1、一系列新的小RNA源自于tRNA的RNA片段新型的不同于miRNAs的小RNA分子隨著時(shí)間的推移逐漸的在不同的生物體中發(fā)現(xiàn)。為了發(fā)現(xiàn)這種新型的小RNAs，我們用前列腺癌細(xì)胞系創(chuàng)建了一個(gè)17-26個(gè)堿基長(zhǎng)的RNA庫(kù)并用高通量的測(cè)序方法對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果表明很大數(shù)量的這種序列是非常確切的來(lái)源于成熟的或者前體RNA分子5'末端或者3'末端，它們整體形成了三種類型的tRFs。即：tRF-5,tRF-3,和tRF-1。這些序列共同組成了一種類型的小RNA分子，而這種類型的小RNA分子的豐富度是僅次于miRNAs的。用雜合反應(yīng)、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、夾板結(jié)扎化驗(yàn)方法獨(dú)立的測(cè)定了至少17種tR

2、Fs。從而證明了tRFs在生物中的重要性，我們進(jìn)一步研究了tRF-1001，這是一種起源于3'末端的Ser-TGA前體tRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)，而這種tRF分子在成熟的tRNA分子中是不存在的，tRF-1001在癌細(xì)胞系中很大范圍的高度表達(dá)，而在組織中卻很少表達(dá)。而它的表達(dá)是和細(xì)胞增殖密切對(duì)應(yīng)的。通過(guò)siRNA調(diào)停的方式敲掉tRF-1001缺陷細(xì)胞在細(xì)胞分裂的G2期有明顯的積累，而通過(guò)引入寡核糖核苷酸2'-O末端甲基化的tRF-1001分子使表型逆轉(zhuǎn)的個(gè)體對(duì)siRNA是有抵抗性的。tRF-1001是由前列腺癌易感基因在tRNA的3'末端形成的。我們得出的數(shù)據(jù)表明tRFs不是在tR

3、NA退化或者生物進(jìn)化過(guò)程中的隨機(jī)產(chǎn)物，而是大量的新型的小RNA分子都是有著精確的序列結(jié)構(gòu)，這些序列結(jié)構(gòu)有著特殊的表達(dá)模式和生物學(xué)規(guī)則。非編碼RNAs分子在生物的很多方面扮演者重要的參與者。關(guān)于這方面的最多研究是miRNAs,它調(diào)整動(dòng)植物中目的RNA的轉(zhuǎn)錄后加工。另外一系列與miRNA密切相關(guān)的小RNA是siRNA,它在RNA干擾途徑中起著關(guān)鍵性的作用。在植物中，自然發(fā)生的siRNA(trans-actingsiRNA和naturalantisensetranscriptssiRNA)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。在果蠅和哺乳動(dòng)物中的報(bào)到最近才發(fā)現(xiàn)，與此同時(shí)合成的雙鏈DNA和siRNA已經(jīng)作為一種敲除基因的工具在動(dòng)

4、物方面應(yīng)用很多年了。一系列其他的小RNA分子也在不同的物種中鑒定了出來(lái)，包括tncRNA、21URNA、rasiRNA、hcRNA等。盡管它們中的一部分被證明在異染色質(zhì)形成和轉(zhuǎn)位子沉默中起生物作用，最近表明它們中的大部分是沒(méi)有弄清楚的。我們相信其他的小RNA分子亟待發(fā)現(xiàn)，特別是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用去發(fā)現(xiàn)。在本研究中，我們用454深度測(cè)序的方法分析了人前列腺癌細(xì)胞系中的小RNA的全部表達(dá)產(chǎn)物，接下來(lái)是siRNAs，最多的是起源于tRNA的片段。除了它們?cè)诜g中的知名作用外，tRNA也表現(xiàn)出了在細(xì)胞中的其他作用，像反轉(zhuǎn)錄、卟啉生物合成等。在這里，我們鑒定了tRNA的新作用。其特點(diǎn)和大量的tRF

5、個(gè)體表達(dá)產(chǎn)物如以下所示。就像它們的精確序列曲線一樣，結(jié)果表明tRFs不是生物進(jìn)化過(guò)程中的隨機(jī)退化的中間產(chǎn)物，而是組成了一種具有更深入監(jiān)察作用的小RNA。任何一種tRFs在細(xì)胞活力中都是不可缺少的。結(jié)果tRF-5,tRF-3,andtRF-1的克隆、鑒定和特征描述。從兩個(gè)前列腺癌細(xì)胞系中克隆了17-26nt長(zhǎng)的小RNA分子，然后454深度測(cè)序。得到了658068個(gè)序列結(jié)果，萃取之后發(fā)現(xiàn)40%的序列是miRNAs，剩下的部分是屬于不同于人類基因和序列標(biāo)簽的原序列。兩個(gè)不匹配的序列結(jié)果可以用來(lái)補(bǔ)充nmsRNA的結(jié)果，這些序列是序列錯(cuò)誤或轉(zhuǎn)錄后翻譯，比如RNA編輯。我們主要致力于30個(gè)序列，相比之下一

6、個(gè)非常有名氣的具有生物學(xué)功能的miRNA,miR-18a,被克隆了473次，與此同時(shí)，一個(gè)高豐度的miRNA,let-7a，被克隆了17856次。數(shù)據(jù)庫(kù)中的695中miRNAs中，一大部分(635個(gè))被克隆的次數(shù)小于200次。這些nmsRNA中的大多數(shù)都在經(jīng)過(guò)了進(jìn)一步的鑒定，而這鑒定方法是在USUC的基因組瀏覽器上審查它們所在的區(qū)域。28種序列可以映射到人類基因組上，在很多情況下是多基因位點(diǎn)。這其中的6個(gè)起源于已知的轉(zhuǎn)錄本和snoRNA,從這一點(diǎn)看，小RNA很可能起源于這里。值得注意的是，過(guò)半的豐富nmsRNA序列和tRNA的位置是一一對(duì)應(yīng)的。考慮到克隆片段是大概反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的小RNA水平。這些

7、tRNA相關(guān)的小RNA分子應(yīng)該是比大部分的miRNA多。成熟tRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，包括5'端前導(dǎo)鏈和在tRNA成熟過(guò)程中被修整的3'端后隨鏈。對(duì)于大多數(shù)的真核生物tRNA來(lái)說(shuō)，CCA序列在酶的作用下加到修整過(guò)得tRNA中間產(chǎn)物的3'末端。在這17種tRNA相關(guān)的小RNA中。第五個(gè)和第八個(gè)分別精確的對(duì)應(yīng)于成熟tRNA的5'和3'末端。在所有8種tRF-3RNAs分子都包含在tRNA成熟過(guò)程中序列加到3'端的CCA序列。tRF-1系列的四種小RNA分子被定位在RNA的前體物中，而且它們的5'端合成在成熟tRNA的3&#

8、39;末端。所有克隆產(chǎn)物的末端序列精確保留明顯表明一個(gè)精確的分裂事件在這些tRF傳代過(guò)程中是非常重要的。為了得到一個(gè)更加綜合性的tRFs分析，我們擴(kuò)大分析范圍到所有的小RNA序列，而這些序列的擴(kuò)增都是是不少于五次的。用與人類基因相對(duì)應(yīng)的1541種nmsRNA，40%的對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)包括一個(gè)tRNA，其側(cè)翼長(zhǎng)25nt。它們中的77%是由于它們精確的開始和結(jié)束位點(diǎn)才被識(shí)別的，同時(shí)剩下的23%存在于體內(nèi)tRNA的隨機(jī)位點(diǎn)。所有沿著成熟tRNA分子分布的小RNA分子的5'和3'末端的分布規(guī)律顯示了一個(gè)重要的豐富的tRF-5和tRF-3類型的分子，顯示了這些并不是tRNA退化的隨機(jī)產(chǎn)物。如果

9、推測(cè)一下的話，tRF-5andtRF-3起源于tRNA的成熟，是有內(nèi)切核酸酶的內(nèi)切和外切核酸酶的外切作用而生成的。從454深度測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)看，我們測(cè)定的是內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)分布和長(zhǎng)度分布。A在tRF-5類型的3'末端較為豐富otRF-3類型的切割位點(diǎn)優(yōu)先定位在A/U和A/U之間。tRF-5這種類型的分子顯示了15-25nt范圍內(nèi)正常分布的一種模式，這和我們?cè)谛NA克隆中的片段大小選擇是非常相似的。相比較而言，tRF-3則偏向于分布在13-22nt這個(gè)較小的范圍內(nèi)。20nt的tRF-3耗費(fèi)非常嚴(yán)重。酶切位點(diǎn)的選擇和tRFs的大小分布，更進(jìn)一步支持了其產(chǎn)生不適隨機(jī)的。這對(duì)于tRF-3更為如此

10、。tRF-1的百分比低于tRF-3的百分比，tRF-1的較低的百分比可以用一個(gè)假設(shè)來(lái)解釋，而這個(gè)假設(shè)就是其在前體RNA分子時(shí)期以3'末端裂解的方式釋放了。就人662個(gè)tRNA基因位點(diǎn)而言，成熟tRNA的3'末端和RNA聚合酶III的終止信號(hào)的距離是可變的。只有14.6%的tRNA基因座能夠產(chǎn)生16-27個(gè)堿基長(zhǎng)的tRF-1,這是包含在我們的克隆片段里的，這也解釋了tRF-1的數(shù)量少的問(wèn)題。如果所有前體RNA分子的裂解都能產(chǎn)生tRF-1,那么tRF-1類型的分子的大小分布和期望的理論分布不能完美的契合。這種變異表明某種類型的tRF-1被選擇性的加工或者保留在細(xì)胞中為了某種特定的生

11、物學(xué)功能。tRF-5,tRF-3,andtRF-1組成了人前列腺上皮細(xì)胞中大部分的小RNA，這僅次于miRNAs。除此之外，它們精確的開始和結(jié)束位點(diǎn)或附近的tRNA末端，和它們?cè)诖笮『兔盖形稽c(diǎn)方面非隨機(jī)的性質(zhì)共同強(qiáng)有力的表明其起源于tRNA一種特殊形式的裂解。通過(guò)其他技術(shù)確認(rèn)的tRFs的表達(dá)。雜合反應(yīng)發(fā)現(xiàn)8種tRFs經(jīng)手住了考驗(yàn)。我們不僅發(fā)現(xiàn)了一系列具有正確大小的tRFs，也發(fā)現(xiàn)了80-100nt是非常明顯的并且能成為成熟tRFs的前體。就tRF-1001,tRF-1002,和tRF-1003而言，其中較大的一種包括pre-tRNA，tRF便起源于這里。就tRF-5和tRF-3而言，探針也顯示

12、對(duì)應(yīng)的成熟tRNA，其存在要比tRFs要多.除了成熟的tRNA夕卜，這里也有一些中等大小的，相當(dāng)于tRNA的分裂產(chǎn)物的東西最近被報(bào)道出來(lái)。我們使用了夾板結(jié)扎的方式對(duì)tRF-1001進(jìn)行了測(cè)試，這種結(jié)扎測(cè)試取決于tRF-1001的3'末端和5'末端的結(jié)扎點(diǎn)，是通過(guò)精確的低聚糖退火而實(shí)現(xiàn)的。因而，這種結(jié)扎測(cè)試發(fā)現(xiàn)具有精確的3'末端序列的RNA分子在測(cè)試產(chǎn)生tRF-1001的的前體RNA的轉(zhuǎn)錄物時(shí)更具有特殊性。這個(gè)結(jié)果與雜交測(cè)試得出的結(jié)果是一致的。值得提出的是tRF-1001的量與它的前體物往往不具有非常完美的關(guān)聯(lián)性。這表明tRF-1001的加工過(guò)程和其穩(wěn)定性可能起了調(diào)節(jié)作用

13、。兩種tRF-1001、tRF-3001、tRF-3009也進(jìn)行了這種結(jié)扎測(cè)試。一些tRFs的表達(dá)水平太低使得我們不能使用結(jié)扎測(cè)試和雜交測(cè)試，特別是對(duì)于tRF-3和tRF-5而言，存在著一種來(lái)自于成熟tRNA和中間產(chǎn)物的強(qiáng)烈的干擾信號(hào)。為了避開這個(gè)影響，我們使用了發(fā)現(xiàn)miRNA時(shí)使用的方法相似的定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)。我們切膠凈化了17-26nt合成cDNA的RNA，從而消除了來(lái)自于大的tRNA成熟物和其他RNAs的干擾。12種tRFs都通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR的方式進(jìn)行了成功測(cè)試。有趣的是，每一種tRF都在細(xì)胞系中表現(xiàn)了一種特殊的表達(dá)模式，從而否定了tRF來(lái)自于非特異性的tRNA的退化中的隨機(jī)產(chǎn)物這種

14、可能性，如此非特異性的退化將會(huì)使得所有tRFs具有一種相似的模式。tRF-1001的表達(dá)對(duì)tRF-1001做了更深入的研究，因?yàn)樗菙?shù)量最多的tRF，而且也能使用雜交的方法進(jìn)行精確的測(cè)定。tRF-1001在細(xì)胞中的表達(dá)量比在組織中高。盡管想EB染色所顯示的那樣，組織中有很多的RNA退化物，tRF-1001在組織中的量也不高。這更強(qiáng)烈的表明了tRF-1001不是來(lái)自于非特異性的RNA隨機(jī)退化產(chǎn)物。tRF-1001在許多不同家系的癌細(xì)胞系高表達(dá)表明tRF-1001與細(xì)胞的增殖有關(guān)。與此一致的是，通過(guò)雜家測(cè)試和結(jié)扎測(cè)試的方法得知tRF-1001在血清饑餓的DU145前列腺癌細(xì)胞、LNCaP前列腺癌細(xì)

15、胞、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系中是減少的，通過(guò)血清更換的方式修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞密度非常高的時(shí)候tRF-1001也會(huì)降低。因此較差的細(xì)胞增殖條件，如血清消耗和不斷增加的細(xì)胞密度都和tRF-1001的下調(diào)有關(guān)系。相似的tRF-1001的tRNA前體物的降低由于血清消耗而導(dǎo)致的tRF-1001降低是一個(gè)細(xì)胞新陳代謝中的pre-tRNA轉(zhuǎn)錄下調(diào)而導(dǎo)致的。與此形成對(duì)比的是，相應(yīng)的成熟tRNA保持不變。tRF-1001是細(xì)胞增殖所必須的。證明tRFs不是tRNA新陳代謝過(guò)程中隨機(jī)產(chǎn)物的最好方法就是證明至少一種tRFs的功能。為了證明這個(gè)，我們使用了siRNA的方法敲出掉了tRF-1001。我們?cè)O(shè)計(jì)了三種針對(duì)pre

16、tRNA的小分子RNA干擾雙鏈體，它們通過(guò)經(jīng)過(guò)退火加入tRF-1001和成熟tRNA。si-tRF1001主要以tRF-1001的上游2nt或nt處，其他兩種siRNAs分別設(shè)計(jì)在下游1nt和2nt處。因此，如果siRNAs在pre-tRNA的中心切割目的片段，那么就會(huì)在一個(gè)與其tRF-1001后代相矛盾的切割位點(diǎn)切割。非此即彼，siRNAs干擾可以以立體干擾或者RNA前體隔離在RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中起作用。與tRF-1001共用12nt堿基的sitRF1001后隨鏈的雜交使得在進(jìn)行雜交測(cè)試和夾板結(jié)扎時(shí)掩蓋了tRF-1001和它的前體物在進(jìn)行雜交測(cè)試和夾板結(jié)扎測(cè)試時(shí)的發(fā)現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR

17、不受其干擾的原因有以下幾種。第一，si-tRF1001后隨鏈3'末端的兩個(gè)dTs指引了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的第一步，小RNA的聚腺苷酸化需要3'末端；第二，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的第二步使用特意引物能使tRF退火卻不能使si-tRF1001得后隨鏈退火。事實(shí)上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)加入sitRF1001不影響tRF-1001的測(cè)定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在測(cè)量tRF-1001方面的可靠性被與此同時(shí)進(jìn)行的雜交測(cè)驗(yàn)所證明。qRT-PCR測(cè)試證實(shí)了si-tRF1001作用能使tRF-1001減少。除了標(biāo)準(zhǔn)的qRT-PCR測(cè)試分離的小RNA夕卜，其在測(cè)試總RNA方面也表現(xiàn)了出了相似的結(jié)果。有意

18、思的是，前體tRNA的量不受si-tRF1001的影響，這表明tRF-1001的減少可能是通過(guò)包括前體RNA裂解在內(nèi)的數(shù)種機(jī)制進(jìn)行。由于tRF-1001的減少，細(xì)胞增殖被損害，可用細(xì)胞的減少可以表明這一點(diǎn)，這也伴隨著DNA合成的減少和細(xì)胞周期停留在G2期的細(xì)胞的積累。盡管si-tRF1001被期待降低與tRF-1001有關(guān)的成熟tRNA。從一些交替的基因位點(diǎn)中擠出來(lái)的相同tRNA不同于tRF-1001。事實(shí)上在經(jīng)過(guò)si-tRF1001處理后，Ser-TGAtRNA的水平是不變的。由si-tRF1001誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝瑕疵不能歸功于相應(yīng)成熟tRNA的減少。另外兩種相似siRNAs的轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)了相似的

19、結(jié)果。最重要的是，被si-tRF1001誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的減少和G2期細(xì)胞的積累被2'-O-甲基化的合成tRF-1001所拯救，而不是被一個(gè)不相關(guān)的基因，熒光素酶基因共轉(zhuǎn)染所拯救。這個(gè)結(jié)果排除了基于si-tRF1001轉(zhuǎn)染的生長(zhǎng)抑制是完全由于pre-tRNA-Ser-TGA的降低和小RNA雙鏈體的脫靶而造成的這種可能。2'-O-甲基化的派生物而不是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件毫無(wú)幫助的平的寡核糖核苷酸，因?yàn)檫@種改造可以使寡核糖核苷酸的性質(zhì)穩(wěn)定并能抵御細(xì)胞核酸酶。無(wú)論tRF-1001的3'末端或5'末端都會(huì)造成局部的改善，這表明兩個(gè)末端區(qū)域都對(duì)其功能有重要作用。最初的tRF-1001擁有3'羥基和5'磷酸基，我們的克隆過(guò)程就依靠這個(gè)末端結(jié)構(gòu)。3'羥基和5'磷酸基對(duì)tRF-1001的細(xì)胞拯救功能都非常重要，無(wú)論哪一個(gè)發(fā)生化學(xué)改變都將影響tRF-1001的化學(xué)合成。因?yàn)镸e-tRF-1001和siRNAs序列重復(fù)了12-14nt，我們想排除營(yíng)救是由于Me-tRF-1001和siRNAs退火而引起的可能性并用滴定法排除了非特異的細(xì)胞目標(biāo)