1、實驗一、常用培養基的制備、滅菌與消毒營養：從外部環境攝取其生命活動所必需的能量和物質，滿足生長和繁殖需要的一種生理過程。是生命活動的物質基礎，是生命活動的起點。營養物：具有營養功能的物質。也包括光能。提供生物的結構物質、能量、代謝調節物質和良好的生理環境。營養要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水培養基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的混合養料。要求：應具備6大營養要素；物質比例合適；必須滅菌。 選用和設計培養基的原則、方法及制備過程：準繩：目的明確 、營養協調、經濟節約 物理化學條件適宜方法：生態模擬、查閱文獻 精心設計、試驗比較 步驟：稱量、熔化、調PH、過濾、分裝、 加

2、塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查 培養基種類：一、按成分的不同分 天然培養基、合成培養基、半合成培養基二、按培養基的物理狀態分 固體培養基、液體培養基、半固體培養基三、按培養基用途 基礎培養基、選擇培養基 加富培養基、鑒別培養基消毒與滅菌消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養體滅菌：殺滅一切微生物的營養體，芽胞和孢子。 方法：一、物理的方法：加熱、過濾、輻射二、化學的方法：用化學試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。 加熱法：干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。1、火焰灼燒適用于接種環、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅菌利用高

3、溫干燥空氣160170C加熱滅菌12h，適用于玻璃器皿和培養皿等。原理加熱使蛋白質變性，與水的含量有關，當環境和細胞含水量越大，凝固越快。3、本卷須知： 1培養基、橡膠制品、塑料制品不能用此法； 2溫度控制在180； 3物品不能太擠； 4溫度降至70時才開箱門。 濕熱法 ：原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質容易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。 高壓蒸汽滅菌法：1、設備：高壓滅菌鍋2、時間長短根據滅菌物品的種類和數量不同有所變化。3、適用于培養基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。4、本卷須知： 1冷空氣徹底排除；2加水；

4、3壓力降為“0時方可打開。 常壓蒸汽滅菌： 對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基、牛乳培養基，含糖培養基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。 煮沸滅菌法： 適用注射器和解剖器皿，時間1015min， 超高溫殺菌 -150C和2-8s對牛乳和其它液態食品。 優點 ：保持食品價值和營養成分。 過濾除菌： 原理：介質在有壓力時阻隔微生物。 適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。 設備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。 優缺點：不破壞培養基成分，只適用少量濾液。需 大量無菌空氣以及凈化工作臺。 本卷須知：1、壓力適當； 2、無菌條件下進行； 3、防止滲透現象。 輻射滅菌： 原理：紫外線

5、波長在200300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段波長易被細胞中核酸吸收；可產生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強度和時間的乘積成正比。 缺陷：穿透力不大。距照射物1.2m為宜。 運用：無菌室，醫院。 本卷須知：對眼睛和皮膚有刺激作用。 射線滅菌：r射線，穿透力強，適用于堆積物品的滅菌。 化學藥品滅菌： 原理：應用化學制劑破壞細菌代謝機能。 殺菌劑如重金屬離子； 抑菌劑如磺胺類及多數抗生素。 留意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環境有關。 常用化學殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸 福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等 實驗二、微生物的分離、純化及培養技術 分離與

6、純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。 為什么要進行純培養：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。 常用的分離、純化方法： 單細胞挑取法 稀釋涂布平板法 稀釋混合平板法 平板劃線法 稀釋涂布平板法 ：原理： 步驟： 1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培養基，高氏I號培養基，查氏培養基冷卻至55-60時，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養基倒4皿，高氏I號培養基和查氏培養基各倒3皿。 2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。 3、涂布：將上述每種培養基平板底面標記稀釋度，

7、然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。 4、培育：高氏I號和查氏倒置培養于28培養箱中培養3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基在37培養1-2days。 5、挑菌落：轉至斜面，檢查是否一致，保管。 平板劃線法： 1、倒平板，標記培養基名稱，編號和實驗日期。 2、劃線方法 稀釋混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板時注意培養基溫度 3、混合均勻微生物培養技術1、斜面接種2、液體培養基接種3、穿刺接種4、將已接種的斜面、半固體和液體培養 基放置培養箱中培養5、將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4冰箱中保存。 實驗三、菌種保藏

8、幾種常用的保藏方法： 1、傳代培養法 保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養基用于厭氧細菌培養好后，置4C冰箱中存放，定期進行傳代培養、再存放。 可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。 2、載體法 使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。 3、懸液法 將細菌、酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。 4、冷凍法 使菌種始終存放在低溫環境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。 此法關鍵是要克服細胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護劑的使用。 5、真空干燥法 這類方法包括

9、冷凍真空干燥法和L干燥法。 冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經低溫預凍，然后在低溫狀態下進行減壓干燥。 L-干燥法則不需要低溫預凍樣品，只是使樣品維持在1020C范圍內進行真空干燥。 操作方法 1、斜面保藏法 將菌種轉接在適宜固體斜面培養基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。 2、液體石蠟保藏法 將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM

10、為準，使菌種與空氣隔絕。 將試管直立，置低溫或室溫下保存。 此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通細菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養菌種，菌種長好后用膠塞封嚴，置4冰箱存放。 4、砂土管保藏法 （1河砂處理 取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機機質。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（土壤處理 取非耕作層不含腐殖質的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。 (3)砂土混合 處理妥當的河砂與土壤按

11、3：1的比例摻合(或根據需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，最后烘干。 (4)無菌檢查 每10支砂土管隨機抽1支，將砂土倒入肉湯培養基中，30培養40h，若發現有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使 用。 (5)菌懸液的制備 取生長健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種)，用接種環輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。 (6)分裝樣品 每支砂土管(注明標記后)加入05ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)， 用接種針拌勻。

12、 (7)枯燥 將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。 (8)保管 置4冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時間進行檢測。此法多用于產芽孢的細菌、產生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業生產中應用廣泛、 效果較好，可保存幾年時間，但對營養細胞效果不佳。5、冷凍真空干燥法 （1凍干管的準備：中性硬制玻璃，烘干，滅菌。 （2菌種培養：細菌芽孢脫落；放，霉孢子豐滿。 （3保護劑的配制：配制，滅菌，檢查 （4菌懸液的制備：2-3ml保護劑 （5分裝樣品：菌懸液每管0.2ml （6預凍：程序控溫儀降溫 （7冷凍真空干燥：-50下抽真空 （8

13、取出樣品：輕敲松散即達標 （9第二次干燥： （10熔封 （11存活性檢測：抽取一管進行存活性檢查 （12保管：4保管實驗三1、細菌的形態和結構觀察簡單染色）一、目的要求觀察細菌的菌落特征掌握簡單染色法在油鏡下觀察細菌個體的形態學習環境中微生物的檢查方法，并加深對微生物分布廣泛性的認識二、基本原理形態觀察主要包括群體的形態和個體的形態觀察。細菌的基本形態主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發現星狀和四方形細菌等。細菌形態受培養時間、培養基成分、濃度、培養溫度、培養時間等發生變化。細菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質地顏色均勻，同培養基結合不緊密。菌落特征與組成菌落的細胞結構、生

14、長狀況、排列方式、好氣性和運動性直接相關。細菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現。根據細菌個體形態觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。簡單染色法原理細菌在中性的環境中帶負電荷，用堿性染料解離時帶正電荷如美蘭、結晶紫等進行染色。實驗三2：放線菌的形態結構觀察一、目的要求掌握放線菌形態結構觀察的方法觀察放線菌的菌落特征、個體形態及其繁殖方式。二、原理放線菌菌落在培養基上著生牢固，與基質結合緊密，難以用接種針挑取。放線菌細胞一般呈分枝無隔的絲狀，菌絲體分為在培養基內部的基內菌絲和伸出培養基表面的氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏

15、色，有的能分泌水溶性色素到培養基內。孢子絲長出孢子，孢子形狀各異。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀。三、實驗內容（一菌落形態觀察及菌苔特征的觀察觀察放線菌菌落表面形狀、大小、顏色、邊緣以及有無色素分泌；并用接種環挑取菌落，注意在培養基上的著生的緊密情況。區別基內菌絲、氣生菌絲及孢子絲的著生部位。（二個體形態特征觀察可直接觀察，也可置于載片上觀察。注意放線菌菌絲直徑的大小，孢子絲的形狀。（三孢子形態觀察用印片法（四用插片法觀察放線菌形態實驗三3：霉菌的形態觀察一、目的要求觀察霉菌菌落特征掌握霉菌的制片方法觀察霉菌個體形態及各種無性孢子及有性孢子的形態二、基本原理霉菌是由交織在一起的菌絲體構成。菌絲呈管狀，有的有橫隔將菌絲分割為多細胞如青霉、曲霉），有的菌絲沒有橫隔如毛霉、根霉）。菌絲直徑比一般細菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍。菌落形態較大，質地疏松，顏色各異，有絲狀、絨毛狀或蜘蛛網狀的菌絲體。將菌絲體放在水中易變形，將其置于乳酸