1、分子生物學綜合試驗報告綜合更如麻購（質粒DNA取、PC故術體外擴增DNA質粒載體和外源DNA的連接反應、地高辛標記的Southern雜交）一 .實驗目的1 .學習Southern雜交的原理及操作方法。2 .學習堿裂解法提取質粒的原理。3 .學習PCRS應的基本原理和實驗技術；了解引物設計的一般要求。4 .掌握DN琳外連接的基本技能，了解連接反應的注意事項。二 .實驗原理利用染色體DNAJ質粒DNA勺變性與復性的差異而達到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA勺氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質粒DN惠鍵也大部分斷裂，雙螺旋也有部分解開，但共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當pH=勺乙酸鈉

2、將其pH調到中性時，變性的質粒DNAX恢復到原來的堿裂解法提取質粒的主要原理是：利用染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而構型，而染色體DNM能復性，形成纏繞的致密網狀結構，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNAW大分子RNA蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。聚合酶鏈反應（PCR是體外酶促合成DNAt段的一種技術，PCR進行的基本條件：DN隔板（在RT-PC珅模板是RNA、引物、dNTP（dATPdTTRdGTPdCTP、TaqDN謙合酶、反應緩沖體系。PCRB環由三個步驟組成：變性、退火、延伸。每一個循環的產物可作為下一個循環的模板，通過30個左右循環后，目的片段的擴增可達1

3、06倍。DNAt段之間的連接是通過DNA1接酶的催化實現的。DNA1接酶催化具有平末端或互補粘性末端的DNAt段間相鄰堿基通過3,5磷酸二酯鍵連接起來。最常用的來源于T4噬菌體的T4DNA1接酶。對于平末端或互補的粘性末端可直接進行連接反應。一個片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個片段都是粘性末端但不配對，則需要通過各種方式使其可一匹配或通過平末端進行連接。通常采用末端補平、加同聚物尾、加接頭等方式是目的片段之間能夠匹配。地高辛隨機引物法標記的原理：在隨機引物法標記的反應液中，有隨機合成的六聚核甘酸作為引物，dATRdCTRdGTRdTTP和D1G-11-dUTp乍為合成底物，以單鏈DNA作

4、為模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA鏈。以地高辛標記的探針與靶基因DNAJ雜交后，再通過免疫反應進行檢測。一般通過酶標記地高辛抗體檢測，就可以肯定雜交反應的存在。免疫檢驗一般用堿性磷酸酶系統，BC1P/NBT顯色，敏感性很高。三 .實驗準備1 .實驗材料：含質粒的大腸桿菌DH5x,LB液體培養基，LB平板培養基2.實驗試劑：TaqDNA聚合酶，10X反應緩沖液(含25mmolMgClZ,dNTP引物(P1、P2),澳乙咤(EB)，點樣緩沖液Loadingbuffer(10 x):%M酚藍，40附油，目的基因及載體，2xligation緩沖液，T4DN旌接酶，LCaCl2,氨

5、節青霉素(100mg/mL,TBE電泳緩沖液(5X),DIGRandomLabelingMix(高效)，Anti-DIG-APConjugate,BCIP/NBTStockSolution,BlockingReagent。20XSSC檸檬酸鈉，3MNaCl,2XSSC檸檬酸鈉，NaCl,EDTA,變性液：NaOHNaCl,中和度：Tris-HCl、 、3MNaCl,Standardbuffer:5XSSC%(w/v)N-Lauroylsarcosine,%(w/v)SDS,1%BlockingReagent,Standardbuffer+50%formamide,Anti-DIG-AP堿性磷酸

6、酶標記抗地高辛單抗體，BCIP/NBT儲備液，沖洗液：0.1MTris-HCl,MNaCl.pH=，封閉液：1%BlockingReagent/Tris-HCl,NaCl,顯色緩沖液：Tris-HCl,NaCl,pH=,TE緩沖液：10mMTris-HCl,1mMEDTApH,2%LB固體培養基（添加amp的終濃度為100wg/ml,添加arabinose為培養基的%，溶液I、H、田，TE緩沖液，無水乙醇和70%L醇。3 .實驗儀器：微量移液器，離心管，DNA附柱，DNA攵集管，臺式離心機，電泳儀，凝膠成像系統，恒溫水浴箱，PCRKC培養皿，超凈工作臺，硝酸纖維素膜或尼龍膜。四.試驗方法1.質

7、粒的提取：培養細菌將帶有質粒的大腸桿菌接種于LB平板培養基上，37c培養24小時，然后從平板上挑取單菌落，接種于5ml液體培養基中，37c培養12小時。提取步驟 取mL過夜培養的菌液，加入離心管中，6000rpm離心1min,盡量吸除上清，重復兩次 向留有菌體沉淀的離心管中加入250區L溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。 向離心管中加入250區L溶液P2,溫和翻轉多次使菌體充分裂解。 向離心管中加入350L溶液P3,溫和翻轉多次，充分混勻，此時將出現白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10min。將上一步收集的上清液轉移到吸附柱CP3中，注意盡量

8、不要吸出沉淀。12,000rpm離心1Min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。 向吸附柱CP3中加入600wL漂洗液PW12,000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。重復操作步驟6。將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm離心2min。 將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50pL洗脫緩沖液ER室溫放置2min,12,000rpm離心1min將質粒溶液收集到離心管中。瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取的質粒DNA2 .聚合酶鏈式反應（PCR技術體外擴增DNA按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實驗一中提取的質粒DNA試齊體積(

9、30“)ddH2O12”PrimerP1(wM1plPrimerP2(wM1pl模板1pl2xTaqMix15”設置PCFO序94c180s94c45s32cycles55c45s72C45s72C600s運行PCRg序反應結束后，取20屋PCR產物進行%瓊脂糖電泳分析3.地高辛標記的Southern雜交： 將轉移好的尼龍膜或硝酸纖維素膜裝入雜交管中，貼壁放置（吸附有核酸的一面不要貼壁），趕走雜交膜和管壁間的氣泡。力口入20mlStandardbuffer,65c預雜交4-20小時。將制備的DN麻針沸水浴加熱10min,迅速置冰浴5min。全部加入雜交管。使用和預雜交相同的雜交溫度，一般雜交1

10、6-20小時。雜交結束后將雜交液倒入帶蓋的試管中，儲存于-20以備下次使用。這樣至少可以保存一年。再次使用之前應在凍融之后，加熱至+95C10分鐘以變性探針。取出雜交膜，用WashSolutionI洗5分鐘x3次。保溫沖洗：用WashSolutionII于68c沖洗15分鐘X2次。NBT顯色檢測法:經過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡1分鐘。用干凈的平皿，封閉液室溫封閉至少60分鐘。用封閉液1:25005000稀釋Anti-DIG-AP,例如2lAnti-DIG-AP加至5-10ml封閉液中（根據染色情況而調整）。稀釋液4c可穩定12小時左右。加Anti-DIG-AP,37c反應60

11、分鐘。用沖洗液洗15分鐘X3次，每次100ml。 按1:50配制底物顯色液： 例如100”“BCIP/NTP儲備液”加至5ml顯色緩沖液中，未用完的顯色劑應避光保存。顯色緩沖液20ml平衡2分鐘后傾掉。 加100ml底物顯色液（100cm2）。將膜及顯色劑封在塑料袋中，開始避光顯色。顯色過程中可以觀察。一般數分鐘即開始出現顏色，顯色過程可以持續至12小時。應絕對避免震動，以免出現顏色帶的移位。當所需要的顯色點或帶出現之后，蒸儲水洗以終止反應。結果可以進行照相記錄； 也可以直接保存于TE緩沖液， 在此情況下， 顏色長期不退。還有一種選擇時讓膜干燥，顏色消褪。但若將膜放置于TE緩沖液中，顯色重新出

12、現。五.實驗結果及分析圖1中，共有16個條帶，說明大家都提取成功了，只是右邊幾個亮度比其他的低，說明提取的DNA含量低一些。圖中有一些亮點,應該是膠上有雜質。GFP質粒提取為8個人一組，所以上圖共有四個條帶，說明提取成功，而且亮度高，說明含量高。上面圖3中的第一張是班里的14個人的，后兩張是另外14個人的，只是曝光時間不同。三張圖中的所有條帶整齊而且亮度高，表明大家的P38質粒的PCFT增很成功。在酶切點樣中，右邊第一個為Marker,第二個為質粒，第三個為酶切，后面幾個為質粒的PCR圖中條帶較整齊，有些亮度不夠，可能是含量較低。酶切條帶與Marker的條帶基本一致，但亮度稍低，含量較低，但總

13、體來說酶切還是不錯的。顯色后，可以看到有兩個PCR4點和酶切位點，一個質粒，說明雜交結果很好。綜合實驗二.RT-PCR擴增目的基因cDNA(植物基因組DNAI取、酶切及電泳分析；植物RNAI取、定量及電泳分析；RT-PCFT增目白基因cDNA一.實驗目的1.掌握植物基因組DNAI取方法及注意事項，大分子量DN砌子的酶切分析。2 .掌握RNAI取的基本技術，了解RNAI取過程中的各種注意事項。3.學習從細胞或組織的RNM用逆轉錄PCFT增目的基因的技術及操作。二 .實驗原理CTAB可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度時,從溶液中沉淀。通過含有CTA

14、B高鹽抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和細胞碎片沉淀，離心后，溶液分為三層，上層為CTABW核酸的復合物的高鹽溶液。取出上清加入異丙醇使核酸沉淀。RNAI取和DNAI取有類似的地方，因為它們都是核酸，都具有較好的水溶性。提取RNAT先破碎細胞，然后用提取液將RNA容出，反復抽提去除蛋白質，加入乙醇沉淀RNA將RNAt淀溶解備用。逆轉錄PCRRJ用逆轉錄病毒依賴于RNA勺DN磁轉錄合成酶，在反義引物或oligo(dT)的引導下合成mRNAE補的DNAcomplementalDNA,再按普通的PCR勺方法用兩條引物以cDNA模板， 擴增出不含內含子的可編碼完整蛋白的基因。這一DNA勺5,

15、和3,端經改造可直接用于基因工程的表達，因此逆轉錄PCF為了目前獲取目的基因的一條重要途徑。三 .實驗準備1 .實驗材料：普通小麥幼苗2.實驗試劑：TtizolReagent,氯仿，點樣緩沖液Loadingbuffer(10 x),DEPCt理的ddH2Q澳乙咤(EB),異丙醇，RNA莫板，cDNA引物，反轉錄緩沖液，dNTPMML收轉錄酶，RNA卬制齊1J(RNasin),引物(P1、P2),Taq酶及10XPCRS沖溶液，DNA抽提液， .氯仿： 異戊醇(24:1),70%乙醇，EcoRI酶，HindIII酶，TaqDNA!合酶，10X反應緩沖液(含25mmolMgCl03 .實驗儀器：微

16、量移液器，研缽，灌裝液氮，臺式離心機，電泳儀，凝膠成像系統，PCRKC恒溫水浴鍋四.實驗步驟的分離與純化： 稱取小麥葉片400mg，于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉移到離心管中。加入1mlTrizolReagent,室溫放置5min。加入氯仿，劇烈振蕩15sec,1530cx3min。冷凍離心12000rpmx15min。將上清液轉移到另一個離心管中，加預冷異丙醇，混勻，-20C放置20min。冷凍離心12000rpmx10min,棄上清。加入70亞醇于RNA沉淀中并懸浮沉淀，10000rpmX2min,揮發除去乙醇。加入30屋DEPC處理過的ddH2O容解RNA電泳檢測RNA勺反轉錄在PCR

17、f中依次加入RNA莫板5止l引物1LLDEPCH2O6LL混合后，70c水浴5min（破壞二級結構），迅速冰浴5min在管中依次加入（反應體系為20wL）:5xRTbuffer4LLRNasin1LL10mMdNTP2LM-MMLV反轉錄酶1wL置于42c水浴，1h。70C保溫5min（使酶失活）PC即tDDNA在滅菌的PCR管中，依次加入cDNA2區l取10屋PCR產物進行瓊脂糖電泳分析。3.基因組DNAI取及鑒定：基因組DNA勺提取取左右小麥葉片， 在液氮中研磨后放入離心管中， 加入700區1抽提液（65C預熱）鼻M勻，力口8ulRNase室溫靜置2min。放入65C水浴中，裂解30分鐘，

18、期間溫和混勻幾次。取出裂解好的DNA,加入700區l氯仿：異戊醇（24:1）,猛烈混勻，離引物FW11引物AW212xTaqMix10力口ddH2O補足20”94c94c32cycles55c72c72cPCFT物的鑒定wiwiwi,混勻。設置PC強序:180s45s45s45s600s心（12000rpm,10分鐘）。取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入1倍預冷異丙醇，緩慢混勻后，再猛烈混勻，使DN堿團，-20C放置半小時以上。將析出的DNA離心，12000rpm,10分鐘。去掉上清，將沉淀用1ml70%乙醇清洗兩次，揮發除去乙醇，溶于50區lTE或水中。gDNAPCR反應體系：2Xmix

19、15wLFWAWgDNA2區LddH2O11wL共計30LLgDNA酶切反應體系：gDNA30區lEcoRI1區l10 xEcoRIBuffer5lddH2O19”共計55”瓊脂糖凝膠電泳檢測并分析 瓊脂糖凝膠的制備：稱取瓊脂糖加入40mlXTBE緩沖液中，于微波爐中加熱熔解。冷卻至65c時力口入2EB,混勻。 膠板制備：將凝膠梢洗凈擦干，在一端插好梳子。然后倒入熔好的瓊脂糖，待凝膠完全凝固后， 去掉兩端封條， 將凝膠梢移至電泳梢 （梢中已加入XTBE緩沖液） ，拔掉梳子。 加樣：每個樣品中加入1/10體積點樣緩沖液，混勻后小心地加入樣品梢中。 電泳觀察：接通電源，電壓為80V,電泳1小時左右

20、，當澳酚藍到達下沿1-2cm處時，停止電泳。 觀察及照相：將膠板拿出，用自來水沖洗。在紫外燈下觀察結果。五.實驗結果及分析理論上，未降解的總的RNA電泳時，在凝膠中會出現18S和28S對應的條帶。但是在上圖中，許多組都有5條帶，而且有拖尾，說明有基因組DNA勺污染。有些組沒有出現條帶或亮度不夠，說明RNAt降解了，可能是在操作過程中，受到環境中的RNAB的污染，所以在實驗操作中應戴手套，嚴格對實驗材料和電泳系統中的RNAB進行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，要盡量減少電泳時間。圖7上為RT-PCR下為基因組PCR而且基因組PCR勺條帶亮度要高一些，說明基因組片段要比反轉錄得到的片段更大一些。原

21、因是由mRN限轉錄得到的片段不含有內含子，而基因組中含有大量的內含子。圖8中結果顯示，基因組條帶離點樣處很近，而且亮度很高，說明基因組所含DN蛤量很高，片段很大。所有組的條帶并不是很整齊,可能在操作中沒有處理凈蛋白質或在吸取上清液是不小心把蛋白質給吸入了，造成污染。還有組沒有出現條帶，可能是操作中不小心把基因組片段給倒掉了。圖9中所示，小麥基因組酶切后，條帶鋪滿整個泳道，而且亮度很高，說明基因組片段中含有很多的酶切位點，酶切后會有很多大小不一的小片段。個別組的條帶沒有鋪滿整個泳道，說明酶切失敗，可能是酶切時離心管中進水或酶受到了污染。綜合實驗三.T-A克隆（細菌培養、感受態細胞的制備及轉化、T

22、-A克隆的篩選和快速鑒定）一.實驗目的1.學習細菌的培養方法及培養基的配置2,掌握感受態細胞制備和轉化的基本方法3.掌握快速細胞破碎法測定大小不等的眾多的質粒DNA4,掌握菌落PCR快速鑒定克隆二.實驗原理在基因工程實驗和分子生物學實驗中，細菌是不可缺少的實驗材料。質粒的保存、增殖和轉化；基因文庫的建立等都離不開細菌。特別是常用的大腸桿菌。大腸桿菌所用的培養基可以是固體的培養基，也可以是液體培養基。實驗室中最常用的是LB培養基。在培養過程中會有延滯期、對數期、穩定期和衰亡期。受體細胞經過一些特殊方法如電擊法，化學試劑法（CaCl2,RbCl,KCl）等的處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變

23、，成為能允許外源DN粉子進入的感受態細胞。在這個實驗方法中，只需配制一種細胞緩沖液（它可以在室溫下保存，長期使用）。利用破碎細胞緩沖液中的陰離子去污劑-SDS在37c溶解膜蛋白，使細胞破裂，并解聚核蛋白，SDS還能與蛋白質結合形成復合物，使得蛋白質沉淀。利用EDTAS合金屬離子，防止破碎細胞的脫氧核糖核酸酶對DNA勺降解。然后高速離心，去除細胞碎片核大部分的染色體DNAfDRN砥白， 將含有質粒DNA勺上清夜直接進行點樣電泳和分離。在瓊脂糖凝膠上分離開的個組分中，有染色體DNA不同大小的質粒DNA和RNA它們都可以經肉眼觀察或拍照顯示。三.實驗準備1 .實驗材料：大腸桿菌（含質粒）2.實驗試劑

24、：瓊脂粉，胰蛋白月東，酵母提取物，氯化鈉，NaOH氨節青霉素（100mg/mL,破碎細胞緩沖液（50mmol/LTris-HCl、1%SDS2mmol/LEDTA400mmol/L蔗糖、%t酚藍），10mg/ml澳乙%TBE電泳緩沖液（5X）,TaqDNA聚合酶，10X反應緩沖液（含25mmolMgCl2,dNTP點樣緩沖液Loadingbuffer（10 x）：喊酚藍，40%油3 .實驗儀器：微量移液器，DN徼附柱，DNA攵集管，1,5ml離心管，培養皿，立式離心機，培養皿，帶帽試管，涂布器，滅菌鍋，無菌操作臺（含酒精燈、接種環、滅菌牙簽等），恒溫搖床，電泳儀，離心管，Tip,PCFT增儀，

25、臺式離心機，恒溫水浴四.實驗步驟1 .LB培養基的配制：配制每升培養基，應在950m1去離子水中加入：細菌培養用胰蛋白月東10g細菌培養用酵母提取物5gNaCl10g搖動容器直至溶質完全溶解，用1mol/LNaOH調節pH位至。加入去離子水至總體積為lL,在15lbf/in2x105Pa）高壓下蒸氣滅菌20分鐘。這樣得到是LB液體培養基。LB固體培養基是在其液體培養基的基礎上另加瓊脂粉15g/L。2 .細菌的培養：在液體培養基中培養過夜培養 取5ml液體培養基加入一只無菌的試管中。 用接種環或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養液中。 蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37c過夜培養。大體

26、積培養 按1：100(V/V)的比例將過夜培養物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應該是培養液體積的5倍以上。 于37C,約200r/min劇烈搖動培養。在固體培養基中培養細菌在固體培養基上培養主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落 采用無菌技術，用接種環將接種物從平板的一側開始劃線。 重新消毒接種環，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分,重復劃線直至覆蓋整個平板 于37c培養直至長出單菌落。3,感受態細胞的制備CaCl2方法）： 從LB固體平板挑單克隆于5mlLB液體培養基中（不加抗生素），37cx200rpmx12-16h,可過夜培養。 將活化菌體按15%接種到LB中， 擴大培

27、養37CX200rpmX2h,至OD600勺為。取培養好的菌液ml于一離心管中，4C離心8000rpmX1min。 棄上清，力口500”CaCl2（滅菌預冷）洗菌體，4c冷凍離心8000rpmx1min。徹底除去殘液，加200區lCaCl2（滅菌預冷），懸浮菌體。4C冷凍離心8000rpmX1min。 棄上清，力口100”CaCl2（滅菌預冷），懸浮菌體，即為制備好的感受態細胞。4 .大腸桿菌的轉化： 將連接產物加入1001制備好的感受態細胞，冰上放置20min。42C熱激90s。 迅速冰浴3min。 加入800屋LB液體培養基，37c輕搖90rpm培養45min。30屋X-gal和6履IPT

28、G混勻涂布在含有50g/ml氨節的LB固體培養平板中 取菌液100口涂板。37C倒置，避光培養16-20h。 藍白斑篩選，挑取單菌落進行菌落PC建定。5 .克隆的篩選和快速鑒定（菌落PCR快速鑒定法）：直接用牙簽或接種針挑取少許菌體加入25w1或50/PC皈應體系中。用通用引物或特異引物進行PCR根據擴增條帶的有無和大小來判斷插入片段的有無、大小及方向（反應體系參照前面實驗）。試齊體積（20口）ddH2O8plPrimerP1(10M1plPrimerP2(10M1pl模板1個菌落或菌落稀釋液2*Taq酶Mix五.實驗結果及分析圖10中的結果可以分為三種： 第一種是只有一條亮帶， 與Marker中原來的DNA置相同，這是想要得到的結果；第二種是沒有條帶，可能是挑取了藍斑菌落或假陽性菌落，或者沒有點上樣；第三種是出現兩條帶或拖尾現象，可能是非特異擴增的結果。綜合實驗EGF質粒的提取（GFP質粒的提取、轉化、表達）一.實驗目的1、學習堿裂解法提取質粒的原理2、掌握感受態細胞制備和轉化的基本方法二.實驗原理即實驗一中的堿裂解法原理和實驗三中感受態細胞制備及轉化原理。三.實驗準備即實驗一和實驗三中和GFP有關的試劑及實驗用品。四.實驗步