1、動物細胞培養動物細胞培養生物反應器生物反應器1細胞培養工程 南開大學1. 生物反應器概述2細胞培養工程 南開大學細胞培養生物反應器 基因工程技術出現之前 低血清貼壁培養動物細胞，用于病毒疫苗生產細胞培養工程 南開大學微生物發酵簡史 1920s：酒精、甘油和丙酮等（厭氧發酵） 1940s：青霉素/抗生素、有機酸、微生素、激素等 （無菌技術與深層發酵 - 通氣/攪拌) 1950s：谷氨酸/氨基酸、核苷酸、有機酸和部分抗生素 （代謝控制與菌種人工誘變） 1970s：定向育種、基因工程蛋白質表達4細胞培養工程 南開大學Molecular Cell Biology (5th ed.) by Lodish

2、 et al.微生物與動物細胞的主要差異 尺度 細胞壁 生長速度細胞培養工程 南開大學5微生物與動物細胞的主要差異 微生物細胞尺度小，有細胞壁，抗剪切力能力較強生長速度快，溶解氧（DO）需求較高 通氣量：較高甚至很高 攪拌：能量輸入較高，主體混合與微混合（攪拌槳） 動物細胞尺度大，無細胞壁，抗剪切力能力較差生長速度慢，溶解氧（DO）需求較低 通氣量：較低 攪拌：能量輸入較低，主體混合（攪拌槳）6細胞培養工程 南開大學細胞培養生物反應器：1980-90s（1） 微生物深層發酵技術已經相當成熟 攪拌式生物反應器設計和性能 控制與配套設施 細胞培養從有血清貼壁到無血清懸浮的過渡 能否懸浮生長（雜交瘤

3、細胞例外） 能否無血清生長 能否耐受反應器內攪拌剪切力 能否耐受通氧（氣泡） 能否提高細胞密度，以提高生產效率7細胞培養工程 南開大學細胞培養生物反應器：1980-90s（2） 經過業內十余年的不懈努力，攪拌式生物反應器已經成為大規模細胞培養普遍采用的設備 可以懸浮生長 可以無血清甚至無蛋白生長 經過改進攪拌槳設計，可以耐受攪拌剪切力 在提供保護劑的條件下，可以耐受通氧 通過培養基合理設計，可以提高細胞密度 盡管大規模生產不采用，但是新穎生物反應器研發為干細胞、組織工程和新型技術奠定了基礎 中空纖維、水凝膠固定化、微膠囊等 允許灌流操作（抗體濃度達到 25 g/L）8細胞培養工程 南開大學生物

4、反應器的主要功能（1） 為細胞生長提供一個與外界隔離的無菌環境 清洗（CIP） 高溫滅菌（SIP） 混合攪拌功能 克服細胞重力沉降，并使其分布均勻 降低氣泡尺度，延長氣泡停留時間，提高氧傳質效率 保證營養物和代謝產物分布均勻 避免溫度、酸堿度局部過高（溫度與 pH 控制啟動）9細胞培養工程 南開大學生物反應器的主要功能（2） 通氧，避免培養基溶解氧（DO）過低 控制 對環境參數（攪拌槳轉速、細胞濃度、溫度、DO、pH 等）進行實時監控和記錄，并維持在較窄的設定范圍之內 出液（連續培養），補料（流加培養）10細胞培養工程 南開大學氣升式生物反應器（Airlift Bioreactor） 剪切力較

5、小，90 年代曾用于大規模培養 操作靈活性較差，現不多用11細胞培養工程 南開大學攪拌式生物反應器 主流 操作靈活，可批次、流加或灌流，普遍使用12細胞培養工程 南開大學A 20,000-liter cell culture bioreactor system is installed in a Lonza Biologics plant in Singapore. A large-sale chromatography system in a Lonza Biologics Singapore plant （2008.08）13細胞培養工程 南開大學2.細胞懸浮培養模式14細胞培養工程 南開

6、大學生產細胞株 生產細胞株合成蛋白質產物的能力主要取決于 表達載體設計 表達載體在宿主細胞染色體上的整合位點是否位于轉錄活躍區（低于染色體 3%） 克隆篩選 傳統：Limiting Dilution 現代方法：FACS 或其它專門儀器等 在沒有選擇壓力（如 MTX 對 DHFR 系統）存在的條件下，細胞株必須能夠生長足夠代時且保持穩定的產物分泌能力15細胞培養工程 南開大學細胞株的生產能力 合成蛋白質產物的能力評估 單位時間內每個細胞分泌蛋白質的平均值 經克隆篩選之后，每個細胞株為單克隆，其合成蛋白質產物的能力基本上已經達到上限，重復篩選進一步提高產率的空間不大16細胞培養工程 南開大學工藝過

7、程開發與優化概括（1） 細胞馴化 來源可能是有血清貼壁培養 使細胞適應無血清或無蛋白懸浮培養 動力學研究 確定產物合成與細胞生長的關系 了解細胞的代謝特點，包括營養需求與副產物生成 了解物理參數的影響（如降溫）17細胞培養工程 南開大學工藝過程開發與優化概括（2） 培養基優化 在滲透壓允許范圍內，平衡底物比例，以 提高活細胞密度 提高產物濃度 減少代謝副產物生成 采用高通量培養體系和統計學實驗設計（DoE），以提高篩選效率，降低工作量 和成本18細胞培養工程 南開大學工藝過程開發與優化概括（3） 反應器操作模式 批次培養：培養基優化，生長培養基優化 流加培養： 補料培養基優化 延長高密度培養時

8、間19P=qpCv(t)dt0t細胞培養工程 南開大學010020030040050060070080090010001100110100Viable Cells (105/ml)t (hours)Viable Cells Viability0102030405060708090100Cell Weaning 20040221Viability（） 雜交瘤細胞無血清培養馴化過程細胞培養工程 南開大學21 抗體分泌 CHO 細胞的馴化細胞初始狀態：貼壁，10% 牛血清第一階段：懸浮馴化，10% 牛血清第二階段：無蛋白培養馴化細胞培養工程 南開大學批次培養（間歇培養） 培養液接種細胞后，培養過程中

9、不再添加培養基，細胞生長消耗營養并形成產物，在營養消耗完后終結培養、回收產物 過程開發優化最基本培養方式底物細胞產物22細胞培養工程 南開大學批次培養（間歇培養） 培養液接種細胞后，培養過程中不再添加培養基或其它，細胞生長消耗營養并形成產物，在營養消耗完后終結培養、回收產物； 動力學研究 確定產物分泌與細胞生長的關系 生長相關 非生長相關 復合型 計算 產物比生產速率 主要底物比消耗速率23細胞培養工程 南開大學批次培養 - 高通量細胞培養系統 培養基成分品種多（50-70），且常伴有協調作用 每個營養成分對細胞株呈現不同作用模式，包括生長支持與生長抑制（毒性），因此需要確定單一成分的可采用劑

10、量范圍，并為培養基優化和反應器操作模式選擇提供基礎 細胞計數工作量浩大 高通量培養結合 DOE24 細胞培養工程 南開大學加料連續培養（Continuous culture） 培養液接種細胞后，在合適時間啟動培養基連續添加，并同時連續收獲培養液，細胞密度、底物濃度和產物濃度處于穩態； 缺乏競爭優勢（與灌流相比較），目前不常用底物細胞產物收獲25細胞培養工程 南開大學流加培養（Fed-batch culture） 先將一定量培養液加入反應器，然后接種細胞。隨著營養物質的消耗，啟動新鮮培養基或成分添加機制，使細胞能在較長時間內維持較高密度生長和代謝； 工業生產最主要的培養方式。底物細胞產物加料26

11、細胞培養工程 南開大學灌流培養（Perfusion culture） 培養液接種細胞后，在合適時間啟動培養基連續添加，并同時連續收獲培養液，經細胞截留裝置，截留細胞回流到反應器； 高細胞密度培養，目前尚有采用，。細胞培養基培養基產物回收產物回收27細胞培養工程 南開大學截留裝置灌流培養（Perfusion culture） 主要細胞截留裝置 中空纖維系統 內置鋼絲網 細胞沉降傾斜扁管 活細胞沉降速度高于死細胞 活細胞沉降至底板、回流，死細胞隨培養基溢出28細胞培養工程 南開大學3.生物反應器控制29細胞培養工程 南開大學生物反應器 過程參數檢測與控制 溶解氧（DO） 維持細胞生長與代謝 設定濃

12、度適中 始終處于被消耗狀態 矯正措施：通氧（頂部/底部） pH 乳酸形成（葡萄糖/谷氨酰胺代謝） 銨離子形成（谷氨酰胺/氨基酸代謝） CO2 形成 矯正措施：在 DO 或 pH 偏離設定值（范圍）時自動啟動通氣或泵入所需溶液30細胞培養工程 南開大學生物反應器 過程參數檢測與控制 控制理論：PID 反饋控制 Proportional：矯正量 Integral：矯正歸位 Differential：矯正速度31細胞培養工程 南開大學生物反應器 過程參數檢測與控制 DO 甘汞電極受溶液（化學成分）環境干擾比較大輸出信號：電壓 極譜氧電極電極不與培養基液體直接接觸，由一層膜隔離氧分子跨膜擴散速率與DO

13、 濃度成正比輸出信號：電流 耐高溫滅菌 性能穩定32 pH電極 耐高溫滅菌 性能穩定 溫度電極 熱電偶 性能穩定細胞培養工程 南開大學生物反應器 過程參數檢測與控制 生物反應器控制的重要性 為細胞生長提供一個穩定的生理環境 DO、pH、溫度在線自動控制相對比較容易實現 主要底物和代謝副產物通常在無菌取樣后分析葡萄糖葡萄糖氧化酶乳酸乳酸脫氫酶谷氨酰胺谷氨酸脫氫酶/心肌磺酶/天冬酰胺酶銨離子谷氨酸脫氫酶氨基酸HPLC 現已有多種酶電極分析裝置，可以提供在線檢測，并可以根據設定值添加以維持某種底物的濃度恒定，但購置與使用成本很高。33細胞培養工程 南開大學支原體（Mycoplasma）http:/

14、年發現，為目前發現的最小、最簡單的原核生物，大小介于細菌和病毒之間。支原體細胞中唯一可見的細胞器是核糖體。沒有細胞壁，多數成球形，具有較大的可變性。支原體可以在特殊的培養基上接種生長，進行臨床鑒定。形態形態 大小為 0.2 - 0.3 m，無細胞壁，形態呈現多形性，可通過濾膜； Giemsa 染色法呈淡紫色（革蘭氏染色不易著色）； 細胞膜膽固醇含量豐富，約占 36%。基因組基因組 一個環狀雙鏈 DNA，分子量小（僅有大腸桿菌的1/5），合成與代謝能力很有限。生長生長特性特性 繁殖方式多樣，二分裂繁殖為主，還有斷裂、分枝、出芽等方式； 支原體細胞分裂與其 DNA 復制不同步，可形成多核長絲體；

15、體外培養需 10 - 20% 人或動物血清（膽固醇）； 最適 pH 7.8 - 8.0 ，一般低于 7.0 則死亡（解脲脲原體，pH 6.0 - 6.5）； 大多數兼性厭氧，生長緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養基上孵育 2 - 3 天出現典型的 “荷包蛋樣” 菌落（圓形，直徑 10 - 16 m），核心部分較厚，向下長入培養基，周邊為一層薄的透明顆粒區； 支原體可在雞胚絨毛尿囊膜或培養細胞中生長；生化反應分型生化反應分型一般能分解葡萄糖的支原體不能利用精氨酸，能利用精氨酸的則不能分解葡萄糖，據此可將支原體分為兩類；解脲脲原體不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。表面抗原表面抗原 各種支原體都具有型特異性，少有交叉反應。抵抗力抵抗力 支原體對熱的抵抗力與細菌相似；對環境滲透壓敏感，滲透壓的突變可致細胞破裂；對重金屬鹽、石炭酸、來蘇爾