1、w 色譜分析法是分析化學中獲得廣泛應用的一個重要分支，是一個具有強大生命力的分離分析技術(shù)。w 高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術(shù)。高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點w 一、與經(jīng)典液相色譜法比較一、與經(jīng)典液相色譜法比較 經(jīng)典液相（柱）色譜法使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃柱管內(nèi)，流動相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴

2、散速度緩慢，柱入口壓力低，僅有低柱效，分析時間冗長。 高效液相色譜法使用了全多孔微粒固定相，裝填在小口徑、短不銹鋼柱內(nèi)，流動相通過高壓輸液泵進入高柱壓的色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)，擴散速度大大加快，從而在短的分析時間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力。w 二、與氣相色譜法比較二、與氣相色譜法比較 氣相色譜僅能測量在操作溫度下可氣化且不分解的物質(zhì)，而對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、 熱不穩(wěn)定物、離子型化合物及高聚物的分離及測量有困難，致使其應用受到了很大的限制。 高效液相色譜法不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，適合分離生物大分子、離子型化合物、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。 據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物

3、中，能用氣相色譜測量的約占20；能用高效液相色譜測量的達到7080。 三、高效液相色譜法的特點三、高效液相色譜法的特點 1.分離效能高 2.選擇性高 3.檢測靈敏度高 4.分析速度快高效液相色譜法的分類高效液相色譜法的分類按溶質(zhì)在兩相分離過程中的物理化學原理分類1.吸附色譜（Adsorption Chromatography） 2.分配色譜（Partition Chromatography）3.離子色譜（Ion Chromatography）4.體積排阻色譜（Size Exclusion Chromatography）5.鍵合相色譜法（bonded-phase chromatography）6

4、.親和色譜（Affinity Chromatography）按分離過程物理化學原理分類的各種液相色譜法的比較吸附色譜分配色譜離子色譜體積排阻色譜親和色譜固定相 全多孔固體吸附劑 固定液載帶在固相基體上 高效微粒離子交換劑 具有不同孔徑的多孔性凝膠 多種不同性能的配位體鍵聯(lián)在固相基體上 流動相 不同極性有機溶劑 不同極性有機溶劑和水 不同pH值的緩沖溶液 有機溶劑或一定pH值的緩沖溶液 不同pH值的緩沖溶液，可加入改性劑 分離原理 吸附與解吸 溶解與揮發(fā) 可逆性的離子交換 多孔凝膠的滲透或過濾 具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡合物的可逆性離解 高效液相色譜儀簡介 1.貯液瓶 2.高壓輸液泵 3.進樣器 4.色譜柱

5、 5.檢測器 6.記錄裝置w貯液罐貯液罐( (流動相流動相) )w 一、流動相脫氣一、流動相脫氣 w （1）吹氦脫氣法 w （2）加熱回流法 w （3）抽真空脫氣法 w （4）超聲波脫氣法 w （5）在線真空脫氣法高壓輸液泵及梯度洗脫裝置高壓輸液泵及梯度洗脫裝置w 一、高壓輸液泵一、高壓輸液泵 w 高壓輸液泵可以分為以下兩類：w 1恒流泵：可輸出恒定體積流量的流動相。w （1）注射式泵（又稱注射式螺桿泵） w （2）往復型泵 w 2恒壓泵：恒壓泵又稱氣動放大泵，是輸出恒定壓力的泵。 二二、梯度洗脫裝置、梯度洗脫裝置 w 1梯度洗脫（gradient elution）又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在

6、同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。w 2梯度洗脫特點：提高柱效以及改善檢測器的靈敏度。 進樣裝置進樣裝置 液相色譜常用的進樣方式有三種：直接注射進樣、停流進樣和高壓六通閥進樣。w 直接注射進樣的優(yōu)點是操作簡便，并可獲得較高的柱效，但這種方法不能承受高壓。w 停流進樣是在高壓泵停止供液、體系壓力下降的情況下，將樣品直接加到柱頭。這種進樣方式操作不方便，重現(xiàn)性差，僅在不得已時才使用。w 高壓六通閥進樣的優(yōu)點是進樣量的可變范圍大、耐高壓、易于自動化，但容易造成譜峰柱前擴寬。 色譜柱色譜柱 多用內(nèi)壁拋光的不銹鋼制成，內(nèi)徑26mm，直形柱柱長l0l00cm。 在需要增加

7、柱長時，可使用死體積小的連接管，把幾根直形柱串接起來。 檢測器檢測器 用于液相色譜中的檢測器，應具有靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、響應快、死體積小等特點，還應該對溫度和流速的變化不敏感。 液相色譜法中有兩種基本類型的檢測器： 一類是選擇性檢測器，如紫外一可見分光光度檢測器； 另一類是通用型檢測器，如示差折光檢測器。(1)紫外一可見分光光度檢測器。 是一種應用廣泛，靈敏度和測量精度都比較高約選擇性檢測器。 它的檢測原理基于被測組分對特定波長的紫外一可見光的選擇性吸收，被測組分濃度與吸光度的關系服從朗伯一比爾定律。 它適用于在紫外和可見區(qū)有吸收的樣品。 (2)示差折光檢測器。 示差折光檢測器是根據(jù)

8、流動相中出現(xiàn)組分時，流動相折射率發(fā)生變化而設計的。 溶液的折射率等于流動相折射率與其濃度的乘積，加上組分折射率與其濃度的乘積。 示差折光檢測器為通用型檢測器，凡具有與流動相折射率不同的組分，均可檢測且操作簡便，但這種檢測器靈敏度不高，對溫度十分敏感，不能做梯度淋洗。 建立高效液相色譜分析方法的一般步驟 w 通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問題：w 根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。w 選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）。w 選擇適當?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗脫

9、方式。w 由獲得的色譜圖進行定性分析和定量分析。 w下列優(yōu)良常規(guī)操作能夠最大限度降下列優(yōu)良常規(guī)操作能夠最大限度降低維修費用：低維修費用：w 使用HPLC級試劑和流動相w 清潔的儀器、流動相和樣品，如果必要，進行過濾w 保證溶劑的相溶性w 如果必要，沖洗整個系統(tǒng)，去掉鹽，防止污染w 對儀器的使用、維護和保養(yǎng)進行記錄 1、分離分析藥物的組合含量 由于一種藥劑常含有多組分，色譜方法是既能分離又能定量的方法。如脂溶性維生素片，含有各維生素，用C18柱及含1%碳酸銨的甲醇為流動相。一次即可將各維生素B6、D1、A、E同時分離并定出含量。又如止痛藥或退燒藥也可用此法分離并測得各組分的含量。 2、藥物生產(chǎn)中

10、進行中間控制 生產(chǎn)抗菌素時，首先要了解發(fā)酵液中的主體與副產(chǎn)物的存在情況。例如：青霉素、四環(huán)素、頭孢子菌素、紅霉素、慶大霉素等的發(fā)酵產(chǎn)物，均可用C18柱和甲醇及緩沖液配制的流動相或用離子對法，分析主體及其副產(chǎn)物的含量。對普魯卡因酰胺、茶堿等可進行主體含量的測定，對硝酸甘油可測定主體含量及其降解產(chǎn)物，以便保證藥物的熱量。 3、分析藥物在體內(nèi)的殘量： 這是近來研究新藥效能很主要的內(nèi)容之一，如磺胺類藥品在血清及尿中含量也不允許太大，可用C18柱及酸性乙醇為流動相，測定含量后，則可估計最合適的用藥劑量。4、測定藥物在各種器官中的代謝產(chǎn)物，特別是研究藥物的代謝產(chǎn)物在血清中存在的情況。如測血清中的酮酸及戊二

11、酸。測尿中代謝產(chǎn)物更為方便，不需要繁鎖的預處理。因為研究尿中的組分能鑒別病人的代謝功能，對病理研究或臨床診斷均具有重要的參考價值。 主要方向是分析嘌呤、嘧啶基的核苷或核苷酸及具有相應的肽和蛋白質(zhì)。 在細胞核中有種類繁多的核苷酸，可用不同的檢測器或酶轉(zhuǎn)移檢測器或利用酶反應進行定性測定。用離子交換柱和緩沖游泳梯度淋洗。C18柱用含磷酸的緩沖水溶液的梯度淋洗法均能得到滿意的結(jié)果。分離RNA、DNA及碎片現(xiàn)在使用硅烷化的硅藻土或長碳鏈季胺鹽涂漬等在上面制成系列填充柱，已能分離t-RNA,r-RNA及DNA碎片。還可利用此技術(shù)做RNA碎片的序列分離制備工具，對生物研究起了重要的作用。氨基酸、肽、蛋白質(zhì)的

12、分析氨基酸分析主要是制成熒光衍生物或酰氯的衍生物，然后測定其序列。近來也可用高效液相色譜的柱后衍生物法測定其序列。用四烷基氯化胺肽形成離子對或高效凝膠色譜測定蛋白質(zhì)，其分離效果也很好。酶的分析酶是在血清及其他生理樣品中常有的反應產(chǎn)物，化學分析法操作不便，易造成誤差，用色譜技術(shù)分析，具有操作簡便、快速、準確的特點。糖的分析。糖的分析是其它方法較難完成的。如把糖與硼酸緩沖液預選混合，使生成糖-硼酸絡合離子，再進行分離。可把蔗乳糖、阿蘆糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、山梨糖、木糖、葡萄糖等幾十種，全部分開。也可用胺基柱分離各種天然產(chǎn)物中伯糖的各繃分。 天然物的組分非常復雜，如中草藥中各組分含量多

13、少對藥劑作用影響很大。用此技術(shù)分離分析，具有簡便、快速的特點。氨基柱能分離分析天然物中糖的組分。氰基柱能分離中藥紫草及其衍生物的組成。C18柱分離丹參中主要組分兒茶酚、桂皮中桂皮酸、煙草中的酚類化合物、麥角或鴉片中各種植物堿，這些都是近來日益受到重視的結(jié)果。 分析食品或動物飼料中的維生素含量，是當前食品工業(yè)中的重要課題。分析食品中的黃曲霉素及各種香料，又是生產(chǎn)中的常用課題。如今此技術(shù)已在分析咖啡中的黃嘌泠、調(diào)料中的核苷酸及核苷、果汁中的有機酸、米中的維生素、牛奶中的維生素D等都對食品營養(yǎng)價值提供有效數(shù)據(jù)。 分析食品中的有毒成分，如蘋果中農(nóng)藥萘乙酸、稻米中的黃曲霉素、魚體中的有機汞等。 主要針對

14、大氣中污染的成分分析，廢水和汽車尾氣中有害組分的分析。如柴油機排出的顆粒，用有機溶劑溶解后，經(jīng)色譜分析結(jié)果，有多環(huán)芳烴的硝基物，這是對人體健康有很大潛在危險的化合物。又如藥廠排出的廢水中有大量硝酚；染料廠排出廢水中的苯胺等。用液相色譜分析簡便迅速。 農(nóng)業(yè)中需要對各種作物中的營養(yǎng)成分進行各種含量分析。而液相色譜對多糖、脂肪酸蛋白質(zhì)等分析都是極為有效的方法，因此應用頗為廣泛。 高分子工業(yè)材料及生物高分子分析是近年來新興的課題。凝膠色譜是分離分析高分子組成及鑒定其性能的最好方法。高分子材料中填充各種助劑、乳化劑、分散劑等物的分離，色譜技術(shù)也獨具特點。 控制高分子產(chǎn)品質(zhì)量在生產(chǎn)工藝中，可利用凝膠色譜測定聚合物小分子雜質(zhì)。如用凝膠色譜測定環(huán)氧樹脂中未聚合的雙酚A，用C18柱分離小分子環(huán)氧化合物，小分子聚苯乙烯或不能成膜的聚脂等，用以鑒定聚合物的質(zhì)量。測定聚合物的分子量分布寬度分子量大小和分子量分布寬度是衡量聚合物質(zhì)量的一種重要指標，用凝膠色譜可以測定。 高溫凝膠色譜測聚合物的