1、合肥學院學報(自然科學版Journal of Hefei University(Natural Sciences微生物酶資源的開發和利用(上潘仁瑞1,2,吳克1,蔡敬民1(1.合肥學院生物與環境工程系,合肥2300222;2.中國科學技術大學生命科學學院,合肥230026摘要:概括介紹了微生物酶資源的開發和應用進展,內容包括世界和我國工業酶制劑生產概況,開發酶制劑新品種的重要性和有利條件,快速開發具有應用價值新酶的途徑,微生物酶的應用方式和應用領域以及130余種微生物來源的酶在實際中的應用簡況。關鍵詞:微生物;酶工程;工業酶制劑;定向進化中圖分類號:Q814.9文獻標識碼:A文章編號:1673

2、-162X(200501-0007-05近年來,酶工程的研究開發和推廣利用已成為生物技術中的重要領域。作為生物技術的一個重要組成部分,它可以廣泛應用于工業、醫藥、農業、環境保護、化學分析、新能源開發以及生命科學理論研究等許多方面。隨著酶工程研究的快速進展,與之相對應的酶工程產業的發展也非常迅速,是本世紀最具有發展前途的產業之一。酶工程是研究酶的基礎理論、生產和應用的一門學科,它是按人為預先設計的方案進行酶的鑒定、分離純化,研究其結構和功能的關系、酶源生物的誘變育種、酶分子修飾和酶基因改性、酶基因的克隆和表達以及酶的大量生產和應用的系統工程。其發展必將促進生物技術產業的發展,從而對人類社會的經濟

3、生活產生重大影響。自然界中,酶的來源廣泛,它可以來自動物、植物和微生物。迄今已發現的酶有5000余種,其中已經利用的有150種左右,工業化生產的酶約60余種,僅占已知酶的1.2%,而大規模生產的只有20多種,主要是利用微生物通過發酵法生產的。這是由于微生物不受季節、氣候和地域的限制。微生物繁育速度快、品種繁多、易培養、產量高,并且一般由動植物生產的酶大部分可以由微生物制備,或將動植物的酶基因克隆后,在微生物細胞中表達,故可以在短時間內生產大量酶制劑。所以微生物是生產酶的重要來源,對微生物酶資源的開發和應用也就越來越顯得重要。1世界工業酶制劑生產概況酶從生物材料中被分離出來,并作成一種制劑,最早

4、的報道是1833年法國化學家A.Payen和Per oz 在麥芽抽提物的酒精沉淀內發現一種對熱不穩定的物質,它具有從不溶性的淀粉顆粒內分離出可溶性的糊精和糖的能力,命名為diastase(具有分離之意,麥芽淀粉酶、淀粉酶制劑,可以認為這是制備酶制劑的萌芽。事實上他們還首創了“酶”的詞尾2ase,一直被沿用至今。1874年,丹麥出現凝乳酶的廣告,它是從小牛第4胃的胃液和粘膜制備的,應用于制造干酪,這是酶制劑商品化的開始。1894年,日本高峰讓吉博士以麩皮培養米曲霉,用水提取后,也用酒精沉淀獲得淀粉酶,應用于棉布退漿和作消化劑,以后在美國開設Takam ine制藥廠生產高峰(他卡淀粉酶,真正實現了

5、微生物酶制劑的工業化生產。此后的發展比較緩慢,直到1939年才改為使用枯草芽孢桿菌的2淀粉酶。20世紀四五十年代隨著抗生素深層發酵和菌種選育技術的進步,帶動了微生物酶制劑工業的發展。1941年丹麥成立了以微生物酶制劑的主要產品的Novo2nordisk(諾沃諾德公司;到八九十年代,國際上知名的酶制劑企業有70余家。由于世界市場經濟的發展,經過激烈的兼并和改組,迄今在世界酶制劑市場中,丹麥的Nov ozy mes公司(90年代中期由諾沃諾收稿日期:2005-02-25基金項目:安徽省自然科學基金(03043104、01043102、050450304,安徽省科技廳優秀青年科技基金(0404305

6、1,安徽省教育廳自然科學基金(2005KJ192項目資助。作者簡介:潘仁瑞(1933-,男,江蘇常州人,教授,研究方向:微生物工程、蛋白質工程;吳克(1964-,男,安徽合肥人,教授,研究方向:環境工程、酶工程;蔡敬民(19632,安徽合肥人,教授,合肥學院副院長,研究方向:生物工程、環境工程及酶學。8合肥學院學報(自然科學版第15卷德公司改組而成獨占世界市場的40%,先后推出500多種酶制劑產品,銷售遍及130多個國家和地區;美國Genencor國際公司則占20%,從而使該兩大公司具有了強大的競爭力。企業的兼并同時促進了人才的流動,技術的重組和優化,大大縮短新產品的開發周期,擴大了酶的數量及

7、應用領域。微生物酶制劑的世界市場規模在1978年還不足2億美元,到1990年增至5億美元。1993年以來世界工業用酶制劑的銷售和1997年以來酶制劑在各種應用行業所占的份額概況分別見表1和表2。表11993-2002年世界工業用微生物酶制劑銷售概況由上述可得,1990年銷售額是1978年的2.5倍,而2002年銷售額是1990年的5.14倍;表明1990年以來由于酶制劑的廣泛使用,使相關企業在降低生產成本,改善產品品質,減少環境污染等方面獲得了顯著的效益;又由于微生物產物篩選、發酵和育種技術的改進,特別是遺傳工程用于菌種改良,新酶品種不斷出現,應用領域繼續擴大,使酶的產量迅速增長。再從表2可見

8、,在1997-2002的6年間,酶制劑銷售市場在各行業中的分配,食品和飼料業占總額的份額高達45.0%47.0%。洗滌和清洗劑占31.8%33.0%,紡織、制革和毛皮占10.0%11.0%,造紙和紙漿占6.5%7.5%;化學工業占3.7%4.0%。年平均增長率為12.2%,其中造紙和紙漿用酶增長最高,達16.2%。與1985年食品工業占酶制劑市場62%、洗滌用酶占33%、紡織制革占5%相比,洗滌用酶所份額基本保持不變,紡織、制革成倍增長,造紙業增長更快,而食品用酶所份額則相對下降。預計2008年世界酶制劑市場規模將達30億美元。2我國工業酶制劑生產概況1965年在輕工業部的主持下成立了無錫酶制

9、劑廠,這是我國首家采用現代發酵技術生產酶制劑的專業廠。為了促進微生物工業與酶制劑工業的發展,1970年在中國科學院和原國家科委主持下,舉辦了全國微生物展覽會,同時召開全國酶制劑生產和應用座談會,輕工業部又于1976年成立了行業協會。至此,全國已開設酶制劑廠近20家。隨著改革開放,國外酶制劑產品進入國內市場,接著外資和國外先進技術也被引進。1994年丹麥諾維信(Novozy mes公司的前身諾沃諾德公司董事會通過了在中國實施戰略投資計劃,迄今已累計投資1.8億美元,是外商在中國生物技術領域中最大的一筆投資,在北京成立子公司總部和研發中心,在天津、沈陽和蘇州建立生產基地,其公司產品占中國工業酶制劑

10、市場的份額高達50%。另一個國際酶制劑工業巨頭美國Genecor公司則和我國最大的酶制劑企業無錫酶制劑廠實行強強聯合,組建了杰能科(中國生物工程公司,其產品占中國酶制劑市場約20%的份額。外資進入國內市場,帶來了先進的生產技術和經營管理模式,促進功能酶制劑工業的發展,當時全國具有一定規模的酶制劑廠約有50家,其中有20多家的產品占國內行業的80%以上,酶制劑品種增加到20余種。1970年我國生產工業酶制劑僅2kt,到1985年增至21kt,15年間產量增加了近10倍;至1995年,與1970年相比,增加了97倍;至2000年,30年間約增加了160倍。1991-2001年我國酶制劑工業生產概況

11、見表3。表319912001年我國工業酶制劑的產量及品種結構淀粉加工用酶/%8687868280818380-其他/%1413141820191720-從表3可見,雖然我國酶制劑產量逐年增加,但酶的品種結構極不合理;1993年以前淀粉加工用酶占總產量的85%以上,1994年以來,由于新產品的增加,上述比例稍有下降,但仍維持在80%左右。國內的酶制劑企業還面臨外資企業的激烈競爭,目前市場銷售額外資和合資企業約占70%,而非外資企業僅占30%的份額;同時還存在著規模小,菌種選育和發酵水平偏低,生產成本較高,新產品、新技術和新應用領域的研究開發滯后等問題。近年來,由于受全球市場經濟一體化的影響,我國

12、的產業結構也在調整,企業也在向規模化、集約化、效益化發展;在工業酶制劑產量增長的同時,企業數減少,品牌集中度提高。目前全國酶制劑生產企業約30余家,其中年產萬噸以上的企業達10家,酶制劑的出口量也在逐年增加。企業平均規模增大,加大了技術投入,進行設備改造,引進技術和管理人才,生產的穩定使生產成本進一步下降,增加了企業的風險抵抗和對市場的承受能力,這是中國酶制劑行業走向真正發展的重要標志。3開發酶制劑新品種的重要性和有利條件目前作為生物技術的重要組成部分的酶工程已在國民社會經濟中發揮了巨大作用,酶制劑工業得到了迅速發展。酶的特性表現在于常溫常壓下、簡單的設備中即可發生催化反應,其本身為蛋白質,無

13、毒性,易調控,作用底物專一,比一般化學催化劑的效率高,對于在構型不同的物質分子可以起轉化或拆分作用,使其廣泛地應用在食品、釀造、紡織、制革、造紙、醫學、畜牧、日化和環境保護等諸多行業中。縱覽當今世界的酶制劑工業研究和發展動向,主要表現在國外酶制劑公司的兼并重組,酶制劑工業的發展具有壟斷化趨勢,加以大量資源投入,大力開發、研制新酶種和新用途,并應用高新技術生產酶制劑,酶的品種多樣化等特點。而我國的酶制劑行業與發達國家相比,與大企業相比,還存在著很大差距,在技術方面表現為:酶的品種少,菌種選育和發酵水平低以及新技術、新產品、新應用領域研究開發滯后等。為使我國酶制劑工業得以健康持續快速的發展,盡快適

14、應國民經濟發展的需要,必須加大科技和生產投入,積極推廣新技術、新工藝,提高酶的質量,擴大酶的品種范圍,加大微生物酶新的菌種開發,以期調整產品結構,參與國際競爭。在這一系列的行動中開發新的微生物酶的品種尤為重要,它對酶產品的結構調整起到了很大作用。同時新的酶品種開發和應用,大多屬于自我創新,擁有自主知識產權,有利于推動我國酶制劑行業的高速發展。我國具有新的微生物酶品種開發得天獨厚的有利條件。我國微生物資源豐富,從陸生、海洋到極端環境中都可以獲得大量產酶微生物菌種,從而發現、研制和開發新酶種;此外我國還擁有歷史悠久的固態發酵技術,這為酶的生產打下了良好基礎;并且,我國還擁有大批的生命科學工作者,通

15、過他們的努力,再加上新科學、新技術的推廣應用,如基因工程、蛋白質工程和定向進化(directed evoluti on 技術以及其他各種高新技術等在新酶種開發中應用。自然界中蘊藏著巨大的微生物資源,這些資源被認為是待開發的優勢資源。據測算1g 土壤中含有約1億個微生物,1mL 海水中也約有10萬個真菌、100萬個細菌。因此對這兩大類資源寶庫的開發具有重要意義。我們可以從土壤、腐木篩選相應的產酶微生物,從污水中篩選各種能夠產生分解糖類、脂類、蛋白質、纖維素、木質素、環烴、芳香物質、有機磷農藥、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物。在極端環9第1期潘仁瑞,等:微生物酶資源的開發和利用(上01合肥

16、學院學報(自然科學版第15卷境條件下,可篩選嗜熱微生物、嗜堿微生物、嗜鹽微生物、嗜酸微生物、耐高壓微生物等,并開發極端微生物酶品種。此外,還應加大海洋微生物分離鑒定工作,建立微生物培養體系和相關酶活力測定手段和方法,探索新的酶種。4快速開發具有應用價值新酶的途徑微生物在自然界數十億年的進化過程中,各類微生物都形成了一套適合自身在不同環境條件下進行新陳代謝的酶系。當人們將這些生物催化劑應用于工業過程中進行催化反應時,由于酶是由蛋白質構成,常常遇到酶的穩定性下降,不能適應極端的工藝條件,以及產物的抑制作用等問題。為了尋找具有新的功能和特性的酶,傳統的方法是從自然界分離新的菌種,通過篩選獲得新酶,再

17、通過人工突變,篩選適合工藝條件的酶系,然后進行工業生產。但這一過程費時較長,經常要花費數年時間的努力。另一條途徑是改造現有的酶,在20世紀60年代,主要采用對酶分子進行修飾或固定化處理;70年代開始采用基因工程的方法,來提高酶的產量。80年代又出現以計算機三維結構模擬預測和基因定點突變為基礎的蛋白質工程,通過改變酶基因DNA的某些核苷酸序列,從而改變酶蛋白的某些特性,例如提高熱穩定性、pH適應性、抗氧化等特性。但這一技術的應用必須了解酶蛋白的一級結構和三維空間結構,搞清楚結構與功能之間的關系,所以其應用面有一定的局限性;而在我國目前的技術條件下,也要經過數年的努力才能達到這一要求。微生物的蛋白

18、質基因在自然進化的過程發生突變的幾率較小,自然選擇使進化方向有利于生物適應生活環境的方向發展;人工選擇則可使進化朝適合人類需求的方向發展。人們設想是否可以在實驗室模仿自然進化的過程,在短時間內完成漫長的自然進化過程。關于蛋白質和酶分子體外分子進化(in vitr o molecular evoluti on的研究,歸納起來有兩種設計理念:一種是理性的設計(rati onal design在已經獲得蛋白質晶體結構信息的情況下,按照計算機模擬試驗的預測,然后進行定點突變以改造蛋白質的性狀,即上面提到的蛋白質工程;另一種是非理性的設計,由于對于大多數蛋白質分子的空間結構了解甚少,則可以根據人為設定的

19、目標,對特定蛋白質的性質,通過DNA分子隨機突變、隨機重組和定向篩選,使之適合人類的需要,可以在較短時間內完成漫長的自然進化過程,這一技術被稱之為定向進化。美國Affy max研究院的Ste mmer在1994年首先報道了一種簡單、快速而有效的體外定向進化技術,稱之為DNA隨機拼接(DNA shuffling,可以對單一基因、家族基因、質粒、代謝途徑、部分甚至整個基因組進行改造。現將其操作流程和基本原理簡介如下:(1在獲得目的基因的DNA片段后,在Dnase I的作用下隨機消化,隨機片段的大小,視整個目的DNA的長度而定,通常是50100bp。(2進行無引物的PCR/重組裝PCR(rease

20、mbly PCR:由于沒有額外添加引物,在變性、退火過程中,在DNA聚合酶的作用下,根據不嚴格的序列同源性,小片斷間會進行隨機的群體性配對(pool w ise。由于配對的不精確性,就會引入突變和重組,其突變形式多樣,包括點突變、缺失、插入、顛倒、整合等類型。經過多輪循環,不斷延伸,并重新組裝成完整長度的核酸序列,這一過程稱之為再組裝PCR。(3引物PCR、基因表達和篩選:添加引物進行常規PCR,以擴增無引物PCR中產生的重組裝產物,然后將其插入合適的表達載體,轉化宿主進行表達,通過選擇壓力的設置、模型的建立進行定向選擇或篩選。篩選方法可以采用常規的瓊脂平皿,根據目的不同選擇特定的底物,有的可

21、再加顏色指示劑,根據菌落周圍透明圈或顏色圈來選擇陽性突變體,淘汰陰性和中性的突變體,但此法不能精確定量。也可采用高通量篩選(H igh thr oughput screening,此法是以96-微孔板或384-微孔板作為實驗工具,酶作用的底物和生成的產物不必分離,以自動化系統執行實驗過程,以靈敏快速的檢測儀器采集數據,例如熒光檢測系統,用計算機處理數據。使檢測過程標準化、定量化,大大加快篩選速度。利用此篩選程序能鑒定出酶對底物的特異性、熱穩定性、對映體選擇性及其他特定的性狀。所獲得的陽性突變體,可以作為下一輪篩選的目的基因。用于定向進化的方法還有:通過易錯PCR(err or p r one

22、PCR或致突變菌株(mutalt or strain產生隨機突變、化學誘變劑介導的隨機突變、限制性酶切再連接介導的基因重組(Recombining the genes by re2stricti on and religati on、隨機引導重組(Rando m p ri m ing recombinati on和交錯延伸技術(Staggered extensi on p r ocess等。利用定向進化的方法改造工業用酶已取得初步成效:Ste mmer(1994使-內酰胺酶對新底物cef o2 taxi m e的活性提高了32000倍,酶分子中有6個氨基酸發生突變。Zhang等(1997改造-

23、半乳糖苷酶,其底物特異性提高了1000倍,酶活性提高66倍,有6個氨基酸發生突變。Zhao等(1998在保持酶活力不變的條件將枯草桿菌蛋白酶E的作用溫度提高了17,Matsu mura等(1999提高了-葡萄糖苷酸酶對戊二醛和甲醛的抗性,酶分子有6個氨基酸發生突變。以上是單基因酶定向改造的幾個實例,對于家族基因酶的應用也有報道。Giver等(1998使對-硝基苯酯酶的活力提高了56倍,熱穩定性的T m值提高14。Ku ma maru等(1998報道能提高聯苯雙加氧酶對環境污染物聚氯化聯苯降解的底物專一性和活性。Kikuchi等(1999使兒茶酚雙加氧酶的熱穩定性提高了1326倍。利用DNA隨機拼接技術,通過多種突變,可以有效協調一個代謝途徑中不同基因間的相互作用,使總的代謝效果迅速進化。例如,Cra men等(1997報導應用于砷酸鹽的解毒途徑,使對砷酸鹽的抗性提高40倍,這是用其他策略難以做到的。5微生物酶的應用方式酶的應用方式可以是直接使用某一種酶催化某一化學過程