1、實驗室生物安全管理制度目的：確保實驗人員生物安全，環境不受污染，樣品質量不受影響特制定該 管理制度。一、人員準入條件1、實驗室人員、輔助人員和外來人員必須具備相應的專業技能、受過相關的實 驗室生物安全培訓、了解實驗室潛在的生物危害和特殊要求， 經負責人審批后方 可進入相應的實驗室工作。2、未成年人、孕婦和有免疫缺陷的人員不得進入實驗室，處于易受感染狀態或 感染后果嚴重的額人員也不得進入實驗室。3、實驗室人員必須在身體狀況良好、穿戴好防護服（白大衣）的情況下，方能進入實驗室的污染區域工作。但當身體出現較大的開放性損傷、 處于較重的疾病 感染狀態或呈重度疲勞狀態時不得進入。4、外來參觀人員需經科室

2、負責人同意并在相關人員陪同下方可進入實驗室。二、生物安全日常管理：（一）生物安全行為規范1 .進入實驗室前要摘除首飾，修剪指甲，以免刺破手套。長發應束在腦后，禁 止在實驗室內穿露腳趾的鞋。不得佩戴有可能被卷入機器或可隨人傳染性物質的 飾物。2 .在實驗室里工作時，要始終穿著實驗服，實驗室外禁止穿防護服（白大衣）。 大白衣應定期清洗、更換，清洗時應使用具有殺菌消毒的洗液或其他相應方法。3、操作感染性物質、腐蝕性或毒性物質時須在通風櫥中進行，并佩戴相關的安 全防護用品，如安全鏡、面罩或護目鏡。皮膚受損時應以防水敷料覆蓋。4、當有必要保護眼睛和面部以防實驗對象噴濺、或紫外線輻射時，必須要配戴 護目鏡

3、，面罩（帶護目鏡的面罩）或其它防護用品。5、實驗室工作區不允許吃、喝、化妝和操作隱形眼鏡，禁止在實驗室工作區內 的任何地方貯存人用食品及飲料。6、實驗室防護服不應和日常服飾放在同一柜子。個人物品、服裝和化妝品不應 放在有規定禁放的和可能發生污染的區域。7、不得涉及呼吸道傳播疾病樣品室，要佩戴符合要求的防護口罩。（二）操作準則1、所有樣本、培養物均可能有傳染性，操作時均應帶手套。在認為手套已被污 染時應脫掉手套，馬上洗凈雙手，再換一雙新手套。2、當實驗過程可能涉及到直接或意外接觸到血液、有傳染性的材料或被感染的 動物時，必須要戴上合適的手套，脫手套后必須洗手。在實際或可能接觸了血液、 體液或其他

4、污染材料后，即使戴有手套也應立即洗手。3、不得用戴手套的手觸摸自己的眼、鼻子或其他暴露的黏膜或皮膚。不得帶手 套離開實驗室或在實驗室來回走動。4、嚴格禁止用嘴操作實驗器材，包括吸液、吹酒精燈等。實驗材料禁止放入嘴 里。禁止舔標簽。5、盡量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。破損的玻 璃不能直接用手直接操作，必須用機械方法清除，如刷子、夾子、銀子等。破裂 的玻璃器具和比例碎片應丟棄在有專門標記的、單獨的，不易刺破的容器里。6、所有的實驗步驟都應盡可能使氣溶膠或氣霧的形成控制在最小程度。任何使 形成氣溶膠的危險性上升的操作都必須在生物安全柜里進行。有害氣溶膠不得直接排放。7、應盡

5、可能減少使用利器和盡量使用替代品。包括針頭、玻璃、一次性手術刀 在內的利器，應在使用后立即放在耐扎容器中。尖利物容器應在內容物達到三分 之二前置換。8、所有濺出事件、意外事故和明顯或潛在的暴露于感染性材料，都必須向實驗 室負責人報告。此類事故的書面材料應存檔。9、所有棄置的實驗室生物樣本、培養物和被污染的廢棄物應被假定有傳染性， 在從實驗室中取走之前，應以安全方式處理和處置，使其達到生物學安全。10、實驗室應保持整潔、干凈，當潛在的危險物濺出或一天的工作結束后，所有 操作臺面、離心機、加樣槍、試管架必須擦拭、消毒。11、每日工作完畢，最后一個離開實驗室的人員需關好水、電、門、窗。（三）監督與檢

6、查1、涉及病原體的科室負責人要經常對各項實驗的生物安全性進行檢查和監督。2、各實驗項目主管人員要定期對所開展的實驗工作進行監督與檢查，及時發現 并報告安全隱患事件。三、常見實驗室廢棄品處理實驗室廢棄品按物理類型而言可分為固體廢棄品、液體廢棄品及氣體廢 棄品，就危害類型而驗分為化學毒性廢品和病原性廢品，由于廢棄物品具有潛在的致病性、傷害性，如不妥善處理會造成很大的人身危害、環境污染和社會危害。 根據國家危險廢物品名錄、醫療廢物管理條例、衛生部和國家環境保護 總局制定的醫療廢物分類目錄有關規定的要求，對實驗室廢棄物進行分類， 主要包括感染性廢棄物、病理性廢棄物、損傷性廢棄物、化學性和放射性廢棄物分

7、類特征常見廢棄物名稱處理程序感染性廢棄物攜帶病原微生物具有引發感染性疾病傳播危險的廢棄物包括被感染性實驗材料等污染的物品與器材，如手套、口罩與白大衣、試管、平皿、吸管等實驗器材以及廢棄的感染性實驗標本、培養液、培養 基等。放入盛有適宜消毒液的不易碎 裂的容器中浸泡。注意消毒劑 的種類、濃度及浸泡時間，浸 泡后放入合適的容器內進行高 壓滅菌或焚燒處理病理性廢棄物實驗動物尸體等廢棄物包括廢棄的質粒、細胞、單克 隆課題、臨床、組織樣本及實 驗動物組織、尸體等。集中與實驗室指定位置，嚴格 與感染性生物材料區分，高壓 火菌后廢棄。盛放容器宜浸泡Wo損傷性廢棄物能刺傷或割傷人體的銳器等廢棄物包括醫用枕頭、

8、縫合針、手術刀及破碎玻璃等高壓火菌或焚燒處理，盛放銳 器的一次性容器不易刺破，不 宜將容器裝得過滿（小于四分之三），如感染性廢棄物進行局壓火菌及焚燒處埋化學性、具毒性、腐蝕包括強酸、強堿等有毒有害的強酸強堿等化學性物品須經中放射性廢性、易燃易爆化學性廢棄物一級放射性廢和消除腐蝕行后方可廢弁，其棄物的化學性廢棄棄物等。他物品經稀釋對環境與人體無物及放射性廢毒后可廢弁。含有毒、有害化棄物學物品的實驗材料在使用后應置于帶明顯危險標志的容器內送至指定地點統一處理。四、支持文件1 .中華人民共和國傳染病防治法2 .病原微生物實驗室生物安全管理條例3 .實驗室生物安全通用要求（改變9489-2004）4

9、.微生物和生物醫學實驗室生物安全通用準則（WS233-20035 .實驗室生物安全守則（WHO三版，2004年）6 .病原微生物實驗室生物安全（生物安全培訓衛生部規劃教材，第 2版）7 .醫療廢棄物管理條例8 .實驗室生物安全病毒制備質量管理體系目錄原始病毒的擴增大量病毒制備的滅菌操作病毒制備程序痘苗病毒的收獲和純化腺病毒的收獲和純化病毒滴度測定病毒質控細菌污染及檢測支原體污染及檢測 基因檢測病毒活性檢測體外細胞殺傷復制能力檢測原始病毒的擴增-病毒種子制備一般原始病毒的擴增用優質（無污染-須通過細菌和支原體檢測）CV1 / JH293 細胞，每種原始病毒的擴增需要在一個細胞融合度呈80% （細

10、胞處于對數生長期，活性好，感染效率高）的T175培養瓶中進行：1 .細胞計數： 培養箱中取出細胞，鏡下觀察，將狀態良好，融合度呈80%的細胞移至超凈工作臺。 去除細胞培養瓶中的舊培養基。 PBS?中洗：從無細胞一側加入適量（約 10ml） PBS沖洗細胞后棄上清, 酌情反復12次，以達到徹底洗掉培養基中的血清成份。 消化細胞：加入1ml 0.25%胰酶消化液，使之鋪滿細胞表面，放入培養 箱（37C）作用數分鐘后，把培養瓶放置顯微鏡下觀察，發現細胞回縮變圓，細 胞間隙增大；或肉眼觀察，見到瓶底出現細針孔間隙傾斜瓶子出現流沙樣現象即 可終止消化。 終止消化：輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，從無細胞面側

11、加入適量完全 培養基（含血清的DMEM）終止消化，并用移液管吸吹數次以打散細胞團塊，混 合均勻，使之成為單細胞混合液 計數板準備：用酒精清潔計數板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。 加樣：用移液管輕輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液（可酌情稀釋），在計數板上蓋玻片一側靠虹吸現象加入微量 （約10ul）細胞懸液，使之充滿玻璃 槽，不可產生氣泡，不可溢出外側亦不可溢入對側玻璃槽。 如產生上述情況需對 計數板沖洗拭干重新加樣。 計數：靜置片刻，使細胞沉降到計數板上，不再隨液體漂移，將細胞計 數板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩， 先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡 觀察并計數。由于活細胞的遮光率和液體的折

12、光率相近，觀察時應減弱光照的強 度。 計數時計數區是由16個中方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下 的4個大方格的細胞數，為了保證計數的準確性，避免重復計數和漏記，在計數時，對江隆在格線上的細胞的統計應有統一的規定計數原則：計上不計下，計左不計右！如細胞位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規定計入相應的格中。按下式計算：細胞懸液細胞數/ml =4個大格細胞總數/4 X 10對00釋倍數2 .感染種子：取平行對照培養優質融合度呈80%的細胞，棄舊培養基并 加入含病毒種子的30mL感染培

13、養基（DMEM+10% FBS+1pfu/cel）,輕輕晃動培 養瓶，使病毒在培養基中充分混勻。3 .收集種子：標記病毒種類和培養日期，在37°C, 5% CO條件下培養。 定時（24h/48h/60h/72h）檢查CPE（田胞變圓變亮脫壁，漂浮），待呈80%ffl胞出現 CPE即可收集。將含病毒細胞懸液加入50mL離心管中，標記病毒種類和日期， 凍存于-80 C備用，并測定病毒滴度，以備感染病毒使用。大量病毒制備的滅菌準備工作1,用過的500mL離心瓶泡入酸液中，過夜，沖洗干凈，烤干，高溫滅 菌。2,準備足量T175培養瓶必須泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥, 滅菌包布包被滅菌

14、。3,培養細胞所用的移液管，離心管必須泡入酸液中，過夜，用沖洗干 凈，干燥，滅菌包布包被滅菌。4,離心管泡入酸液中，過夜后再處理，針頭直接滅菌，在移除針頭錢， 確保離心管實在一個大燒杯上，這樣漏液不會污染操作臺。5,研磨器泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥，滅菌包布包被滅 菌。6. Beckman超高速離心機及特制轉子和離心管準備。7. V型槽，96孔板，排槍準備。病毒制備程序細胞準備:1 .建立細胞種子庫：復蘇細胞（CV1用于痘苗病毒病毒；JH293用于腺病毒 病毒）分別于與第3/5/7/14天取上清兩份，一份用于支原體檢測，另一份加至 培養基中放于培養箱中定時鏡下觀測，用于細菌檢測，保證

15、細胞質量。待細胞生長細胞融合度呈80%?肖化傳代擴增并凍存足量細胞種子于液氮中，凍存管上須準 確標記所凍細胞名字，代數，凍存人以及凍存日期等相關信息。（慢凍速溶）2 .細胞擴增培養： 當1瓶T175培養瓶中細胞生長融合度呈80%時，將培養瓶中培養基吸出， 各加入1ml胰酶消化，37 C, 2-3分鐘；加入適量（5ml）完全培養基終止消化， 全部轉移至50ML離心管中，總量為6ml。分別抽取2ml此混合液加入含18ml 完全培養基（含10%血清）的T175培養瓶中共三瓶繼續培養（1傳3）,原瓶繼 續培養待下一次傳代。 繼而同上方法擴增至12瓶T175培養瓶培養（1傳4）細胞生長融合度 呈80%寸

16、同上方法擴增至36瓶為一批（1傳3）,其中1瓶T175培養瓶中細胞作 為平行對照，放入37c CQ孵育箱中培養48-72小時。平行對照培養瓶同時放入 孵育箱，直至融合度呈80%。:.病毒感染: 觀察平行對照培養瓶中細胞生長率呈80%時，準備進行病毒感染；同時 也觀察其它所有細胞，對比細胞增殖速度是否一致。 取平行對照瓶細胞計數，并計算需要感染病毒量(1pfu/cell)0 -80C冰箱中取出測定過病毒滴度的病毒種子，按計算好的病毒量配制1080ml (30ml /瓶刈6瓶)含2%血清的DMEM培養基。放入37c二氧化碳孵育 箱中培養48-72小時，或直到 留0%細胞都出現CPE痘苗病毒的收獲和

17、純化二.病毒收獲：1）從37c二氧化碳孵育箱中取出達到收獲標準的 36瓶T175培養瓶，輕輕晃動 培養瓶，少量貼壁細胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺用移液管輕輕吹打未 脫落細胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。2） 移至高速離心機中配平，3500rpm, 15min, 4c離心。3）棄上清，移液管取10ml冷PBS加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉入 50ml離 心管中。4）方法同上，用冷PBS反復清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉致同一 50ml 離心管中。5） 移至高速離心機中配平，3500rpm, 15min, 4c離心。6）棄上清，4 c取7ml冷VV-Buffer

18、重懸混勻，并凍存于-80 C待純化。四.病毒純化：1）將待純化病毒溶液在液氮與37c水浴鍋中反復凍融三次，使包含于細胞內的 病毒顆粒完全釋放。2）將完全融化的病毒液移至超凈工作臺，加入滅菌的研磨器中勻速緩慢反復研磨60次。3）將研磨好的病毒液轉入 50ml離心管中配平，1200rpm, 5min , 4c離心。4）吸取上清 于另一 50ml離心 管中，取3ml VV-Buffer 重懸沉淀，2ml VV-Buffer沖洗離心管，加至同一 50ml離心管，將混合液再次加入研磨器中 反復研磨60次。5）將研磨好的病毒液轉入 50ml離心管中配平，1200rpm, 5min , 4c離心。6）取上清

19、于一新的無菌離心管中，移至超聲儀中超聲（破碎）兩次，每次20s。7）在SW41Beck man離心機專用離心管中加入 7ml 36%蔗糖（w/v） K10MM Tris-Hcl（ PH 9Q配制R ,再沿管壁緩慢加入3.5ml研磨超聲處理過的病毒液， 使之形成分層。8）用VV-Buffer稱重配平，誤差須小于 0.5g （誤差越小越好），移至Beck man 離心機中（14 / 25 / 36 轉子對應配平）13500rpm/32900xg , 80min , 4C。9）待離心結束，將轉子移至超靜工作臺打開，用銀子小心拿掉轉子蓋子，切勿 污染，再用無菌銀小心取出離心管，去除上清，取6mlVV-

20、Buffer重懸沉淀。10）梯度蔗糖：底層為4ml 40%蔗糖溶液（用10mM Tris-HCL pH9.CK制），依次向上分別為4ml 35%蔗糖溶液；4ml 30%蔗糖溶液和4ml 25%蔗糖溶液（最上層）。每個病 毒樣本制備至少兩份梯度，分別小心在上層加入病毒懸液，使之形成分層。11）用10mM Tris-Hcl （PH 9.0）稱重配平，誤差須小于0.5g （誤差越小越好），移 至Beck man離心機中（14 / 25 / 36轉子對應配平）20000rpm ,60min ,4 C。12）待離心結束，將轉子移至超靜工作臺打開，用銀子小心拿掉轉子蓋子，切勿 污染，再用無菌銀小心取出離心

21、管，去除上清，取2mlVV-Buffer重懸沉淀。13）病毒分裝與儲存：取滅菌 EP管，取少量病毒液進行滴度測定，其余根據實 驗需要按20ul / 50ul /100ul /支并按規定明確標記病毒名稱，日期等信息后， 冰上分裝凍存于-80 C冰箱病毒庫。腺病毒的收獲和純化二.病毒收獲：7）從37c二氧化碳孵育箱中取出達到收獲標準的 36瓶T175培養瓶，輕輕晃動 培養瓶，少量貼壁細胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺用移液管輕輕吹打未 脫落細胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。8） 移至高速離心機中，2000rpm, 10min, 4c離心。9）棄上清，移液管取10ml冷PB

22、S加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉入 50ml離 心管中。10）方法同上，分別用冷PBS5ml反復清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉致同50ml離心管中 11）移至高速離心機中配平，1000rpm, 10min, 4c離心。12）棄上清，4c取12ml冷的10mM Tris.HCI（Ph8.0g懸混勻，并凍存于-80C待 純化。四.病毒純化：1 .將制備的含病毒溶液在液氮和37 c水浴中反復凍融三次。2 .將該溶液37c水浴融化，轉入50ml離心管中，室溫，6000 rpm離心10 分鐘。保留上清，凍存于-80C冰箱或立即進行CsC梯度離心。3 .將6只超高速離心用離心管中分別先加入10ml1

23、.25g/mlCsCI再小心輕輕加入7.6ml1.4g/mlCsCL,然后將病毒混合液平均輕輕加入 CsC腋面上。4 .稱重，用滅菌的Tris.HCI（Ph8.0）己平，誤差 0.1g。5 .將離心管放入 Beckman SW32轉子中，放入LE-80曲速離心機中（14 / 25 / 36轉子對應配平）離心，25000rpm, 15C, 2小時。6 .小心取出離心管放于無菌操作臺中，將離心管夾于管夾上，用 19號針頭 刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物（病毒條帶呈乳白色），盡量多抽，將 所抽出液體轉入50ml離心管中。7 .將50ml離心管中含病毒液體順液面輕輕平均分配加入至已加入3ML1.35g

24、/mlCsCI溶液的5ml超高速離心用離心管中。8 .用 Tris.HCI(Ph8.琳重配平，誤差 0.1g。9 .將離心管放入Beckman SW41轉子中，放入LE-80曲速離心機中(14 / 2-5 / 36轉子對應配平)離心，40000rpm, 15 C, 15小時。10 .小心取出離心管放于無菌操作臺中，將離心管夾于管夾上，用 19號針頭 刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物(病毒條帶)，盡量少抽，將所抽出液 體轉入50ml離心管中。11 .將液體注入透析袋中，放入透析液中，于冷室中透析 24小時。12 .病毒分裝與儲存：透析結束后，將透析袋轉至無菌工作臺中，取少量病毒液進行滴度測定，其余

25、病毒液根據實驗需要按20ul / 50ul /100ul /支并按規定明確標記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝儲存于-80C冰箱病毒庫。病毒滴度測定(TCID5Q1 .培養 CV-1 (VV)或 JH293(AD)細胞。2 .當培養瓶中細胞生長率呈80%寸，將各培養瓶中培養基吸出，各加入少量 胰酶消化，37C, 2-3分鐘；冉各加入5mL10% FBS勺DMEM培養基混勻，細胞 計數。3 .根據細胞計數結果將細胞鋪入 96孔板，每孔3M03細胞于200微升10%FBS的DMEM,過夜。4 .第二天早晨，按比例稀釋病毒，一般是 1: 105稀釋：10ul病毒原液3ul混合液990ul DMEM2

26、997ul DMEM20ul排槍加至96孔板第一排第一排用排槍加入20微升，輕輕混勻5次，去掉槍頭;從第一排吸取22微升加入到的第二排，輕輕混勻 5次；同樣從第二排吸取22微升加入到第三排，輕輕混勻5次;依次到倒數第二排，最后一排做對照。5.從感染病毒起，第810天觀察。先觀察最后一排細胞狀態，長滿時，計每排 CPE的數值。計算病毒滴度。6.代入以下表格計算病毒滴度:DilutionsNo. infected w ellsNo. uninfected w ellsTotal no. Total no. uninfectedinfected% totalAbove 0.5% above 0.5

27、% binfectedelow 0.5 log abodilut ve 51.00E-051206901TRUE0001.00E-061205701TRUE0001.00E-071204501TRUE0001.00E-081113310.9705882TRUE0001.00E-091022230.88TRUE0001.00E-1057121005454545TRUE 0.5)4545450-101.00E-117571503181818FALSE00.31818180# of Wells12mls/well0.020.50.5)454545 0.3181818-10Prop. Dist.0.2

28、Log TCID50-10.2TCID506.3096E-111/TCID501.5849E+10TCID50/ml7.9245E+11pfu/ml5.4679E+11cell number90000volume2pfu/cell12150848一、細菌污染及檢測；二、支原體污染及檢測;三、基因檢測；四、病毒活性檢測；五、體外細胞殺傷復制能力檢測細菌污染及檢測:1.1 背景介紹：細菌是一種元和細胞微生物，具大小以微米計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和假單胞菌等， 革蘭氏陰性菌中白色葡萄菌等 比較常見。純化后的病毒有細菌污染時并不容易發現。所以，做病毒的細菌質控 非常必要。1.2 實驗步驟：當做

29、細菌檢測時，可以取10ul已經純化好的病毒加入無抗生素 4ml的培養基 （目前實驗室所用的是LB培養基）試管中，將試管置于 37C, 1800rpm的搖床 上搖過夜（12-16h）,如果有細菌污染，16h內就可獲得陽性結果。1.3 結果判讀:多數情況下當受到細菌污染時，培養基短時間內顏色變黃，產生大量酸性物質， 出現明顯混濁現象，此時的培養基稍加振蕩就會有混濁物懸起。在倒置顯微鏡下 觀察，可見培養基有大量圓球狀顆粒漂浮， 此種情況即可判定為陽性，病毒受到 細菌污染。若無，則判讀為陰性。二、支原體污染及檢測：2.1 背景介紹：支原體是一種介于細胞和病毒之間、能獨立生活的最小微生物，最小的直徑0.

30、2um,約有1%可通過濾菌器，無細胞壁，形態呈多形性，可為圓形、絲狀或梨形。在光鏡下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構， 其中央有電 子密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體的污染是一個常見又棘手的問題。支原體污染后，因它可與病毒長期共存， 培養基一般不發生混濁，外觀上往往給人以“正常”的感覺，實則可能對后期實 驗產生潛在影響，所以對支原體的污染必須嚴加防范。支原體污染常用檢測方法有相差顯微鏡法、DNA熒光處理法、電鏡檢測法、低張 處理地衣紅染色觀察、支原體PCR檢測法等。實驗室目前使用的是PCR僉測法。2.2 實驗步驟：(1)實驗前準備：樣本和對照準備：樣本：收集待檢測病毒樣本

31、，若為病毒原液則可用5ul原液加495ul細胞培養基(確定無污染)進行100倍稀釋。陽性對照：從醫院取得支原體陽性樣本，高壓滅菌后(可分裝50ul一支)做陽性對照。陰性對照：滅菌蒸儲水。引物的準備：Fwd-1.: ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT AFwd-2.: CCT AAA GGA ATT GAC GGG AAC CCGRev: TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC以上引物可以檢測出常見的14種不同支原體。按要求稀釋為50pmol/ul ,分裝為50ul/管，-20c保存，待使用。(2) PCR 反應：配置全過程需在冰上操作：1st

32、 Round band at 720bp按下列組分配置PCR反應液：滅菌蒸儲水up to 20ul -10*PCR Buffer2ulDntp(2.5mM) MgC2(25mM) Fwd-1.Rev.Taq酶 樣本/對照1.6ul1.2ul1ul1ul0.3ul1ulMIX1st反應條件95 c x 30s95 C x 30 s56 C x 30 s72 c x 1min35 cycles72 c x 1min反應大約需1.5小時，由此得到第一輪相應的 PCR產物，在打開PCR管前先離心甩一下，接著進行第二輪 145bp的PCR鑒定。2nd Round - Band at 145bp按下列組分

33、配置PCR反應液：滅菌蒸儲水10*PCR Bufferup to 20ul2ulDntp(2.5mM)1.6ulMgC2(25mM)1.2ulFwd-2.1ulRev.1ulTaq 酶0.3ul第一輪PCR勺產物(對應樣本/對照)1ulMIX加過模板，第一輪產物可加1ul 10*loding buffer,混勻后先放置4c冰箱。待跑瓊脂電泳膠。2nd反應條件（與第一輪相同） 95 x 30s95 C x 30 s-56 C x 30 s _35 cycles72 c x 1min_72 x 1min第二輪產物加1ul 10*loding buffer ,終止反應，跑瓊脂電泳膠。（3）瓊脂電泳跑

34、膠：配置1%的瓊脂糖凝膠即可。首先將錐形瓶洗干凈，然后根據樣本量和膠的大小取一定量的電泳緩沖液 （1XTAE至錐形瓶中，再稱取相應量的 AGAROSE瓊脂糖）倒入錐形瓶中， 搖勻，最后放入微波爐加熱，煮膠的過程中需注意安全，應適當搖勻，防止爆沸。 煮好的凝膠需無氣泡、色澤及質地均勻。將煮好的凝膠放入均勻冷卻至50c左右時，加入相應EB混勻，及時將凝 膠倒入裝好的干凈模具中。待凝膠完全凝固（約30min）后，垂直方向拔梳子。此時，凝膠需平整、不 漏孔，可以用于電泳檢測。膠前準備：先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標記，然后把凝膠連同膠托一起放入電泳 槽正中央。膠孔的方向朝向負極（注意：放凝膠前，需將

35、膠托底部的凝膠抹干凈，防 止膠托在電泳槽中滑動；此時，可順便觀察凝膠是否漏孔）。再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩沖液（1XTAE至剛好將凝膠淹沒。（注 意保持桌面衛生，防止緩沖液灑到桌。上樣:將兩輪的產物和loding buffe混合后，輕甩，按照規定的順序上樣，上樣 順序應與電泳槽上的標記一致。注息：上樣時必須確保上樣順序正確無誤，樣品間不混淆，點樣后的空管子先放 在電泳槽旁邊，用于核查；點樣時不戳孔、不外漏、不溢出；點樣時需小心槍頭不要碰到凝膠，以免凝膠挪動，若凝膠已經挪動，需等 樣品完全沉到底部后，再固定凝膠.樣品上完后，加陽性對照，陰性對照。每排膠上留一孔加 Maker （D2000 b

36、p） ,5 ul.跑電泳：確認已經正確上樣后，雙手同時蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽（注 意：確認電極正確連接），設置電泳參數：電壓：100V,電流：400mA,時間： 25min；注意確認電極、電泳參數完全正確之后，最后按 star鍵開始電泳。凝膠成像：帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時的那個 PE手套上（注 意：撈膠時需小心防止凝膠斷裂、滑落，盡量把多余的 EB染液甩干），將凝膠放 入凝膠成像系統中，按照“ Tanon凝膠成像系統操作規程”進行操作拍照。（注 意：拍照時需嚴格區分EB污染區與非污染區，防止EB污染區污染電腦、鍵盤及 鼠標），最后保存膠圖信息至規定的文件夾內，命

37、名規則為：日期 +姓名+工號+ 部門+電泳銅人陣考核。注意事項 1、電泳中使用的澳化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質, 務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。操作時戴上乳膠手套，必要時戴上 PE手套和口罩。三.基因檢測：試驗1: BioTTT00也因組測序試驗一、目的檢測BioTTT001序歹U信息、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌存儲BioTTT001深圳S160324A -80度QIAmp DNA blood mini kitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度三、儀器設備儀器品牌型號離心機ThermoIEC MICROMAX微量分光光度計Ther

38、moNANODROP ONE恒溫數顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEX GENIX2四、試驗過程1 .病毒基因組提取1.1 向200ul BioTTT001原液中力口入10ul蛋白酶K,混勻。1.2 加入200ulAL Buffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入 56度水浴鍋內，孵 育10分鐘。1.3 加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉移樣品到新吸附柱中。1.4 離心8000轉1分鐘，轉移吸附柱到新2ml離心管中。1.5 加入 500ul Buffer AW1,離心 8000 轉 1 分鐘。1.6 棄廢液，向吸附柱中加入 50

39、0ul Buffer AW2, 14000轉離心3分鐘。1.7 棄廢液，空轉1分鐘；將吸附柱轉移到新的1.5ml離心管中。1.8 向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉離心1分鐘2 .濃度測定2.1 吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進行校準。2.2 抬起測量臂，擦拭殘留液體。2.3 吸取1ul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數據3 .送華大基因測序3.1 準備總量為2.5ug,濃度不低于80ng仙的樣品，進行測序。3.2 華大基因進行樣品檢測，并出示檢測報告。3.3 樣品檢測合格后，建立樣品庫進行測序。3.4 數據分析。試驗2: BioTTT001基因組酶

40、切試驗 SOP、目的通過酶切驗證BioTTT001的構建儀器品牌型號、試劑來源、配制及保存條件試齊來源/品牌存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmp DNA blood mini kitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度EcoR VNEBR1095S-20度Buffer 3.1NEBB7203S-20度瓊脂糖Invitrogen75510-019室溫DNA MarkerTIANGEN100bp4度三、儀器設備離心機ThermoIEC MICROMAX微量分光光度計ThermoNANODROP ONE恒溫數顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTI

41、FIC INDUSTRIESVORTEX GENIX2瓊脂糖凝膠電泳儀:北京六一DYY-6c瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500四、試驗過程1 .病毒基因組提取1.1 向200ul BioTTT001原液中力口入10ul蛋白酶K,混勻。1.2 加入200ulAL Buffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入 56度水浴鍋內，孵 育10分鐘。1.3 加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉移樣品到新吸附柱中。1.4 離心8000轉1分鐘，轉移吸附柱到新2ml離心管中。1.5 加入 500ul Buffer AW1,離心 8000 轉 1 分鐘。1.6 棄廢液，向吸附柱中加入 500

42、ul Buffer AW2, 14000轉離心3分鐘。1.7 棄廢液，空轉1分鐘；將吸附柱轉移到新的1.5ml離心管中。1.8 向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉離心1分鐘2 .濃度測定2.1 吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進行校準。2.2 抬起測量臂，擦拭殘留液體。2.3 吸取1ul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數據。3.酶切3.1配制酶切體系基因組40ul （約500ng）EcoR V1ulBuffer 3.15ul超純水4ul總體積50ul3.2混勻后，放于37度水浴鍋中，過夜酶切，約16-18小時4.電泳4.1 配制2%®脂糖凝膠

43、，120V電泳，約25-30分鐘，4.2 成像觀察。試驗3: BioTTT00也因組PCRM插入基因IL-12 PCR僉證SOP一、目的禾I用PCR驗證BioTTT001的構建、試劑來源、配制及保存條件試齊來源/品牌存儲BioTTT001深圳S160324A1-80度QIAmp DNA blood mini kitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度2XMixVazyme102151-20度引物（詳見附注）一DNA MarkerTIANGEN100bp4度三、儀器設備儀器品牌型號離心機ThermoIEC MICROMAX微量分光光度計ThermoNANODROP ON

44、E恒溫數顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEX GENIX2PCR儀Life technologies2720 Thermal cycler瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500四、試驗過程1 .病毒基因組提取1.1 向200ul BioTTT001原液中力口入10ul蛋白酶K,混勻。1.2 加入200ulAL Buffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入 56度水浴鍋內，孵 育10分鐘。1.3 加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉移樣品到新吸附柱中。1.4 離心8000轉1分鐘，轉移吸附柱到新2ml

45、離心管中。1.5 加入 500ul Buffer AW1,離心 8000 轉 1 分鐘。1.6 棄廢液，向吸附柱中加入 500ul Buffer AW2, 14000轉離心3分鐘。1.7 棄廢液，空轉1分鐘；將吸附柱轉移到新的1.5ml離心管中。1.8 向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉離心1分鐘2 .濃度測定2.1 吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進行校準。2.2 抬起測量臂，擦拭殘留液體。2.3 吸取1ul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數據。PCR3.4.電泳4.1 配制2%®脂糖凝膠，120V電泳，約25-30分鐘,4.2 成像觀察。

46、附注：引物信息-Frimer set| , . / * ' . _ ,' O' " I'' iDirectionKequenc.41°- '«J ?u,.a» ,|- -r« . L _ ,- -* , r ： .一 - j151 forwardCCCGGJGAGATTCCTCAAGAGtiCCACV reverseCC G ； A CCC A AG GCTC TC1G C fCTCCGG CTG C1CG UG C251 furwardGTAATGTTGOCGQTOCAGGAAGGGATTGV

47、reviseGfiGTCCCCCGTA riCtrrt'CGGTCiA J AA IGAC3S1 JbrwpardMl GfTCCiCTTTGCTATATG AGG ACCTGTGG C3* reverseCCTCGAlACArrCCACAGCCTGGCGACGCCCACC4I5' forwardCCTGTGATTGCGTGTGTGG3' reverseGACAACA GT AG CAGGCG ATTC55, forwardGCATCTGTGGAGAGCGG H'GTOAGACAC3' reverseGCGCCACJCAGA TCA A G CTCATT

48、A GCCC65' forwardGCTTA ATG ACC A GA CACCGTCCTG AC TG3, reverseGCACCA AGTG ATCCGGCCTC AG CTCC75' fens ardCAC：CICACGCrCAlVlGUAGCCJCAIVACrGJ；3' reverseCKJ C AG A CG er FCTTGCG CGCTTCATCTG Cg51 forwardCGCTGGGGTCGCCACCCAAGATG ATTAG G31 reverseGAGTAGGG1 ACGACCAAAGCtiAOCACTO95" forward第8對E

49、3-gp19k上游3" reverse第11對nsIL12下游105" forward第11對nsIL12上游3" reverse第8對E3-gp19k下游115" forwardATGatatgggaactgaagaaag3" reverseTTAGGAAGCATTCAGATAGPi iiiicr 轉tS' Mnriin sift3' binding si，©Targel 舅equenctFxpecterf Ad5 size (bp)-1476&53,'' IA t3772 .7671021)

50、E1A-CK22623206g1453El A end38441554208%EIB-1PKFS32520732440R1R-55K367623833431E1B-55K105721531。%E3BH23E2871529135Ek即19區.42092871530109E3-gp19k+nsIL121394102853429135nsIL12+E3-gp19k601112853430109nsIL121575試驗 4: BioTTT00lff入基因 IL-12表達檢測 SOP (ELISA)、目的 禾I用ELIS賬測BioTTT001插入基因IL12的表達水平、試劑來源、配制及保存條件試齊來源/

51、品牌貨號/配制存儲Biolll001深圳S160324A-80 度一DMEMGibco75510-0194度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin- Glutamine (100X)Gibco10378-016-20度Human IL12 ELISA KITeBioscien ce88-7126-884度三、儀器設備儀器品牌型號生物安全柜Thermo1300SERIES A2細胞培養箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA 8800 SERIES水浴鍋晶玻SS-H2酶標儀BECKMANDTX880四、試驗過程1 .細胞培養及鋪板1.

52、1 復蘇JH293一支，待細胞融合度達到80-90%寸進行傳代。1.2 傳代3-5次，觀察細胞狀態良好，消化收集細胞，制備單細胞懸液。1.3 利用血球計數板進行細胞計數。1.4 使用含10%FBS-DMEMt養基調整細胞溶度為1.0 X10/ml ,2ml/孔進行鋪板1.5 將六孔板放置于細胞培養箱中，過夜培養。2 .病毒感染2.1 培養14-18小時，觀察細胞完全貼壁后，消化其中 3個孔，分別進行計數， 取平均值。2.2 每個細胞感染5PFU BioTTT001根據計數結果，使用無血清DMEM培養基稀 釋病毒，每孔加2ml含病毒的無血清DMEMo2.3 細胞培養箱放置2小時，吸走含病毒培養基，2mlPBS/FL輕輕晃動清洗一次。2.4 每個孔加入2ml 10%FBS-DMEMW養基，放置于細胞培養箱中進行培養。3 .樣品收集及凍融3.1 分別于感染后24h、48h、72h及96h時，收集每孔的培養基，使用 200ul吸 頭（折彎）刮取貼壁細胞，與同孔的培養基收集于同一凍存管中；每個時間 點收集三個復孔。3.2 樣品保存于超低溫冰箱中。3.3 從超低溫冰箱中取出樣品，放置于 37度水浴鍋中進行解凍。3.4 樣品完全解凍后，迅速將其放置于液氮中3-5分鐘進行速溶，再37度水浴至 完全溶解。3.5