1、HRM高分辨率熔解曲線分析技術高分辨率熔解曲線分析技術百替生物百替生物-Dendi2019-07-10HRM(High Resolution Melting): 于于2019年發明，是一項近年來備受年發明，是一項近年來備受關注的創新的技術，實現了通過研究關注的創新的技術，實現了通過研究PCR產物依賴于序列的熔解溫度而對產物依賴于序列的熔解溫度而對PCR產物進行鑒定。可用于檢測樣品中產物進行鑒定。可用于檢測樣品中存在的雙鏈存在的雙鏈DNA的單核苷酸多態性的單核苷酸多態性SNPs基因變異基因變異Mutation）、多態性）、多態性Polymorphisms和表觀遺傳學和表觀遺傳學Epigeneti

2、c差別。差別。RealTime PCRHRMTM值：當前溫度下值：當前溫度下50%的雙鏈解鏈為單鏈的雙鏈解鏈為單鏈HRM與與RealTime PCR的異同點：的異同點：需要加入熒光染料需要加入熒光染料檢測獲取熒光信號檢測獲取熒光信號采用的染料類型不同采用的染料類型不同Sybr和和LC）熒光信號檢測時機不同熒光信號檢測時機不同分辨率不同分辨率不同數據處理方式不同數據處理方式不同飽和染料有效避免了檢測熒光信號中的假陽性飽和染料有效避免了檢測熒光信號中的假陽性新的飽和染料降低了傳統染料對新的飽和染料降低了傳統染料對PCR反應的抑制作用反應的抑制作用LC GREEN高分辨率：高分辨率： DNA的熔解曲

3、線取決于的熔解曲線取決于DNA堿基序堿基序列。理論上任何一個堿基的改變，都會列。理論上任何一個堿基的改變，都會造成造成TM值的差異，但是單個堿基改變造值的差異，但是單個堿基改變造成的差異是極小的，通常只有零點幾度成的差異是極小的，通常只有零點幾度。因此要精確檢測。因此要精確檢測TM值的差異，就至少值的差異，就至少需要保證每需要保證每0.1獲取一次熒光信號。獲取一次熒光信號。LightScannerHRM原理示意圖原理示意圖HRM的技術優勢：的技術優勢：1.整體操作方法簡單，檢測靈敏度高，可整體操作方法簡單，檢測靈敏度高，可檢測出單個堿基的改檢測出單個堿基的改 變，檢測效率高，變，檢測效率高，5

4、-10分鐘即可完成對分鐘即可完成對96/384孔板的檢測。孔板的檢測。2.從從PCR到檢測熒光信號，整個過程在同到檢測熒光信號，整個過程在同一個管中進行，最大一個管中進行，最大 程度的避免了污染。程度的避免了污染。3.無需事先知道突變位點，無需設計探針無需事先知道突變位點，無需設計探針，大大簡化實驗設計，大大簡化實驗設計 時間和研究成本。時間和研究成本。HRM在醫學領域中應用：在醫學領域中應用：1)疾病相關基因癌基因特定區段突疾病相關基因癌基因特定區段突變位點的掃描，新突變位點的掃描，新突 變的發現變的發現2) HRM在序列配對中的應用。在序列配對中的應用。 3) HRM在基因分型中的應用。在

5、基因分型中的應用。 4) HRM在甲基化分析中的應用。在甲基化分析中的應用。l在胃腸道間質瘤GIST中新發現的7個c-kit激活型(c-kit-activating)突變基因位于第11號外顯子中，為從基因水平診斷GIST提供了新的方法。(Willmore et al., 2019) lAnatomic Pathologyl在非小細胞性肺癌NSCLC患者中發現第19號外顯子中存在有(L747-P753insS)突變，為以后針對性的分子診斷以及設計藥物有潛在意義。(Smith et al., 2019)lClinical PathologyHRM在突變掃描中的應用舉例在突變掃描中的應用舉例HRM在

6、序列配對中的應用舉例在序列配對中的應用舉例Human Leucocyte Antigen(HLA)人類白細胞抗原：人類白細胞抗原： 位于第六號染色體的短臂位于第六號染色體的短臂6P21.31區，長區，長3600KB，根據功能和產物結構的不同分成，根據功能和產物結構的不同分成3組：經典組：經典HLA基因、免疫功能相關基因和免疫無關基因。其中基因、免疫功能相關基因和免疫無關基因。其中經典經典HLA基因與輸血和移植急性排斥反應密切關聯。基因與輸血和移植急性排斥反應密切關聯。 在器官移植中，通過檢測樣本的HLA，以便了解樣本組織與宿主是否相容。利用HRM技術，直接觀察溶解曲線，可以迅速的找到最匹配的器

7、官組織，為挽救患者的生命爭取寶貴的時間。HRM在基因分型中的應用舉例在基因分型中的應用舉例 在拉米夫定抗病毒治療過程中，病毒合成的DNA聚合酶會在YMDD序列出發生變異。利用HRM和DNA測序法同時檢測45例樣本，其中HRM檢測結果與測序法檢測結果幾乎一致，符合率為93.3%。因此利用HRM大規模檢測YMDD變異是簡單有效的方法。（實用醫技雜志 2019）HRM在甲基化中的應用在甲基化中的應用 甲基化是蛋白質和核酸的一種重要修飾，對調節基因表達，癌癥、老年癡呆等許多疾病相關，因此檢測甲基化在醫學領域中具有重要作用。 利用亞硫酸氫鹽將未甲基化的DNA中的胞嘧啶轉換成尿嘧啶之后，處理過的DNA產物將比甲基化的DN