影響細胞內多種信號傳導途徑，進一步可能影響腫瘤的發展。第七節 人工轉錄因子 如前所述，轉錄因子是真核表達調控中非常重要的一類反式作用因子，通常由DNA結合結構域與效應結構域兩部分組成，這兩個結構域可以各自獨立發生作用。基于轉錄因子的這種結構特點，可以人為地選擇針對特定序列的DNA結合結構域與具有特定作用的效應結構域構建人工轉錄因子。 第七節 人工轉錄因子目前，人工轉錄因子的D

54、NA結合結構域多為C2H2型鋅指結構。每一個鋅指單元由大約30個氨基酸組成，識別DNA雙螺旋大溝中相連的3bp序列，并可通過氫鍵作用與相應的堿基結合；多個鋅指可以串聯成簇，從而識別并結合較長的DNA序列區域。常見的人工轉錄因子的效應結構域有激活結構域以及抑制結構域，不同的效應結構域賦予人工轉錄因子不同的功能。 第七節 人工轉錄因子一、人工轉錄因子的結構二、獲得特異識別DNA序列的鋅指蛋白三、人工轉錄因子的應用一、人工轉錄因子的結構 早期的人工轉錄因子，只是簡單地將某種已知轉錄因子的DNA結合結構域，與另一種已知轉錄因子的效應結構域組合在一起，所得到的融合蛋白。例如：1985年Brent等將酵母

55、轉錄因子Gal4的轉錄激活結構域與細菌LexA蛋白的DNA結合結構域融合在一起，得到的新型轉錄因子可以作用于含有LexA操縱子序列的啟動子，并激活其下游基因的表達。當時人們將這種實驗稱為“domain swap experiments”。如今，種類繁多的DNA結合結構域以及效應結構域被應用于人工轉錄因子的構建。 一、人工轉錄因子的結構1、DNA結合結構域2、效應結構域（1）激活結構域 （2）抑制結構域（3）效應結構域的拓展 1、DNA結合結構域在人工轉錄因子的設計中使用的DNA結合結構域，根據其構成，分為：非蛋白結構模塊與蛋白結構模塊兩大類。非蛋白結構的DNA結合結構域，包括三鏈形成寡核苷酸（

56、triplex-forming oligonucleotide，TFO）、肽核酸（PNA）以及聚酰胺（polyamides）等。 1、DNA結合結構域TFO與PNA都是通過與靶序列形成三鏈而識別特異序列的；而聚酰胺則是通過與DNA的小溝結合來進行序列識別的，已經設計出了可以特異識別4bp序列的聚酰胺分子。蛋白結構的DNA結合結構域，包括螺旋-轉角-螺旋結構、類固醇受體以及鋅指結構等。這些結構是天然的轉錄因子中經常出現的組成部分，其中鋅指結構以其小巧靈活、結構獨特而備受關注。 1、DNA結合結構域C2H2鋅指結構是Miller等最先在非洲爪蟾的轉錄因子TF III A中發現的，是真核細胞中最常見

57、的DNA結合模體（motif）。在人類基因組中，大約有2%的基因編碼C2H2鋅指結構。多個鋅指單元可以串聯成簇，識別更長的DNA序列。 鋅指單元的結構1、DNA結合結構域鋅指蛋白Zif-68包含3個鋅指單元。對于Zif-68與其靶DNA序列相互作用所形成復合物晶體的X射線衍射分析，揭示了C2H2鋅指與DNA作用的特點：每一個鋅指單元的螺旋伸入DNA的大溝中，通過螺旋外側的氨基酸來識別DNA雙螺旋大溝中的相鄰的34bp序列，并可通過氫鍵作用與相應的堿基結合。 1、DNA結合結構域C2H2鋅指結構還能識別修飾過的DNA堿基，如5-甲基胞嘧啶。相對于其它DNA結合結構域，C2H2鋅指有很多的優點：例

58、如，許多DNA結合結構域由于自身是對稱或者二聚化的結構而只能識別對稱序列，而C2H2鋅指則可以識別非回文序列；并且由于可以多個鋅指單元串聯，C2H2鋅指對于其識別序列的長度和結構沒有太多的限制，僅僅需要改變幾個關鍵位點的氨基酸，就可以賦予鋅指新的識別特性。 1、DNA結合結構域從理論上講，對于任意DNA序列，都能找到能夠與之特異結合的C2H2鋅指。基于鋅指結構相對于其它DNA結合結構域的優勢，目前大多數人工轉錄因子都以鋅指結構作為DNA結合結構域。自從應用了鋅指結構之后，人工轉錄因子才真正實現了模塊化設計。 2、效應結構域在早期人們發現，僅僅是DNA結合結構域對于基因轉錄以及表達可能會產生一定

59、的抑制作用。其原因可能是：諸如鋅指蛋白這樣的DNA結合結構域過量表達，并結合在基因的編碼區，從而阻礙了基因轉錄的進行；也有可能是：結合在基因啟動子區域，占據了某些轉錄必需的轉錄因子的結合位點（如果是占據抑制因子的作用位點，則有可能有一定的上調作用）。2、效應結構域不過這些作用的強度是很有限的，而且情況因研究體系的不同而差別很大。因此，目前在人工轉錄因子的設計中，通常都要加上不同的效應結構域，以賦予人工轉錄因子不同的功能。 2、效應結構域（1）激活結構域（2）抑制結構域（3）效應結構域的拓展（1）激活結構域常用的激活結構域有來自NF-B的p65亞基（288548位氨基酸）以及來源于單純皰疹病毒（

60、herps simplex virus）的VP16等。利用VP16的413490位氨基酸部分，可很有效地激活（上調）基因的轉錄。VP16的437447位氨基酸DALDDFDLDML，也可產生明顯的激活作用；再縮小至78個氨基酸，或者DDFDL這5個氨基酸，仍有很強的激活作用。（1）激活結構域許多被稱為AH（amphipathic helix）的模擬天然激活區域的15個氨基酸的人工肽也被用在人工轉錄因子的構建中。近年來，還發現形成發卡的RNA分子對于基因的轉錄，也能產生一定的激活作用。 （2）抑制結構域常用的抑制結構域有：轉錄因子KOX1的KRAB（krppel-associated box）結