1、w.w.w.k.s.5.u.c.o.m選修3一、  基因工程1、（a）基因工程的誕生（一）基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，又叫做DNA重組技術。2、（a）基因工程的原理及技術原理：基因重組技術：（一）基因工程的基本工具1.“分子手術刀”限制性核酸內切酶（限制酶）（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯

2、鍵斷開，因此具有專一性。（3）結果：經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。2.“分子縫合針”DNA連接酶(1)兩種DNA連接酶（E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶）的比較：相同點：都縫合磷酸二酯鍵。區別：E·coliDNA連接酶來源于T4噬菌體，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。(2)與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。3.“分子運輸

3、車”載體（1）載體具備的條件：能在受體細胞中復制并穩定保存。具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。（2）最常用的載體是質粒,它是一種裸露的、結構簡單的、獨立于細菌染色體之外，并具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子。（3）其它載體： 噬菌體的衍生物、動植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的獲取1.目的基因是指： 編碼蛋白質的結構基因 。2.原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法_和化學合成法_。3.PCR技術擴增目的基因（1）原理：DNA雙鏈復制（2）過程：第一步：加熱至9095DNA解鏈

4、；第二步：冷卻到5560，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至7075，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。第二步：基因表達載體的構建1.目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。2.組成：目的基因啟動子終止子標記基因（1）啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。（2）終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段 ，位于基因的尾端。（3）標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。

5、第三步：將目的基因導入受體細胞_1.轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2.常用的轉化方法：將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是 農桿菌轉化法，其次還有 基因槍法和 花粉管通道法等。將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是 顯微注射技術。此方法的受體細胞多是 受精卵。將目的基因導入微生物細胞：3.重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達。第四步：目的基因的檢測和表達1.首先要檢測 轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術。2.其次還要檢測 目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是采用

6、用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。3.最后檢測 目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取 蛋白質，用相應的 抗體進行 抗原抗體雜交。4.有時還需進行 個體生物學水平的鑒定。如 轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。（三）（b）基因工程的應用1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物的品質。2.動物基因工程：提高動物生長速度、改善畜產品品質、用轉基因動物生產藥物。3.基因治療：把正常的外源基因導入病人體內，使該基因表達產物發揮作用。（四）（a）蛋白質工程的概念蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造

7、，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質）（1）蛋白質工程崛起的緣由：基因工程只能生產自然界已存在的蛋白質（2）蛋白質工程的基本原理：它可以根據人的需求來設計蛋白質的結構，又稱為第二代的基因工程。基本途徑：從預期的蛋白質功能出發，設計預期的蛋白質結構，推測應有的氨基酸序列，找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）設計中的困難：如何推測非編碼區以及內含子的脫氧核苷酸序列二、細胞工程（一）植物細胞工程 1.理論基礎（原理）：細胞全能性2.植物組織培

8、養技術（b）（1）過程：離體的植物器官、組織或細胞 愈傷組織 試管苗 植物體（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細胞產物的工廠化生產。A 植物繁殖微型繁殖：可以高效快速地實現種苗的大量繁殖作物脫毒：采用莖尖組織培養來除去病毒（因為植物分生區附近的病毒極少或沒有）人工種子：以植物組織培養得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經人工薄膜包裝得到的種子。優點：完全保持優良品種的遺傳特性，不受季節的限制；方便儲藏和運輸B 作物新品種培育單倍體育種：a過程：植株（AaBb）通過減數分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四種類型）；對花粉進行花藥離體培養（技術是植物組織培養）；得到

9、單倍體植株；對其幼苗時期進行秋水仙素處理；得到了正常的純合二倍體植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四種類型）。b 優點：明顯縮短育種年限C 突變體利用：在組織培養中會出現突變體，通過從有用的突變體中選育出新品種（如篩選抗病、抗鹽、含高蛋白的突變體）D 細胞產物的生產：通過能夠產生對人們有利的產物的細胞進行組織培養，從而讓它們能夠產生大量的細胞產物。（3）地位：是培育轉基因植物、植物體細胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。植物細胞A植物細胞B雜種細胞愈傷組織雜種植株圖（2）3.植物體細胞雜交技術（1）過程：（2）誘導融合的方法：物理法包括離心、振動、電刺激等。化學法一般是用聚乙二醇（P

10、EG）作為誘導劑。（3）意義：克服了遠緣雜交不親和的障礙。（二）動物細胞工程 1. 動物細胞培養（a）（1）概念：動物細胞培養就是從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和繁殖。（2）動物細胞培養的流程：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）剪碎用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞制成細胞懸液轉入培養瓶中進行原代培養貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞繼續傳代培養。（3）細胞貼壁和接觸抑制：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。細胞數目不斷增多，當貼壁細胞分裂生長到表面相互抑制時，細胞就會停止分裂增殖，

11、這種現象稱為細胞的接觸抑制。（4）動物細胞培養需要滿足以下條件無菌、無毒的環境：培養液應進行無菌處理。通常還要在培養液中添加一定量的抗生素，以防培養過程中的污染。此外，應定期更換培養液，防止代謝產物積累對細胞自身造成危害。營養：合成培養基成分：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。溫度：適宜溫度：哺乳動物多是36.50.5；pH：7.27.4。氣體環境：95%空氣5%CO2。O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養液的pH。（5）動物細胞培養技術的應用：制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質、培養醫學研究的各種細胞。2.動物體細胞核移植技術和

12、克隆動物（1）哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植（比較容易）和體細胞核移植（比較難）。（2）選用去核卵(母)細胞的原因：卵(母)細胞比較大，容易操作；卵(母)細胞細胞質多，營養豐富。（3）體細胞核移植的大致過程是：高產奶牛（提供體細胞）進行細胞培養；同時采集卵母細胞，在體外培養到減二分裂中期的卵母細胞，去核（顯微操作）注：為什么要用卵細胞？它可以提供充足的營養；操作簡便；細胞質不會抑制細胞核全能性的表達；將供體細胞注入去核卵母細胞；通過電刺激使兩細胞融合，供體核進入受體卵母細胞，構建重組胚胎；將胚胎移入受體（代孕）母牛體內；生出與供體奶牛遺傳基因相同的犢牛（4）體細胞核移植技術的應用：加速家

13、畜遺傳改良進程，促進良畜群繁育；保護瀕危物種，增大存活數量；生產珍貴的醫用蛋白；作為異種移植的供體；用于組織器官的移植等。（5）體細胞核移植技術存在的問題：克隆動物存在著健康問題、表現出遺傳和生理缺陷等。3.動物細胞融合（1）動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。（2）動物細胞融合與植物原生質體融合的原理基本相同，誘導動物細胞融合的方法與植物原生質體融合的方法類似，常用的誘導因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。（3）動物細胞融合的意義：克服了遠緣雜交的不親和性，成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫

14、瘤和生物生物新品種培育的重要手段。（4）動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較：細胞工程植物體細胞雜交動物細胞融合理論基礎細胞的全能性、細胞膜的流動性細胞增殖、細胞膜的流動性融合前處理酶解法去除細胞壁（纖維素酶、果膠酶）注射特定抗原，免疫處理正常小鼠誘導手段物理法:離心、振動、電激化學法：聚乙二醇（PEG）物理法:離心、振動、電激化學法：聚乙二醇生物法：滅活的病毒（滅活的仙臺病毒）誘導過程第一步：原生質體的制備（酶解法）第二步：原生質體融合（物、化法）第三步：雜種細胞的篩選和培養第四步：雜種植株的誘導與鑒定正常小鼠免疫處理動物細胞的融合（物、化、生法）雜交瘤細胞的篩選與培養專一抗體檢驗陽性細胞培養

15、單克隆抗體的提純用途和意義克服遠緣雜交的不親和障礙，大大擴展雜交的親本組合范圍應用：白菜-甘藍等雜種植株（1） 制備單克隆抗體（2） 診斷、治療、預防疾病，例如“生物導彈”治療癌癥4.單克隆抗體（1）抗體：一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產量低、純度低、特異性差。（2）單克隆抗體的制備過程：對免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠產生了效應B細胞）；提取B淋巴細胞；同時用動物細胞培養的方法培養骨髓瘤細胞并提取；促使它們細胞融合注：融合的結果是有很多不符合要求的；如有2個B淋巴細胞融合的細胞等，所以要進行篩選；在特定的選擇培養基上篩選出融合的雜種細胞特點是能迅速大量增殖，

16、又能產生專一的抗體；然后對它進行克隆化培養和抗體檢測篩選出能夠分泌所需抗體的雜種細胞；最后將雜交瘤細胞在體外做大規模培養或注射入小鼠腹腔內增殖，從細胞培養液或小鼠腹水中可得到大量的單克隆抗體。（3）雜交瘤細胞的特點：既能大量繁殖，又能產生專一的抗體。（4）單克隆抗體的優點：特異性強，靈敏度高，并能大量制備。（5）單克隆抗體的作用：作為診斷試劑：準確識別各種抗原物質的細微差異，并跟一定抗原發生特異性結合，具有準確、高效、簡易、快速的優點。用于治療疾病和運載藥物：主要用于治療癌癥治療，可制成“生物導彈”，也有少量用于治療其它疾病。三、胚胎工程（一）動物胚胎發育的基本過程（1）精子的發生：補充，精原

17、細胞先進行有絲分裂后進行減數分裂；變形過程中，細胞核為精子頭的主要部分，高爾基體發育為頂體，中心體演變為精子的尾，線粒體在尾基部形成線粒體鞘膜，其他物質濃縮為原生質滴直至脫落。線粒體為精子運動提供能量（2）卵子的發生：在胎兒時期，卵原細胞進行有絲分裂演變成初級卵母細胞被卵泡細胞包圍，減一分裂在排卵前后完成，形成次級卵母細胞和第一極體進入輸卵管準備受精；減二分裂是在受精過程中完成的。（3）受精：精子獲能（在雌性動物生殖道內）；卵子的準備（排出的卵子要在輸卵管中進一步成熟到減二中期才具備受精能力）；受精階段卵子周圍的結構由外到內：放射冠、透明帶、卵黃膜，a頂體反應：精子釋放頂體酶溶解卵丘細胞之間的

18、物質，穿越放射冠。b透明帶反應：頂體酶可將透明帶溶出孔道，精子穿入，在精子觸及卵黃膜的瞬間阻止后來精子進入透明帶的生理反應它是防止多精子入卵受精的第一道屏障；c卵黃膜的封閉作用：精子外膜和卵黃膜融合，精子入卵后，卵黃膜會拒絕其他精子再進入卵內的過程它是防止多精子入卵受精的第二道屏障；精子尾部脫落，原有核膜破裂形成雄原核，同時卵子完成減二分裂，形成雌原核注意：受精標志是第二極體的形成；受精完成標志是雌雄原核融合成合子。（4）胚胎發育：a卵裂期：細胞進行有絲分裂，數量增加，胚胎總體積不增加；b桑椹胚：32個細胞左右的胚胎之前所有細胞都能發育成完整胚胎的潛能屬全能細胞；c囊胚：細胞開始分化，其中個體

19、較大的細胞叫內細胞團將來發育成胎兒的各種組織；而滋養層細胞將來發育成胎膜和胎盤；胚胎內部逐漸出現囊胚腔注：囊胚的擴大會導致透明帶的破裂，胚胎伸展出來，這一過程叫孵化；d原腸胚：內細胞團表層形成外胚層，下方細胞形成內胚層，由內胚層包圍的囊腔叫原腸腔。細胞分化在胚胎期達到最大限度9 胚胎工程的理論基礎（識記）（1）胚胎工程的概念及技術手段：對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養等技術。（2）體外受精屬有性生殖過程：a卵母細胞的采集和培養 對體型小的動物用促性腺激素處理，從輸卵管沖取卵子（可直接受精）；對體型大的動物從卵巢中采集卵母細胞（要

20、在體外培養成熟）b精子的采集 假陰道法、手握法和電刺激法；獲能 對嚙齒動物、兔、豬等的精子用培養法（放入人工配制的獲能液中）；對牛、羊等精子用化學法（放在肝素或鈣離子載體溶液中）（3）胚胎的早期培養：a培養液成分：無機鹽、有機鹽、維生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等注意與動物細胞培養液成分的比較；b當胚胎發育到適宜的階段時，可將其取出向受體移植或冷凍保存。（4）胚胎移植：a概念：將雌性動物的早期胚胎移植到同種的、生理狀態相同的其他雌性動物的體內，使之繼續發育為新個體的技術。是生產胚胎的供體和孕育胚胎的受體共同繁殖后代的過程，通過轉基因、核移植、體外受精獲得的胚胎必須移植給受體才能獲得后代。b優

21、勢：可以充分發揮雌性優良個體的繁殖潛力，縮短供體本身的繁殖周期。c胚胎移植的生理學基礎：同種動物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的對供體和受體進行同期發情處理；早期胚胎形成后處于游離狀態，為胚胎的收集提供可能；受體對移入子宮的外來胚胎基本不發生免疫排斥反應；移入受體的供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受影響。d胚胎移植的程序：對供、受體母牛進行選擇，用激素進行同期發情處理；對供體母牛用激素做超數排卵處理；選擇同種優秀公牛配種有性生殖過程；對胚胎進行收集此時胚胎處于游離狀態；對胚胎進行質量檢查此時胚胎應發育到桑椹胚或囊胚；胚胎移植或冷凍保存；檢查受體母牛是否受孕；產下胚胎移植的犢牛。（5）胚胎分

22、割：a概念：用機械方法將早期胚胎切割成2、4、8等分等，經移植獲得同卵雙胎或多胎的技術可看作是動物無性繁殖或克隆b基本過程：選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養皿中，用分割針或分割刀片將其切開，吸出其中的半個胚胎注入透明帶中或直接移植給受體。注意：內細胞團要均等分割，否則會影響胚胎的恢復和進一步發育10 胚胎干細胞的移植（識記）（1）胚胎干細胞的含義：由早期胚胎囊胚或原始性腺胎兒中分離出來的一類細胞，又叫ES或EK細胞。（2）特征：形態上體積小、細胞核大、核仁明顯；功能上具有發育的全能性，即可分化為成年動物體內任何一種組織細胞。體外培養下，ES細胞可以只增殖不分化（3）應用：用于治療人類疾病，如利用

23、ES細胞誘導其分化成新的組織細胞特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復。1、胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養等技術。經過處理后獲得的胚胎，還需移植到雌性動物體內生產后代，以滿足人類的各種需求。2、動物胚胎發育的基本過程（1）受精場所是母體的輸卵管。（2）卵裂期：特點：細胞有絲分裂，細胞數量不斷增加，但胚胎的總體體積并不增加，或略有減小。 （3）桑椹胚：特點：胚胎細胞數目達到32個左右時，胚胎形成致密的細胞團，形似桑椹。是全能細胞。（4）囊 胚：特點：細胞開始出現分化（該時期細胞的全能性仍比較高）。聚集在胚胎一

24、端個體較大的細胞稱為內細胞團，將來發育成胎兒的各種組織。中間的空腔稱為囊胚腔。（5）原腸胚：特點：有了三胚層的分化，具有囊胚腔和原腸腔。（二）胚胎干細胞1、哺乳動物的胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或從原始性腺中分離出來。2、具有胚胎細胞的特性，在形態上表現為體積小，細胞核大，核仁明顯；在功能上，具有發育的全能性，可分化為成年動物體內任何一種組織細胞。另外，在體外培養的條件下，可以增殖而不發生分化，可進行冷凍保存，也可進行遺傳改造。3、胚胎干細胞的主要用途是：可用于研究哺乳動物個體發生和發育規律；是在體外條件下研究細胞分化的理想材料，在培養液中加入分化誘導因子，如牛黃酸等化學物質時

25、，就可以誘導ES細胞向不同類型的組織細胞分化，這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段；可以用于治療人類的某些頑疾，如帕金森綜合癥、少年糖尿病等；利用可以被誘導分化形成新的組織細胞的特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復并恢復正常功能；隨著組織工程技術的發展，通過ES細胞體外誘導分化，定向培育出人造組織器官，用于器官移植，解決供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。（三）胚胎工程的應用1.體外受精和胚胎的早期培養(1)卵母細胞的采集和培養：主要方法：用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后，從輸卵管中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。第二種方法：從剛屠宰母畜的卵巢中采集卵

26、母細胞；第三種方法是借助超聲波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。采集的卵母細胞，都要在體外經人工培養成熟后，才能與獲能的精子受精。(2) 精子的采集和獲能：在體外受精前，要對精子進行獲能處理。(3) 受精：獲能的精子和培養成熟的卵細胞在獲能溶液或專用的受精溶液中完成受精過程。(4)胚胎的早期培養：精子與卵子在體外受精后，應將受精卵移入發育培養液中繼續培養，以檢查受精狀況和受精卵的發育能力。培養液成分較復雜，除一些無機鹽和有機鹽外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養成分，以及血清等物質。當胚胎發育到適宜的階段時，可將其取出向受體移植或冷凍保存。不同動物胚胎移植的時間不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚階段才能進行移植，小鼠、家兔等實驗動物可在更早的階段移植，人的體外受精胚胎可在4個細胞階段移植。)2