1、逆境生理指標(biāo)的測(cè)定要求：選三個(gè)指標(biāo)一、植物組織中超氧物歧化酶活性的測(cè)定催化下列反應(yīng)：2O27+2H+fH2O2+O2O2反應(yīng)產(chǎn)物H2O2可被過氧化氫酶進(jìn)一步分解或被過氧化物酶利用。因此SOD有保護(hù)生物體免受活性氧傷害的能力。已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關(guān)系，故成為植物逆境生理學(xué)的重要研究對(duì)象。原理本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有可被氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生，可將氮藍(lán)）四唑還原為藍(lán)色的化合物，藍(lán)色化合物在560nm處有最大吸收，而SOD可清除從而抑制了藍(lán)色化合物的形成。因此光還原反應(yīng)后

2、，反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。試劑0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml；750卩mol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；100卩mol/LEDTA-N卷溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml；20卩mol/L核黃素溶液：取0.00753g核黃素用磷酸緩沖液定容至1000ml避光保存（當(dāng)天配制）。方法1、酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加

3、1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取23ml于10000rpm下離心10分鐘，上清液即為SOD粗提液。2、顯色反應(yīng)取5ml試管（或指形管，要求透明度好）7支，3支試管為測(cè)定管，另4支為對(duì)照管，按表1加入各溶液。混勻后將1支對(duì)照管置暗處，其他各管置于4000lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致,反應(yīng)室的溫度高時(shí)反應(yīng)時(shí)間可以縮短，溫度低時(shí)反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)（溫度范圍3037°C）。表1各溶液加入量試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時(shí)）0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol750卩mol/LNBT溶液0.375

4、umol100umol/LEDTA-Na2液0.310umol20umol/L核黃素0.32.0umol酶液0.1對(duì)照管加緩沖液代替酶液蒸餾水0.2總體積3.03、蛋白濃度的計(jì)算蛋白濃度=單位：mg蛋白/g樣重axWC通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的每管中蛋白含量（mg）v樣液總體積（ml）a測(cè)定時(shí)提取液體積用量（ml）W樣重（g）4、SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管作空白，在560nm下分別測(cè)定其它各管的光密度值，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示。按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性=A叮巴：V單位：酶單位/g鮮重表示；A,x0.5xWxackAck照光對(duì)照管

5、的光密度值；AE樣品管的光密度值；V樣液總體積（ml）；a測(cè)定時(shí)樣品用量（ml）；W樣重（g）；二、氧自由基的測(cè)定原理：O27與羥胺反應(yīng)生成NO2-,NO2-在對(duì)氨基苯磺酸和a-萘胺作用下，生成粉紅色的偶氮染料，染料在九530nm有顯著吸收，根據(jù)OD530可以算出樣品中的O含量。步驟：2*1、酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加lml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5mlo取23ml于10000rpm下離心10分鐘，上清液即為SOD粗提液。2亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：lml系列濃度的NaNO2（0、5、10、15、20、30、40和50mol/

6、L）分別加入lm1對(duì)氨基苯磺酸和lmla-萘胺，于25°C中保溫20min,然后測(cè)定OD550，以NO2-和測(cè)得的OD530值互為函數(shù)作圖，制得亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線。3O2-含量測(cè)定：0.5m1樣品提取液中加入0.5m150mmo1/L磷酸緩沖液（pH7.8）,1m1的1mmo1/L鹽酸羥胺，搖勻，于25C中保溫lh,然后再加人lm117mmo1/L對(duì)氨基苯磺酸（以冰醋酸：水=3：1配制）和1m17mmol/La-萘胺（以冰醋酸：水=3：1配制），混合，于25C中保溫20min,取出以分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)530nm的OD值。根據(jù)測(cè)得的OD530,查NO2標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD530換算成NO2-

7、,然后依照羥胺與。2的反應(yīng)式:NH2OH十2O2十H+no2-十h2o2十H2O從NO2-對(duì)O2進(jìn)行化學(xué)計(jì)量，即將NO2-乘以2,得到O2根據(jù)記錄樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，可求得產(chǎn)生速率（nmo1min-1mg-1蛋白）。三、植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時(shí)，游離脯氨酸便會(huì)大量積累，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。原理采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡(jiǎn)便，而且不受樣品狀態(tài)（干或鮮樣）限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定

8、的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長(zhǎng)520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其光密度成正比。試劑3%磺基水楊酸水溶液；甲苯；2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作為溶劑進(jìn)行配制，此液在4C下23d有效；脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg脯氨酸，蒸餾水溶解后定容至250ml,其濃度為100ug/ml。再取此液10ml用蒸餾水稀釋至100ml，即成10卩g/ml的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（1）取7支具塞刻度試管按表1加入各試劑。混勻后加玻璃球塞，在沸水中加熱40min。（2）取出、冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層

9、后吸取甲苯層以0”管為對(duì)照在波長(zhǎng)520nm下比色。表1各試管中試劑加入量管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸量（ml）00.20.40.81.21.62.0H2O(ml)2.01.81.61.20.80.40冰乙酸（ml）2.02.02.02.02.02.02.0顯色液（ml）3.03.03.03.03.03.03.0脯氨酸含量（ug）0248121620（3）以光密度值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程。2樣品測(cè)定（1）脯氨酸提取取不同處理的剪碎混勻葉片0.20.5g（干樣根據(jù)水分含量酌減），分別置于大試管中，加入5ml3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球塞，于沸水浴中浸提10

10、min。（2）取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml,加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱40min。（3）取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層，以空白管為對(duì)照，在波長(zhǎng)520nm下比色測(cè)定。（4）結(jié)果計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定液中脯氨酸濃度，按下式計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)：脯氨酸（ug/gFW或DW）=（CxV/a）/W式中C提取液中脯氨酸含量（ug），由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；V提取液總體積（ml）；a測(cè)定時(shí)所吸取提取液的體積（ml）；W樣品重（g）。注意事項(xiàng):樣品測(cè)定時(shí)若氣溫較低，萃取物分層不清晰，可將試管置于40°C左右的水浴中快

11、速測(cè)定。或過夜靜置。四、植物組織中丙二醛含量的測(cè)定植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反應(yīng)植物遭受逆境傷害的程度。原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDA-TBA反應(yīng)物

12、質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的光密度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300ug/gDW，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3+的終濃度為0.5umol/L。雙組分分光光度計(jì)法根據(jù)朗伯-比爾定律：D=kCL,當(dāng)液層厚度為1cm時(shí)，k=D/C，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長(zhǎng)下的光密度值等于此混合液在該波長(zhǎng)下各顯色物質(zhì)的光密度之和。已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)分別為85.40，7

13、.40。MDA在450nm波長(zhǎng)下無吸收，故該波長(zhǎng)的比吸收系數(shù)為0,532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)為155,根據(jù)雙組分分光度計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：C1(mmol/L)=11.71D450C2(卩mol/L)=6.45(D532-D600)-O.56D450式中：C1為可溶性糖的濃度，C2為MDA的濃度，D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)下的光密度值。試劑10%三氯乙酸(TCA)；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氫氧化鈉(1mol/L)溶解，再用10%的三氯乙酸定容；石英砂。方法1. 實(shí)驗(yàn)材料受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官

14、。2. MDA的提取稱取剪碎的試材1g,加入2ml10%TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mlTCA進(jìn)一步研磨，勻漿在4000rpm離心10min，上清液為樣品提取液。3. 顯色反應(yīng)和測(cè)定吸取離心的上清液2ml(空白加2ml蒸餾水)，加入2ml0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min,迅速冷卻后再離心。取上清液測(cè)定532nm、600nm和450nm波長(zhǎng)下的光密度。4. 計(jì)算含量雙組分分光光度法按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計(jì)算測(cè)定樣品中MDA的含量：MDA(Hmol/gFW)=MDA濃度(umol/L)提取液體積(

15、ml)植物組織鮮重(g)五、植物組織中過氧化物酶活性測(cè)定原理在過氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm處有最大光吸收,故可通過測(cè)470nm下的吸光度變化測(cè)定過氧化物酶的活性。步驟：1. 酶液的制備：取1.0-5.0g材料，切碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000g離心l0min，上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提取兩次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆谩?. 過氧化物酶活性測(cè)定：酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括：2.9ml0.05mol.L-l磷酸緩沖液；1.0m12%H2O2；1.0ml0.05mol.L-l愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。用加熱煮沸5min的酶液為對(duì)照，反應(yīng)體