1、 單克隆抗體制備技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù) monoclonal antiboddy productionmonoclonal antiboddy production廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院 徐霞徐霞本章內(nèi)容本章內(nèi)容單克隆抗體概念、特性、與多克隆抗體的單克隆抗體概念、特性、與多克隆抗體的異同點？異同點？雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理 雜交瘤細胞的克隆方法雜交瘤細胞的克隆方法 單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用概念概念多克隆抗體（多克隆抗體（PcAbPcAb）：針對抗原不同表位）：針對抗原不同表位的多個的多個B B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的混合抗體淋巴細

2、胞克隆產(chǎn)生的混合抗體單克隆抗體（單克隆抗體（McAbMcAb）：只針對抗原單一表）：只針對抗原單一表位的位的B B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體淋巴細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體為何要使用單克隆抗體？為何要使用單克隆抗體？一個抗原分子可能含有許多抗原表位一個抗原分子可能含有許多抗原表位一個一個B B細胞只會生產(chǎn)一種抗體細胞只會生產(chǎn)一種抗體傳統(tǒng)抗血清對相似抗原會有交叉反應(yīng)性傳統(tǒng)抗血清對相似抗原會有交叉反應(yīng)性一個抗原分子上常有許多一個抗原分子上常有許多表位表位抗原分子上可以誘導(dǎo)出抗抗原分子上可以誘導(dǎo)出抗體的部位或片段，稱為體的部位或片段，稱為eptope eptope 、antigenic antigenic

3、 determinantdeterminant；一個抗原；一個抗原分子上通常都有許多分子上通常都有許多eptopeeptope ，每個，每個eptopeeptope至至少都可誘生出一種抗體；少都可誘生出一種抗體；因此在傳統(tǒng)抗血清中，都因此在傳統(tǒng)抗血清中，都含有許多種不同的抗體，含有許多種不同的抗體，分別針對這些不同的分別針對這些不同的eptopeeptope。一個一個B B細胞只會生產(chǎn)一種抗體細胞只會生產(chǎn)一種抗體 血清中的每一種抗體血清中的每一種抗體是由單一種是由單一種 B B 細胞細胞 所分泌產(chǎn)生，若能把所分泌產(chǎn)生，若能把此此 B B 細胞由脾臟中挑細胞由脾臟中挑出來，單獨培養(yǎng)成細出來，單獨

4、培養(yǎng)成細胞株，則可獲得單一胞株，則可獲得單一種類的抗體，只會對種類的抗體，只會對一種一種 eptopeeptope反應(yīng)。反應(yīng)。 大量培養(yǎng)此細胞株，大量培養(yǎng)此細胞株，即可有品質(zhì)一定、純即可有品質(zhì)一定、純度均一的抗體，即度均一的抗體，即單單克隆抗體克隆抗體。抗血清對相似抗原會有交叉反應(yīng)性抗血清對相似抗原會有交叉反應(yīng)性對于分子構(gòu)造相似的抗對于分子構(gòu)造相似的抗原，由于它們含有共同原，由于它們含有共同或相似的或相似的eptopeeptope ，所產(chǎn)，所產(chǎn)生的抗血清對這兩種相生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產(chǎn)生反應(yīng)，似的抗原都會產(chǎn)生反應(yīng)，稱為稱為交叉反應(yīng)性交叉反應(yīng)性。 同時同時又由于免疫動物的個體又由于免

5、疫動物的個體差異，對抗原的反應(yīng)也差異，對抗原的反應(yīng)也有相當(dāng)?shù)牟町悾灾聼o有相當(dāng)?shù)牟町悾灾聼o法準確控制所得到每批法準確控制所得到每批抗血清抗血清 效價效價的高低的高低抗血清和單克隆抗體制備抗血清和單克隆抗體制備 B B細胞無法在培養(yǎng)基中生長細胞無法在培養(yǎng)基中生長 B B細胞不易在培細胞不易在培養(yǎng)基中生長，養(yǎng)基中生長，雖然有人一直雖然有人一直努力，想找出努力，想找出在體外培養(yǎng)脾在體外培養(yǎng)脾臟細胞的條件，臟細胞的條件，但結(jié)果均不甚但結(jié)果均不甚理想。理想。 ( (見見 圖圖 中央的中央的 4 4 號號B B 細胞細胞，X X 表示表示無法培養(yǎng)無法培養(yǎng)) )腫瘤細胞可在培養(yǎng)基中永久生長腫瘤細胞可在培養(yǎng)

6、基中永久生長 腫瘤細胞可在腫瘤細胞可在培養(yǎng)基中永久培養(yǎng)基中永久生長：若把瘤生長：若把瘤細胞永久生長細胞永久生長的特性，利用的特性，利用細胞融合技術(shù)細胞融合技術(shù)導(dǎo)入可生產(chǎn)抗導(dǎo)入可生產(chǎn)抗體的體的 B B 細胞細胞 中，則得到可中，則得到可在培養(yǎng)基中永在培養(yǎng)基中永久生長的久生長的 B B 細胞株，即雜細胞株，即雜交瘤細胞株。交瘤細胞株。 1975年年KoehlerKoehler和和MilsteinMilstein在在NatureNature雜志聯(lián)名發(fā)表題為雜志聯(lián)名發(fā)表題為“分泌預(yù)定特異性抗體的融合細胞持續(xù)培養(yǎng)分泌預(yù)定特異性抗體的融合細胞持續(xù)培養(yǎng)“的論文，宣的論文，宣告單克隆抗體的誕生，該成果獲告單克

7、隆抗體的誕生，該成果獲19841984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎和生年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎和生理獎理獎. . 雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理 雜交瘤技術(shù)是將能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進行雜交瘤技術(shù)是將能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進行無限繁殖的無限繁殖的B B淋巴細胞淋巴細胞與能在體外進行無限繁殖，與能在體外進行無限繁殖，但不能產(chǎn)生抗體的但不能產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞。融合成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性：這種雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性：既能夠既能夠分泌特異性的抗體，又能夠在體外長期繁殖分泌特異性的抗體，又能夠在體

8、外長期繁殖。雜交。雜交瘤細胞經(jīng)過篩選、克隆化培養(yǎng)后成為單個細胞克隆，瘤細胞經(jīng)過篩選、克隆化培養(yǎng)后成為單個細胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。分泌的抗體即為單克隆抗體。 單克隆抗體制備流程圖單克隆抗體制備流程圖 親本細胞的選擇與制備親本細胞的選擇與制備細胞株穩(wěn)定，易傳代培養(yǎng)；細胞株穩(wěn)定，易傳代培養(yǎng)；細胞株本身不產(chǎn)生細胞株本身不產(chǎn)生IgIg是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)換酶糖轉(zhuǎn)換酶 缺陷株缺陷株 (hypoxanthine-guanine (hypoxanthine-guanine phos phoribosyl phos phoribosyl transferase ,tran

9、sferase ,HGPRTHGPRT) )最常用的骨髓瘤細胞是最常用的骨髓瘤細胞是NS-1NS-1和和SP2/0SP2/0細胞株細胞株骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞 (NS-1)(NS-1)骨髓瘤細胞需定期用骨髓瘤細胞需定期用8-8-氮鳥嘌呤氮鳥嘌呤(8-AG)(8-AG)處理處理親本細胞的選擇與制備親本細胞的選擇與制備免疫脾細胞免疫脾細胞：是經(jīng)過抗原誘導(dǎo)活化的免疫細胞，是經(jīng)過抗原誘導(dǎo)活化的免疫細胞，具有分泌抗體的能力具有分泌抗體的能力8-128-12周齡周齡BALB/cBALB/c小鼠小鼠 先以先以 目標(biāo)抗原目標(biāo)抗原( (如菌體如菌體) ) 免疫免疫，抗，抗原需加原需加 佐劑佐劑(adjuvant(

10、adjuvant）注入小鼠體內(nèi)注入小鼠體內(nèi)慢慢釋出，誘使慢慢釋出，誘使 B B 細胞成熟增殖并生產(chǎn)抗體。細胞成熟增殖并生產(chǎn)抗體。 試采血試采血 確定有抗體產(chǎn)生后，確定有抗體產(chǎn)生后，即可取出即可取出 脾臟脾臟以收集以收集脾臟細胞脾臟細胞( (大多為大多為B B 細胞細胞) ) 與骨髓瘤與骨髓瘤細胞進行細胞進行 細胞融合細胞融合。 注意乳劑的生產(chǎn)要完全，可取小量滴入水中，注意乳劑的生產(chǎn)要完全，可取小量滴入水中，震動后應(yīng)該震動后應(yīng)該不會散去。不會散去。 有人打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。有人打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。 但除非抗原來但除非抗原來源困難或有其它目的，我們?nèi)圆捎脗鹘y(tǒng)方法，因免疫反應(yīng)

11、源困難或有其它目的，我們?nèi)圆捎脗鹘y(tǒng)方法，因免疫反應(yīng)的啟動機制非常復(fù)雜，生物整體的免疫反應(yīng)是最可靠的啟動機制非常復(fù)雜，生物整體的免疫反應(yīng)是最可靠的。的。 細胞融合小鼠脾細胞 B B 與NS-1 細胞 N N 以 PEGPEG 進行融合，操作在 2 min 內(nèi)完成 。PEGPEG可導(dǎo)致細胞膜上脂類物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜容易打開而有助于細胞融合。 常見的幾種融合形式常見的幾種融合形式細胞細胞DNADNA合成途經(jīng)合成途經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基三種關(guān)鍵成分三種關(guān)鍵成分： 次黃嘌呤（次黃嘌呤（hypoxanthine,Hhypoxanthine,H） 氨基蝶呤（氨基蝶呤（aminopterin,Aamin

12、opterin,A） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（thymidine thymidine ，T T）是根據(jù)細胞內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷是根據(jù)細胞內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途徑設(shè)計的用于篩選雜酸的生物合成途徑設(shè)計的用于篩選雜交瘤細胞的特殊培養(yǎng)基。交瘤細胞的特殊培養(yǎng)基。 葉酸參與葉酸參與DNADNA合成過程，而氨基蝶呤是葉酸的拮抗合成過程，而氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，能阻斷該合成途徑。劑，能阻斷該合成途徑。 HATHAT培養(yǎng)基中含有葉酸拮抗劑培養(yǎng)基中含有葉酸拮抗劑- -氨基蝶呤，故所有氨基蝶呤，故所有細胞細胞DNADNA合成的主要途徑均被阻斷，只能通過替代合成的主要途徑均被阻斷，只能通過替代途徑合成。

13、途徑合成。雜交瘤細胞從脾細胞中獲得雜交瘤細胞從脾細胞中獲得HGPRTHGPRT，同時又繼承了，同時又繼承了骨髓瘤細胞長期生長繁殖的特性，能夠在骨髓瘤細胞長期生長繁殖的特性，能夠在HATHAT培養(yǎng)培養(yǎng)基中得以生存而被篩選出來。基中得以生存而被篩選出來。核苷酸從頭合成途徑核苷酸從頭合成途徑（de novo synthesisde novo synthesis）核苷酸核苷酸氨基碟呤氨基碟呤（A A）HATHAT核苷酸補救合成途徑核苷酸補救合成途徑（salvage synthesissalvage synthesis）次黃嘌呤次黃嘌呤（H H）胸腺嘧胸腺嘧啶核苷啶核苷（T T）DNADNA篩選方法篩選

14、方法初步篩選初步篩選： 融合后馬上以融合后馬上以 HAT HAT 培養(yǎng)，能培養(yǎng)，能活下來的都是活下來的都是 B B 細胞與細胞與 NS-1 NS-1 的正確融的正確融合細胞，但此時細胞的合細胞，但此時細胞的遺傳遺傳背景尚未十分背景尚未十分穩(wěn)定。穩(wěn)定。 篩選特異性抗體篩選特異性抗體： 并非所有并非所有 B B 細胞都會細胞都會產(chǎn)生我們所要的抗體，小鼠原先就存在許產(chǎn)生我們所要的抗體，小鼠原先就存在許多多 B B 細胞株對抗一般疾病；因此要用細胞株對抗一般疾病；因此要用 酶酶聯(lián)聯(lián)免疫分析法免疫分析法 （ELISAELISA）挑出特異性抗體）挑出特異性抗體陽性雜交瘤細胞的克隆化陽性雜交瘤細胞的克隆化克

15、隆化克隆化 從抗體陽性孔中分離出單個細胞從抗體陽性孔中分離出單個細胞進行培養(yǎng)，使之繁殖成單一細胞集落的過進行培養(yǎng)，使之繁殖成單一細胞集落的過程。程。有限稀釋法有限稀釋法：最常用的方法：最常用的方法顯微操作法顯微操作法熒光激活細胞分選法熒光激活細胞分選法軟瓊脂平板法軟瓊脂平板法 有限稀釋法有限稀釋法計數(shù)計數(shù)10103 3/ml/ml10102 2/ml/ml10/ml10/ml0.5-2/0.5-2/孔孔將陽性孔細胞株稀將陽性孔細胞株稀釋，重新平分到釋，重新平分到 96 96 孔細胞培養(yǎng)板孔細胞培養(yǎng)板中，以計算使得每中，以計算使得每孔中只含有一個細孔中只含有一個細胞（例如胞（例如 每每 mL m

16、L 含有含有100 100 個細胞，個細胞，若只要取一個細胞若只要取一個細胞放到一個培養(yǎng)孔中，放到一個培養(yǎng)孔中，那你應(yīng)該吸取多少那你應(yīng)該吸取多少 mLmL？ 0.01 mL0.01 mL），），待其生長成群落后，待其生長成群落后，再次以再次以 ELISA ELISA 篩篩選特異性抗體。選特異性抗體。克隆化需至少進行克隆化需至少進行3-53-5次次陽性雜交瘤細胞的凍存目的：保證雜交瘤細胞不會因污染或過多目的：保證雜交瘤細胞不會因污染或過多傳代變異丟失染色體而喪失功能。傳代變異丟失染色體而喪失功能。凍存液凍存液：10%-90%10%-90%小牛血清小牛血清+10%+10%二甲亞砜二甲亞砜（DMSO

17、DMSO），），1X101X106 6-5X10-5X106 6/0.5 mL/0.5 mL逐步降溫逐步降溫:-80:-800 0C C過夜過夜, ,再放入液氮再放入液氮單克隆抗體生產(chǎn)單克隆抗體生產(chǎn)小鼠體內(nèi)誘生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一小鼠體內(nèi)誘生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑選出來的雜交瘤細胞打入小鼠腹部，誘周后把挑選出來的雜交瘤細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然后以生腫瘤，然后以 針頭針頭 收集所產(chǎn)生的收集所產(chǎn)生的 腹水腹水，通，通常可取得常可取得 15 mL 15 mL 左右；腹水中的抗體濃度非常左右；腹水中的抗體濃度非常高，每高，每 mL mL 可達數(shù)可達數(shù) mgmg。 2)2

18、)體外增量培養(yǎng)法：體外增量培養(yǎng)法： 把雜交瘤細胞在大型培養(yǎng)把雜交瘤細胞在大型培養(yǎng)槽中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清即得抗體，但每槽中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清即得抗體，但每 mL mL 只得約數(shù)只得約數(shù) mgmg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養(yǎng)瓶，可產(chǎn)生如腹水般濃度的上清，一種細胞培養(yǎng)瓶，可產(chǎn)生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: (IBS Integra Bioscience: Integra Integra CellineCelline) )。單克隆抗體的性質(zhì)鑒定單克隆抗體的性質(zhì)鑒定IgIg類型測定類型測定特異性測定特異性測定效價測定效價測定結(jié)合表位測定結(jié)合表位測定親和力測定親和力測定染色體分析染色體分析單克隆抗體的特性單克隆抗體的特性高度特異性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性高度的均一性和