1、2012級基因工程考試復習姓名：_電話：_一基因工程是指將一種或多種生物體 (供體) 的基因或基因組提取出來, 或者人工合成的基因, 按照人們的愿望, 進行嚴密的設計, 經過體外加工重組, 通過一定的方法, 轉移到另一種生物體 (受體) 的細胞內, 使之能在受體細胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術.基因工程 是指在體外將目的基因插入病毒、質粒或者其他載體分子中、構成遺傳物質的新組合，并使之摻入到原來沒有這些基因的寄主細胞內，且能穩定的遺傳。基因工程三要素：供體 受體 載體基因工程的操作步驟：切接轉檢基因工程研究的內容：基因的分離與克隆 轉化體的篩選 書本:（GE克隆載體的研究載體的選擇與構建 外源

2、基因整合和表達的檢測 GE受體系統的研究基因轉化受體系統的建立 外源基因在細胞中的表達調控 目的基因的研究基因轉化技術 外源基因的遺傳 GE工具酶的研究 GE新技術的的研究）基因工程誕生的理論基礎及技術基礎1) 理論基礎20世紀40年代，確定了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是pro,從而明確了遺傳物質的基礎問題。50年代，DNA雙鏈和DNA結構的雙螺旋模型和DNA半保留復制機理解答了DNA的自我復制和遺傳信息傳遞問題。50年代末和60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學說，并成功破譯了遺傳密碼，從而闡明了基因遺傳信息的流向和表達方式。2）技術基礎限制性核酸內切酶的發現DNA連接酶的發現GE載體的發

3、現轉化（導入）方法基因表達6如何正確看待基因工程(正反兩方面）雖然GE解決了生產生活中的一些問題，如：紅色GE:指的是醫療部門的GE，涉及的基因改造的細菌產生的基因藥物如胰島素。白色GE:包括環境微生物學，環境技術和其他技術或工業應用。綠色GE:在農業上的應用，用在作物育種的主要重點是植物的不敏感的害蟲和疾病。但是基因工程的安全性引起了強烈的關注和質疑：問題1用于篩選的標記基因或報告基因是否會對人畜有害，同時導致病原菌抗藥性的提高。問題2抗除草劑基因會不會使轉基因植物變成不可控制的雜草，或漂移到雜草上使雜草泛濫。問題3外源基因插入的位置效應是否會引起有害的沉默基因的表達。問題4轉基因動物是否會

4、演變成對人類有極大威脅的新物種。問題5基因治療是否對人體的正常功能產生不良影響。二DNA提取（基因組，質粒DNA，噬菌體）原核基因組DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。植物組織中DNA 的提取CTAB的 作用 :CTAB十六烷基三甲基溴化銨是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液0.7mol/LNaCl中是可溶的，當降低鹽溶液的濃度到一定程度0.3mol/LNaCl時從溶液中沉淀，通過離心可將CTAB與合算的復合物同蛋白、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。動物組織中DNA 的提取SDS的 作用 :

5、溶解膜蛋白及脂肪，從而使細胞膜破裂；溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；對RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能夠與蛋白質結合形成R1-O-SO3-R2+-蛋白質復合物，使蛋白質變性沉淀。載樣緩沖液的作用增加樣品密度，確保DNA均勻沉入加樣孔內.在電泳中形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置.使樣品呈色，使加樣操作更方便.質粒DNA提取的兩種方法：氯化銫密度梯度離心法,利用堿變性法提取質粒DNA方法及原理）p91氯化銫-EtBr密度梯度離心法是根據“在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子質量的細菌染色體DNA易發生斷裂形成相應的線性片段，而質粒DNA則由于其分子質量較小

6、、結構緊密，仍能保持完整的狀態”這種差別建立的純化質粒DNA的技術。原理：當將含有溴化乙錠EtBr的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中時，溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結合，并因此導致雙螺旋結構發生解旋反應。線性的或開環的DNA分子，如大腸桿菌染色體DNA片段，可結合大量的EtBr分子，直至達到飽和（每個堿基對大約結合一個溴化乙錠分子）。而像質粒這樣的共價閉合環狀的DNA（cccDNA）分子，由于在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入，EtBr分子的結合數量相對較少。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫中

7、的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr復合物中，結合的EtBr分子數量越來越多，其密度也就越低。通過氯化銫密度梯度離心之后，根據它們的不同密度，就會平衡在不同位置。取出DNA，用異丙醇抽提溴化乙錠，再用緩沖液透析除去殘余氯化銫，最后用兩倍體積冷乙醇沉淀，就得到了純化的質粒DNA。堿變性法提取質粒DNA方法及原理堿變性法提取質粒DNA方法是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA片段之間在拓撲學上的差異而發展出來的。在pH12.012.5時，線性的DNA會完全變性分開，甚至出現斷裂；而共價閉合環狀質粒DNA雖然兩條鏈分離，但仍然纏繞在一起不分開。通過冷卻或恢復中性pH使之復性，線性染色體形

8、成網狀結構，而cccDNA可以準確迅速復性，在離心時，大部分主染色體與細胞碎片、雜質等纏繞在一起被沉淀，通過離心即可除去線性染色體，而可溶性的cccDNA留在上清液中，將含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，獲得質粒DNA。DNA樣品濃度的測定方法a,在瓊脂凝膠上用熒光染料進行標準比對。b，利用分光光度計測吸收值。A260.DNA Concentration（濃度） MeasurementComparison with a standard using a fluorescing dye （熒光染料）on an agarose-gel瓊脂糖膠凝 .Using absorption of DNA

9、in a UV-spectrophotometer分光光度計DNA純度的測定DNA在260納米處有最大吸收峰，但蛋白質核酸的主要污染源在280nm處有最大吸收峰，A260/A280適合純度測定。純DNA=A260/A280=1.8純RNA=A260/A280=2.0低于1.8含苯酚或蛋白質，高于1.8含RNA和單核苷酸。DNA純化的方法：a 氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法（CsCl-EB）適合純化大劑量DNA。b 陰離子交換層析法c 瓊脂糖凝膠電泳洗脫法，適合小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收純化。d 基因純試劑盒核酸雜交類型：A轉移印跡southren雜交：檢測DNANorthren雜

10、交：檢測RNAWestern雜交：檢測蛋白質B 點印跡、狹縫印跡dot blotting /slot blotting C 原位雜交in situ hybridization質粒特性：1什么叫質粒一類存在于細菌或真核細胞中，獨立于染色體之外能自主復制的裸露的雙連環狀（少數為線狀和RNA）DNA分子，是與細菌或真核細胞共生的遺傳成分。2質粒的構型，及不同構型的大小遷移順序絕大多數質粒是環狀雙鏈，其分子具有3種不同的構型：1） 當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環狀構型時，成為共價閉合環形DNA，即cccDNA。這樣的DNA通常呈現超螺旋的SC構型。2） 如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環狀

11、結構，另一條出現一至數個缺口時，稱為開環DNA（ocDNA），此即OC構型。3） 若質粒DNA經過適當的限制酶切割后，發生雙鏈斷裂而成線性分子（L-DNA)，通稱L構型。在正常的電泳條件下，不同構型的質粒DNA，盡管分子質量相同，但是仍然具有不同的電泳遷移率，其大小順序為：cccDNA(scDNA)>L-DNA(線性DNA）>OC-DNA>D-DNA(二聚體DNA）>T-DNA（三聚體DNA）。經過合適的限制酶處理后所有結構的DNA都轉化為線性分子。3質粒的大小差異大，最小的不到1kb,最大的甚至超過500kb。4宿主細胞在標準培養條件下，一種質粒在宿主細胞中存在的數目

12、稱為該質粒的拷貝數。5理論上講，幾乎所有的細菌都含有質粒。幾乎所有的質粒都會帶有一個至多個基因，而這些基因的表達常常賦予細胞有用的特性。6質粒DNA都含DNA的復制起始點，這使得質粒可在宿主細胞中獨立復制，分子質量小一點的DNA可利用宿主細胞中的DNA復制酶來進行自身的DNA復制；分子質量大一點的DNA本身含有DNA復制時所用酶的基因，質粒DNA復制時所用的DNA復制酶是自身DNA基因表達的產物，還有一些質粒DNA能將自身的DNA插入到寄主細胞染色體上，隨寄主染色體復制而復制。常用電泳緩沖液種類及特點TAE50×242gTris57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/L EDTA(

13、pH8.0)雙鏈DNA分子的泳動速率比另兩者快10%，超螺旋在其中電泳時更符合實際分子質量，回收DNA片段時首選，大片段分離效果好，緩沖容量小，過夜電泳不可選用。TBE5×54gTris27.5硼酸20mol0.5mol/L EDTA pH8.0小片段（1kb）分離效果好，回收率差，不宜用于回收電泳。緩沖容量大，過夜電泳適合TPE10×108gTris15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml)40ml 0.5mol/L EDTA pH8.0磷酸鹽的濃度偏高，容易使DNA沉淀，也不適合回收電泳，緩沖容量大，過夜電泳適合電泳緩沖液組成及其作用類型6×緩沖液儲存溫度

14、I0.25%溴酚藍40.25%二甲苯氰FF40%蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍室溫0.25%二甲苯氰FF15%聚蔗糖水溶液III0.25%溴酚藍40.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液作用：增加樣品密度，確保DNA均勻沉入加樣孔中；在電泳中形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳速度和位置；使樣品呈色，使加樣操作更方便。DNA沉淀兩種方法的優缺點1乙醇優點： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發除去，不影響以后實驗。缺點： 需要量大，一般要求低溫操作。2異丙醇優點： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀異丙醇難以揮發除去

15、。所以，最后用70乙醇漂洗數次。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離物質原理（三個效應）不連續電泳凝膠采用兩層或3層性質不同的凝膠（樣品膠，濃縮膠和分離膠）重疊起來會用，前兩種膠的緩沖液、PH和孔徑大小完全一樣，不同的是濃縮膠中無樣品。分離膠的孔徑較小，PH也不同，能使能讀較低的各組分在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨率。第一 三個不連續：凝膠孔徑的不連續 緩沖液離子組成及各層凝膠ph的不連續 在電場中形成的電位梯度的不連續第二 不連續系統中的三種物理效應電荷效應 酶蛋白按其所帶電荷的種類及數量，在電荷作用下向一定的電極及一定的速度移動。分子篩效應 相對分子質量或構型不同的蛋白質通過一定孔徑的分

16、離膠時，所受摩擦不同，受阻程度不同，表現出不同的遷移率濃縮效應 使待分開樣品中的各組分在濃縮膠中被壓縮成層。基因的化學合成：人工合成的短DNA片段5末端為OH，而天然的DNA5末端為P.（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亞磷酸三酯法）基因組裝方法：全片段酶促鏈接法：帶上必要的5磷酸基團，與相應的互補寡核苷酸片段退火，形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，加入T4DNA連接酶，使它們彼此連接組裝成一個完整的基因或基因片段，這些組裝的產物插入到適當的載體上，轉化受體細胞，最后用DNA序列分析檢測所組裝的基因。例如：干擾素和牛視紫紅質基團。酶促填充法：將兩條具有互補3末端的長的寡核苷酸片段彼此退火，產生的

17、單鏈區斷在加入的klenow酶的聚合作用下合成互補鏈，再和載體連接。PCR組成成分 ，標準的PCR反應體系：10×擴增緩沖液     10ul4種dNTP混合物 各200umol/L引物     各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+   1.5mmol/L加雙或三蒸水至    100ulPCR引物設計原則Primer Design:  引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。 引物不能形成二級結構。 引物長度一般在1530堿基

18、之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續4個堿基的互補。 引物之間不能有連續4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。什么是PCRPCR技術是一種通過模擬體內DNA的復制方式，在體外兩種分別與基因兩端不同DNA鏈互補的特異引物，經聚合酶酶促作用下選擇性地將DNA某個特殊區域快速擴增出來的技術。什么是不對稱PCR Asymmetric PCR不對稱PCR是用不等量的一對引物（非限制性引物與限制性引物），PCR擴增后產生大量的單鏈DNA。什么是反向PCR Inverse PCR一種用于指數式擴增位于一個已知DNA區段

19、的PCR法。什么是巣式PCR Nested PCR. 方法由兩輪PCR擴增和利用兩套引物對所組成，在第一輪擴增中，使用一對引物產生擴曾產物，然后用一對內引物對第一輪擴增的產物進行第二輪擴增，用于DNA及RNA病毒的檢測。什么是基因定點誘變 Site-directed mutagenesis是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。（體外特異性改變某個堿基的技術）盒式誘變cassette mutagenesis是利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相應序列獲得數量眾多的突變體。kunkel定點誘變原理誘變之前將復制型的MB噬菌體轉化到d

20、ut和ung雙缺陷型菌株中生長，dut突變導致dutp水平升，ung突變則會使尿嘧啶取代DNA鏈中的胸腺嘧啶，因此，從dut-ung-大腸桿菌寄主中制備MB 單鏈DNA模板含有許多尿嘧啶殘基，進行寡核苷酸引物誘變，產生的異源雙鏈DNA導入大腸桿菌ung+菌株野生型模板復制之前被降解，合成鏈不會被降解，正常復制，從而產生大量的突變體，提高突變的效率。常見的印記雜交 A southern雜交：檢測DNAnorthern雜交：檢測RNAwestern雜交：檢測蛋白質B點印記，狹縫印跡（dot blotting/slot blotting)C原位雜交（in situ hybridzation)什么是放

21、射自顯影Autoradiography(放射自顯影): 利用放射性同位素所發射出來的帶電離子(或粒子)作用于感光材料的鹵化銀晶體，從而產生潛影，用顯影液顯示這種潛影，成為可見的“像”。三限制性內切核酸酶的種類分為三類：I型、II型、III型I型、II型III型ATP、Mg2+AAC N6I GCTTGA N8T GCT1000bp以外切割Mg2+回文序列切割位點在識別位點區域ATP Mg2+AG AACCAGCA24-26bp外切割限制性內切核酸酶的命名方法例如EcoRIE:表示大腸桿菌屬名的第一個字母；co:表示種名的前兩個字母R：表示株名；I:表示該菌種中第一個被分離出的酶。同裂酶 同尾酶

22、 新裂酶的區別同裂酶：相同識別位點和切割位點不同但來源不同的酶稱為同裂酶。新裂酶：來源不同相同識別位點但切割位點不同的酶。同尾酶：來源不同，識別位點不同，切割位點也不同，但產生了相同的粘性末端的酶。影響限制性內切核酸酶酶活性的因素a能源分子濃度；b酶濃度，例如，T4DNA連接酶在連接平末端時酶用量為12單位連接效率最高；而在連接粘性末端時酶用量為0.1單位時便能得到最佳的連接效率。c反應時間;d反應溫度，對DNA連接酶而言，連接粘性末端最適37，在此溫度下，粘性末端處氫鍵易遭熱破壞降低粘性末端結合的速率；因此，連接粘性末端最佳溫度應介于酶作用速率和末端結合速率之間，一般認為是4-15比較合適。

23、e作為底物的DNA片段的摩爾比等。典型酶切反應體系組成無菌水 14ul10×buffer 2ulBSA牛血清蛋白（保護酶） 2ulDNA樣品0.2-1ug在TE 1ul保護酶2-10ug 1ul最終體系 20ul酶在冰上，最后加入反應中，加入酶前把它們全混勻。酶加樣順序一般為：水+緩沖液+DNA+酶，以保證酶的活性。什么是星號活性及其引起因素星號活性：某些條件下，一種特異性識別順序的限制性內切酶，在每位同一種DNA片段時 會產生新的酶切微位點而得到不同的酶切片段，這種酶活性則稱星號活性。引起因素： 高濃度的甘油（5%） 低離子強度小于25mM 高PH(8.0） 乙醇，乙二醇等有機溶劑

24、 Mn2+、Cu2+、Co2+等正離子，與Mg2+競爭物理圖譜physical map （Restriction Maps限制性圖譜,)(限制性內切酶切割位點之間距離和順序的圖譜)。限制性圖譜分布圖，順序，距離（如圖）常用DNA連接酶的特性T4DNA連接酶:來源T4噬菌體，粘性末端和平末端都可連接，必須以ATP作為輔助因子E.coliDNA連接酶:來源于大腸桿菌，只催化雙鏈DNA片段互補粘性末端之間的連接。連接反應溫度16匹配末端連接的方法存在的問題及其解決方案匹配粘性末端：同一種酶切割，混合在一起，自己發生配對，連接。I 產生的問題：a. 載體自身環化降低了重組子的效率b.插入的外源DNA片

25、段有兩個方向解決方法：a. 堿性磷酸酶的處理，去除載體DNA片段的5磷酸，阻止載體DNA分子的自身環化，從而增加了重組DNA的比率。b. 利用雙酶切的方法來實現基因的定向克隆，沒有合適的雙酶切的位點可以通過加銜接物的方法實現定向克隆。II 不匹配粘性末端如何進行連接？a. 將粘性末端修飾成平末端。b. 將平末端修飾成互補粘性末端（補平）III平末端的連接方法（提高平末端的效率）a. T4DNA連接酶連接平末端提高T4DNA酶的濃度；提高DNA片段的濃度；降低ATP濃度，以增強連接物與DNA結合；加入多胺化合物，如亞精胺，降低DNA靜電排斥力；加入濃縮劑，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、強水化

26、合物三氯化六氨鈷等。b.同聚物加尾法 ccc一般用GC更穩定c.銜接物連接法 兩端平末端，人工合成雙鏈使得一端為平末端，另一端為粘性末端d.DNA片段接頭連接法接頭它是一類由人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。銜接物是指用化學法合成的一段由1012個核苷酸組成具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。Klenow大片段DNA聚合酶I在枯草桿菌蛋白酶下生成大片段和小片段，大片段即為klenow片段，是具有35核酸外切酶活性及聚合酶活性。末端脫氧核苷酸轉移酶的特性 合成方向53 合成時不要模板，但底物至少要3個核苷酸， 對dNTP非特異性，

27、任一種都可以作前體物， 可催化3OH末端單鏈或3OH突出的雙鏈， 需要Mg+或Mn+， 用Co+代替Mg+作輔助因子，可在平末端 DNA分子上進行末端轉移。用途： 給載體或cDNA加上互補同聚物尾， 標記DNA片段的3OH端，可用32PdNTP 也可催化非放射性標記物參入DNA 3末端 可按底物合成多聚脫氧核苷酸同聚物。修飾酶：堿性磷酸酶將DNA RNA或蛋白質的5”磷酸基團切掉，防止DNA的自身環化和5”末端標記前的去鱗。多聚核苷酸激酶 將ATP的5磷酸鹽催化轉移到DNA RNA的5”端，常用于正向反應，交換反應。RNA酶A（核糖核酸酶A） a可特意剪切3”末端為嘧啶核苷酸的單鏈RNA，將R

28、NA降解為3磷酸化的單核苷酸和低聚核苷酸。 b低鹽(0100mmol/L)可以切割單鏈雙鏈雜交雙鏈 c 高鹽0.3mol/L只切單鏈S1核苷酸酶（Nuclease)的特性以內切酶方式降解單鏈DNA及RNA，產生以5”磷酸為末端的產物，雙聯核苷酸不能被降解，除非是有極高濃度的醇。該酶可以用于去除雙鏈DNA的單鏈末端、單鏈DNA的選擇性切除和RNA轉錄圖譜。四載體:是細菌的DNA，運載外源基因進入宿主細胞，并在宿主細胞內進行復制和表達。穿梭載體：質粒的遷移：有一些非接合型質粒在接合型質粒的幫助下，從一個細胞轉移到另一個細胞的作用稱之為質粒的遷移性。載體需要滿足的條件/具有的特點低分子量；選擇標記；

29、高拷貝的宿主細胞；復制序列（復制起始位點）；有多個限制酶的識別位點且切點是單一的，供外源基因插入；較高穩定性，可以穩定遺傳不易丟失；安全性；擴增。質粒的不相容性在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒是不能在同一宿主細胞中穩定共存的，這一現象稱為不親和性或者不相容性。常見的載體結構pEMB PBR PUCpEMBL8PBR:PUC:如何鑒定重組噬菌體： a.藍白篩選：清亮噬菌斑為重組子，藍噬菌斑為非重組子。 b.SPI表型篩選原理 定義 野生型噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶原性E.coli的生長會受到限制的表型，稱作SPI，即對P2噬菌體的干擾敏感。這種生長抑制作用是受噬菌體red和g

30、am這兩個基因編碼的產物控制的。如果噬菌體缺少兩個參與重組的基因red 和gam同時帶有chi位點，并且宿主菌為rec+，則可以在P2溶原性E.coli中生長良好，噬菌體的這種表型 稱作spi-，因此，通過噬菌體載體DNA的red或gam基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶原性鑒別重組和非重組噬菌體，能夠在噬菌體P2溶原性的大腸桿菌中生長并形成噬菌斑。噬菌體載體的野生型為什么不能作為基因克隆的載體？a. DNA基因組大而且復雜，特別是其中具有許多基因克隆常用的限制酶識別位點。b. 噬菌體外殼只能接納一定長度（相當于基因組75%105%）DNA分子。因此，DNA只能作為小片段外源DNA分子（2.5

31、kb左右）的克隆載體。這一克隆容量是顯然不能滿足大多數基因克隆工作的要求，必須對其進行改造。噬菌體包裝限制范圍70%噬菌體150構建的噬菌體載體類型（兩種）插入型載體：一類可容納一定長度DNA片段的噬菌體載體，在克隆時無需去除與插入大小相當的片段。容納外源基因15kb替換型載體：具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區段可以被外源插入的DNA片段所取代在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體。MCS (Multiple cloning sites,多克隆位點）:由許多限制酶切位點組成，往往是人工合成的一段供外源基因的插入部位的DNA序列。cos site (

32、cos位點):DNA分子兩端粘性末端結合形成的雙鏈區域。Conjugation結合：Transformation轉化：重組質粒DNA分子通過于膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞中穩定表達的過程。Transfection轉染 將重組的噬菌體DNA分子直接導入受體細胞內的過程。Transduction轉導 通過的噬菌體顆粒感染宿主細胞，將外源DNA分子導入受體細胞內并穩定遺傳的過程。什么叫柯斯質粒載體cosmid人工構建的含有噬菌體的粘性末端和質粒復制子的特殊類型的質粒載體.MB侵染宿主形成什么？渾濁型噬菌斑什么叫噬粒：由部分質粒載體和單鏈噬菌體載體組成的具有雙功能的新型載體系統有兩個ori,一

33、個來自質粒，一個來自單鏈噬菌體。什么叫亞、伴染色體紅白篩選：（重組子篩選）：與TAC配套的宿主酵母菌的胸腺嘧合成基體帶有赭石突變ade2-1帶有則個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變的抑制基因sup4的載體存在于細胞中時，可抑制ade2-1基因的突變效應，形成白色的菌落。利用這一菌落顏色轉變的現象，用于篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。常用載體克隆能力（mb)質粒10kb Cosmid:35-45kb插入型噬菌體 15kb BAC:75-300kbYAC:100-1000kb MAC:1Mb五 1. 分離目的基因的常用方法：a 直接分離;b 人工合成；c PCR擴增

34、；d 從基因文庫里篩選2. 基因庫（gene pool)：特定生物體全基因組的集合。（天然存在）3. 基因文庫（gene library or gene bank):某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉化宿主細胞，轉化細胞在選擇培養基上生長出的單個菌落（或噬菌斑）（或成活細胞）即為一個DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。4. cDNA文庫（cDNA library):是指某生物某一發育時期所轉錄的mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而成的克隆的集合體。5. 基因組文庫（genomic library）：是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定的

35、DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合。6. 基因組文庫構建程序：總DNA提取 隨機剪切 載體連接 轉化 擴增到保存7. cDNA文庫構建程序：提取總DNA ，純化mRNA，合成cDNA雙鏈，去除小片段，將雙鏈cDNA連接到載體，轉化或包裝，擴增及保存。8. cDNA文庫與基因組文庫的區別：（版本一）a.基因組文庫中的一個基因片段可以出現在不同序列中，某個基因可能會被打成不同的片段，cDNA文庫不會出現這種情況。B cDNA文庫不含內含子，基因組文庫有內含子和不表達序列C 基因組文庫在一個基因組上都是一個拷貝數，出現的概率接近。cDNA文庫有一定的時效性，不同時期的DNA不同，基因的比例在基因

36、組文庫中相似，而在cDNA文庫中相差較大（版本二）A 基因組文庫包含了所有的基因，而cDNA文庫只包含特定時空下表達的mRNA基因，缺乏內元和調節序列，因此在研究基因結構時沒有多大用處B cDNA文庫代表了mRNA的來源，其中一些特定轉錄很豐富，而另一些很少，所以存在豐度的差別;而基因組文庫在理論上均等的代表了所有的基因序列C 從不同細胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序列，可用于分離差別表達基因；基因組文庫不能D 基因組文庫由于含有不表達序列，因此比cDNA文庫大E mRNA在不同的組織之間存在風度的差異，因此cDNA文庫的構建時如果mRNA少就比較困難，而基因組文庫不存在這樣的

37、問題。9. 如何評價cDNA文庫和基因組文庫（公式，計算）：A 能代表整個基因組；穩定存在：N=Ln(1-p)/Ln(1-F);其中，N：要求克隆的數目，Ln為自然對數，P：任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率，F：克隆片段的平均大小/生物基因組的大小，1/N：目的RNA在總RNA中出現的分數B 評價cDNA文庫的標準：N=Ln(1-P)/Ln(1-1/n) 10. mRNA完整性及其純度檢測方法：完整性,確保mRNA未被分解：a.利用無細胞翻譯系統如麥胚抽提物或兔網織紅細胞溶解產物看mRNA是否能夠翻譯，b.凝膠電泳分析，mRNA500-8000bp,最大1.5kb-2.0kb。純度檢

38、測方法：OD260/OD2802.0 OD260/OD230>2.0 11.cDNA文庫中如何解決外源基因DNA片段的連接問題！：a.對隨機切割過的外源DNA片段按分子質量的大小進行分級分離，回收與載體裝載量相適應的DNA片段，然后進行重組。b.用堿性磷酸酶去除外源DNA的5磷酸基團 c.用末端轉移酶在外源DNA的兩個末端加上同聚物。12.mRNA的分離方法;.利用3末端polyA尾巴的特性；A.柱層析法：人工合成T，制成層析柱B.磁珠分離：總RNA生物素標記的poly(T)>加入磁珠與生物素抗體的復合物磁鐵捕捉用一定鹽溶液洗脫去離子水洗脫mRNAC.蔗糖溶液梯度離心 13 檢測m

39、RNA完整性：a.確保mRNA不被降解，b.使用無細胞的翻譯系統，c.用電泳法分析mRNA：看是否在0.8-2.0kb的區段，是否集中大量mRNA.無細胞翻譯體系：又稱無細胞蛋白質合成系統，是分子生物學中一種常規的表達系統，該系統可以用于蛋白質快速分析鑒定，基因轉錄和翻譯的調控機理的研究以及分子間的相互作用的研究14 基因克隆方法及原理：基因文庫中獲取；功能克隆；圖位克隆。圖位克隆定義：根據目的基因在染色體的位置進行基因克隆的一種方法圖位克隆的原理：在利用分子標記技術對目的基因進行精確定位的基礎上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標記篩選DNA文庫，從而構建目的基因區域的物理圖譜，再利用此物理圖譜

40、通過染色體步行最近目的基因或通過染色體登陸的方法最終找到該目的基因的克隆。15 EST（表達序列標簽）：基因序列中一段特異標記或表征該基因的序列，通常它含有足夠的結構信息以顯示該基因與其他基因的差異，長度一般在100-500kb16 .酵母雙雜交系統原理：在基因轉錄的過程中，有很多轉錄激活因子參與，大部分真核生物的位點特異轉錄激活因子通常具有兩個可分隔開的結構域，一個是DNA特異結合域（BD)，一個是轉錄激活域（AD）。這兩個結構域各具功能，互不影響。但一個完整的，具有激活特定基因表達的激活因子必須同時具有這兩個結構域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區與AD區結合后則能特異地

41、激活BD結合基因的表達。據此可將兩個待測蛋白（X和Y）分別與這兩個結構域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y)，并共表達與同一個酵母細胞內，如果兩個待測蛋白間能發生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD和BD形成一個完整的轉錄激活因子，并激活相應的報告基因表達，通過對報告基因的檢測就能很容易的知道待測蛋白分子間是否發生了相互作用，進一步可以用已知蛋白X作為誘餌，分離獲得與之相互作用的蛋白質Y及其編碼序列等。17.TA克隆定義：18差異篩選原理：需要兩個細胞群體，一個目的基因正常表達，另一個不表達。制備兩種細胞群體的mRNA提取物，以兩種總mRNA（或cDNA拷貝）為探針，分別表達目的基因的細胞

42、群體構建的cDNA文庫進行篩選，挑選含有目的基因的探針有雜交信號，不含目的基因的探針沒有雜交信號的菌落供進一步研究。19. 轉座子標簽法：原理：當轉座子跳躍而插入到某個功能基因時，就會引起該基因的失適，并誘導產生突變型而當轉座子再次轉座或切離這一位點時，失活基因的功能又可恢復，遺傳分析可確定某基因的突變是否是由轉座子引起，由轉座子引起的突變便可以轉座子的DNA片段為探針，從突變株的基因組文庫中調出含有該轉座子的DNA片段，并獲得含有部分突變株DNA序列的克隆，進而以該DNA為探針，篩選野生型的基因組文庫，最終獲得完整的基因。20. 序列克隆（重點）：八一，常用動物的標記基因1,胸苷激素（tk）

43、通過TK合成胸苷酸篩選氨基嘌呤（抑制嘌呤和胸苷從頭合成)2，二氫葉酸還原酶（DHFR）通過DHFR變體酶抗Mtx篩選3. 氨基糖苷磷酸轉移酶（DHFR）利用APH鈍化G418，來篩選G418（抑制蛋白質的合成）4. 潮霉素B磷酸轉移酶(XGPRT)，利用XGPRT從黃嘌呤合成GMP篩選霉芬酸（抑制鳥苷酸從頭合成）5. 天冬酰胺合成酶（AS）6. 腺苷脫氨酶（ADA）二，轉染動物細胞的方法<1>機械化方法1，裸露DNA直接注射適合于基因表達技術2，電穿孔3，顯微注射4，基因槍法<2>化學方法1. 磷酸鈣共沉淀法2. DEAE-葡聚糖法3. 脂質體介導法<3>生

44、物方法1. 轉導三，共轉染現象：在磷酸鈣沉淀物中，兩個物理上毫無聯系的DNA分子混合物往往能侵染同一個細胞產生共轉染的現象。4 基因治療（gene theraphy）：將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病以達到治療的目的。5 應用轉基因動物培育的方法：1， 獲得胚胎 2，受精卵移植3， 顯微注射，將目的基因在顯微鏡下通過玻璃微管向胚細胞注射500-600拷貝基因九一，基因沉默. Gene Silencing：外源基因存在于生物體內，并未丟失或損傷，但該基因不表達或表達量極低的現象。二，包涵體：在一定條件下，外源基因的表達產物在E.coil中積累并致密的集中在一起形成無膜的裸露結構，這種結構稱為包涵體。三，融合蛋白(fusion protein)是將兩個或多個基因的編碼區首尾連接,由同一調控序列控制構成的基因表達產物。四，非融合蛋白（no-fusion protein）：不與細菌