1、動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫酶聯(lián)免疫吸附試驗（操作）酶聯(lián)免疫吸附試驗（操作）酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫一、目的要求一、目的要求掌握ELISA的基本操作步驟，了解豬群豬瘟抗體監(jiān)測的意義。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫二、儀器材料二、儀器材料酶聯(lián)檢測儀、酶標板、微量加樣器(配帶滴頭)、豬瘟病毒、酶標SPA、豬瘟陽性血清、豬瘟陰性血清、待檢血清、pH9.6碳酸鹽緩沖液、洗滌液（PBS-T）、BSA(牛血清白蛋白)、封閉液、稀釋液、底物溶液、30%H2O2、2mol/L H2SO4溶液、鄰苯二胺（OPD）。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫二、儀器材料

2、二、儀器材料酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫三、方法與步驟三、方法與步驟PPA-ELISAPPA-ELISA檢測豬瘟抗體效價檢測豬瘟抗體效價1包被包被 用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋豬瘟病毒抗原至1g/ml，以微量加樣器每孔加樣100l，置濕盒內(nèi)37包被23h。2洗滌洗滌 用洗滌液（PBS-T）將反應(yīng)板洗滌三次，每次5min，甩干。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫三、方法與步驟三、方法與步驟3封閉封閉 以微量加樣器在每孔內(nèi)加封閉液200l，置濕盒內(nèi)37封閉3h。4洗滌洗滌 重復第2步。5加待檢血清加待檢血清 以微量加樣器在每孔內(nèi)加100l稀釋液，然后在酶標板的第1孔加

3、100l待檢血清，以微量加樣器反復吹吸幾次混勻后，吸100l加至第2孔，依次倍比稀釋至第12孔，剩余的100l棄去，置濕盒內(nèi)37作用2h。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫三、方法與步驟三、方法與步驟6洗滌洗滌 重復第2步7加酶標加酶標SPA 以稀釋液將酶標SPA稀釋至工作濃度，以微量加樣器每孔加100l，置濕盒內(nèi)37作用2h。8洗滌洗滌 重復第2步。9加底物溶液顯色加底物溶液顯色 每孔加入新配制的底物溶液100l，37避光顯色10min。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫三、方法與步驟三、方法與步驟10終止反應(yīng)終止反應(yīng) 加2mol/LH2SO4溶液終止反應(yīng)，每孔50l

4、。11結(jié)果判定結(jié)果判定 以酶標儀檢測樣品的A490，檢測之前，先以空白孔調(diào)零，當P/N2.1即判為陽性。注意：每塊ELISA板均需在最后一排的后3孔設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫結(jié)果判定：結(jié)果判定： 定性檢測定性檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫結(jié)果判定：結(jié)果判定：定量檢測定量檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫附：常用試劑的配制1.包被液(0.05molpH9.6碳酸鹽緩沖液)：Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸餾水 1000ml。2.緩沖液（0.01molpH7.4 PBS）：NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4 2.9g；KCl 0.2g；蒸餾水 1000ml。3.洗滌液（0.01molpH7.4PBS-吐溫20）：Tween-20 0.5ml；0.01M pH7.4 PBS；1000ml。酶聯(lián)免疫吸附試驗動物檢疫檢驗技術(shù)專業(yè)教學資源庫4.封閉液（1%BSA-PBS-T）：BSA 1.0g；PBS-T 100ml。5.底物緩沖液（pH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液）：檸檬酸 4.6656g；Na2HPO4 7.2988g；蒸餾水 1000ml。6.底物溶液（臨用前新鮮配制，配后立即使用）：鄰苯二胺(OPD) 40mg；30%