1、免疫檢測常用方法及應用免疫檢測常用方法及應用肥城市人民醫院檢驗科肥城市人民醫院檢驗科秦秦 偉偉l免疫學檢測方法是應用免疫學理論設計的一系列測定抗原、抗體、補體、細胞因子等免疫相關物質及微量物質如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素、毒品等試驗方法。l這些方法所具有的特異性好、敏感性高、簡單、快速和穩定的特點為臨床上確定診斷、分析病情、調整治療方案和判斷預后等提供有效的實驗依據，使它們在臨床的應用進一步普及和推廣。l顆粒性抗原(細菌、細胞等)與相應的抗體，或可溶性抗原(亦可用抗體)吸附于與免疫無關的載體形成致敏顆粒與相應的抗體(或抗原)，在有適量電解質存在下，形成肉眼可見的凝集小塊。l

2、直接凝集反應l間接凝集反應l抗人球蛋白試驗（Coombs試驗）l顆粒性抗原(細菌、細胞等)與相應的抗體在有適量電解質存在下，形成肉眼可見的凝集小塊。l常見的應用是血型的鑒定l將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小顆粒性載體的表面，然后與相應抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質存在的條件下，出現特異性凝集的現象稱間接凝集反應（indirectagglutination）或被動凝集反應（assiveagglutination）。l常用的載體微球有人O型血紅細胞、綿羊或家兔紅細胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭/甲苯胺紅、明膠顆粒等l正向間接凝集反應l反向間接凝集反應l用抗原致敏載體以檢測標本中的相應抗體l所用

3、載體顆粒為羧化的聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8m大小的圓形顆粒，帶有負電荷，可物理性吸附蛋白分子。l將溶血素O 吸附在羧化的聚苯乙烯膠乳顆粒上檢測抗”O”。l將變性IgG包被于羧化的聚苯乙烯膠乳顆粒上檢測RF。l血漿反應素試驗(RPR) 所用載體顆粒為活性炭顆粒l甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗 （TRUST） 所用載體顆粒為甲苯胺紅顆粒l所用載體為人工合成的惰性明膠顆粒l梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）l肺炎支原體抗體檢測（MP-Ab）l檢測肺炎支原體的總抗體（IgM, IgA IgG)l以滴度的方式報告檢測結果（1:80 1:80、1：160、1:320 )l用已知特異性抗體致敏載體以檢

4、測用已知特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應抗原。標本中的相應抗原。l抗人球蛋白抗體參與的間接血凝試驗，用于檢測抗紅細胞不完全抗體l分類： 直接Coombs試驗 間接Coombs試驗 一、直接凝集反應 血型鑒定二、間接凝集反應 膠乳凝集試驗 ASO/RF1正向間接凝集反應 RPP/TRUST 明膠顆粒凝集 TPPA/MP2反向間接凝集反應三、抗人球蛋白試驗 直接/間接Coombs試驗 l 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 l 使抗原或抗體與酶連接成酶標抗原或抗體，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。 l 標本中的抗原或抗體、酶標抗原或抗體按一定的次序與固相載體表面的抗體或抗

5、原反應，并通過底物與酶的反應來反映標本中的抗原或抗體的量。 l雙抗體夾心法l雙抗原夾心法l間接法l競爭法 l捕獲法測 IgM 抗體l用特異性抗體進行包被和制備酶標抗體，以檢測相應的抗原。l乙肝標志物中HBsAg、 HBeAg的檢測常采用本法l用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。l抗HBs的檢測l抗HCV的檢測l抗HIV的檢測l標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。如受檢標本中無抗體，則酶標抗體能順利地與固相抗原結合。加入酶標抗原后就顯色深。如受檢標本中含有抗體，則與酶標抗體以同樣的機會與固相抗原結合，競爭性地占去了酶標抗體與固相抗原結合的機會，使酶標抗原與固相載體

6、的結合量減少。加入酶標抗原后就顯色淺或不顯色。l最常見的應用：l乙肝HBeAb、 HBcAb檢測l（1）將抗人 IgM 抗體（抗人 IgM 鏈抗體）連接在固相載體上，形成固相抗人 IgM。 l（2）加入標本， IgM 抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他抗體。l（3）加入特異性抗原試劑，它只與固相上的特異性 IgM 結合，洗滌。 l（4）加入針對特異性抗原的酶標抗體，形成固相二抗 IgM抗體抗原 酶標抗體復合物。l（5）加底物顯色，如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性 IgM 抗體存在，是為陽性反應。l以優生四項IgM抗體檢測為例l甲肝IgM抗體測定l酶免疫測定具有高度的敏感性和特異性， 幾乎所

7、有的可溶性抗原抗體系統均可用以檢測。它的最小可測值達 ng 甚至 pg 水平。酶免疫測定標記試劑比較穩定，且無放射性危害。因此，酶免疫測定的應用日新月異，酶免疫測定的新方法、新技術不斷發展。l利用微孔膜（主要是醋酸纖維素膜）作為固相進行免疫檢測的方法l根據標記物的不同分為兩類：l 酶標固相膜免疫測定： 酶免疫斑點法 酶免疫印跡法 l 金標法： 膠體金斑點滲濾試驗 膠體金免疫層析試驗l常應用于自身抗體的檢測l金標雙抗體夾心法測抗原l將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經C處時使干片上的免疫金復合物復溶，并帶動其向膜條滲移。若標本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復合物之抗體結合，此抗原抗體復合物流至測試區即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應線條（T）。過剩的免疫金復合物繼續前行，至參照區與固相小鼠IgG結合（免疫金復合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質控線條（R）。反之，陰性標本則無反應線條，而僅顯示質控線條。l檢測HIVAb的雙抗原夾心法lHCG的檢測lHBs-Ag的檢測l大便潛血試驗（FOB）l輪狀病毒和腺病毒抗原檢測l幽門螺桿菌（HP）抗原檢測lO1群霍亂弧菌檢測lHCV-Ab檢測l艾滋病抗體金標檢測l上述兩種試驗的共同特點是：簡便、快速、單份測定、可立等結果，除試劑外無需任何儀器設備，且試劑穩定。因此特別適用于急診檢驗。l但這類試驗