1、中國生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期269大鯉皮膚分泌液中抗菌肽的鑒定及生物活性研究111,2王利鋒，李學英，王大忠(1.遵義醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，貴州遵義563003;2.銅仁學院，貴州銅仁554300)摘50、G-要：目的鑒定大鯉皮膚分泌液中抗菌肽，研究其部分生物活性。方法5%醋酸浸提和SephadexG-25凝膠過濾色譜等方法分離純化抗菌肽；采用抑菌圈法檢測抗菌活性，Tricine-SDS-PAGE電泳和等電聚焦電泳鑒定其抗菌活性成份。結果大鯉皮膚分泌液中含有抗菌活性物質。對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌

2、和真菌均具有較強具有較強的堿性。結論首次從大鯉皮膚分泌的抗菌活性；電泳檢測顯示該小分子多肽相對分子質量約為4300,液中分離純化到一種抗菌肽，此抗菌肽可能是一個具有較強陽離子特征的堿性肽。關鍵詞：大鯉；皮膚；抗菌肽；分離純化中圖分類號：R282.74;R961文獻標識碼：A1678(2011)04-0269-04文章編號：1005-CharacterizationandbioactivityofantimicrobialpeptidesfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianus2WANGLi-feng1,LIXue-ying1,WANGDa-zhon

3、g1,(1.DepartmentofCellBiologyandGenetics,ZunyiMedicalCollge,Zunyi563003,China；2.TongrenUniversity,Tongren554300,China)Abstract:PurposeTocharacterizetheantimicrobialpeptidesfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianusandtostudyitsbioactivity.MethodsThisantimicrobialpeptidewaspurifiedby5%aceticacidextr

4、actionandSephadexG-50G-25gelfiltrationchromatography.Theantimicrobialabilitywaschar-acterizedbyinhibitingzonedetermination.Theantimicrobialactivesubstancewasidentifiedbytricine-SDS-PAGEelectrophoresisandisoelectricfocusing(IEF)electrophoresisResultsTheskinsecretionsofnegativeGram-posi-theAndriasdavi

5、dianuscontainantibioticactivesubstanceItstronglyinhibitedGram-tivebacteriaandfungusTheelectrophoresisresultsshowedthatitsmolecularweightwasabout4300withastrongalkalineproperty.ConclusionAnantibacterialpeptidewasisolatedfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianusforthefirsttimeandthisantimicrobialpep

6、tidemaybeastrongfeatureofthebasicpeptidecationKeywords:Andriasdavidianus；skin；antimicrobialpeptide;purification兩棲類皮膚濕潤、裸露，無疑給外界微生物的侵入提供了便利條件，為了自身生存和適應棲息地多樣化生態環境的需要，它們依靠皮膚腺體分泌出一1系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵襲。相關研究結果顯示，兩棲類皮膚抗菌肽呈現出超乎想象的分05-20收稿日期：2010-基金項目：貴州省教育廳自然科學研究重點項目（黔教科2007039）;貴州省高層次人才科研條件特助經費（TZJF-2007049）E

7、-作者簡介：王利鋒，男，碩士研究生，主要從事生物制藥研究，mail:24102989；王大忠，男，通信作者，博士，教授；李學英，女，通信作者，教授。子和功能的多樣性2-30國內外對于兩棲類皮膚抗菌肽的研究主要集中在無尾目兩棲類，例如最廣泛它們皮膚抗菌肽在種類和數分布的蛙科（Ranidae）,4量等方面，都是極其驚人的。而對于有尾目兩棲類，除紅噱疣嫄（Tylototritonverrucosus）和山溪6目前尚未見文獻報道其皮鯉（Batrachuperus外，膚分泌液存在抗菌活性物質。大鯉（MegalobatrachusjaponicusdaridianusBlan-chard屬大型兩棲綱有尾目

8、隱鯉鯉科，是我國二級保護動物，有活化石之稱。人們在歐洲、東亞和北美地區發現的大約距今300萬至7000萬年的大鯉化270中國生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期7石暗示其在地球上曾廣泛分布。目前我國大鯉的人工養殖已經實現產業化，為從大鯉皮膚分泌液中提取抗菌肽提供了豐富的資源。作為現存個體最大的兩棲類動物，其皮膚腺發達，在試驗中觀察到大鯉皮膚在受到理化刺激時能分泌大量白色狀黏液，最初呈白漿狀，后漸變為黏稠具濃澀氣味。本實驗對大鯉皮膚分泌液中膠狀物，是否含有抗菌活性物質進行了檢測，并鑒定其部分性質，為進一步的研究工作奠定

9、基礎。1材料1.1動物和菌種成年大鯉雌雄各一尾，購于貴州錦江娃娃魚有限公司。菌種：大腸埃希菌(Escherichiacoli)No.ATCC25922、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureuSNo.ATCC29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermi-di§No.ATCC35984、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginoSaNo.ATCC27853、白色念珠菌(canidiaAlbicans)No.ATCC10213、溶血性鏈球菌(Hemolyticstreptococcus)No.CMCC(B)32264,遵義醫學院微生物學教

10、研室保藏。1.2試劑50和SephadexG-25GE葡聚糖凝膠SephadexG-Healthcar必司；低相對分子質量(Mr)標準蛋白，北Tris、京經科宏達生物技術有限公司；TEMED、Tricine、250,丙烯酰胺、過硫酸錢、考馬斯亮藍R-美國Sigma公司；BCA法蛋白定量試劑盒，上海碧云大MH(A)培養基，北京奧生物公司；營養肉湯培養基、博星生物技術有限責任公司。2方法2.1皮膚分泌液的粗提采用電刺激法誘導大鯉皮膚分泌黏液。按體積4c比1：1將收集到的皮膚分泌液用5%乙酸浸提，下攪拌24h。12000r/min離心30min取上清，用12000r/min離心30磷酸鹽緩沖液調pH

11、至7.2,min,取上清冷凍干燥，2.2抗菌肽分離純化粗提物用注射用水溶解，截留Mr10000的超濾收集Mr大于10000和小于膜4c下超濾分離，710000兩部分溶液，抑菌圈法篩選有抗菌活性的SephadexG-50®膠色經0.45膜過濾后，溶液，管，測定A280nm,繪制洗脫曲線，收集各峰。同樣方法篩選具有較強抗菌活性的峰，冷凍干燥濃縮樣品至4.5mL,25凝膠再采用相同方法，進行SephadexG色譜(1.6cnriX60cm)分離，得到具有抗菌活性的溶液濃縮后4c保存。2.3蛋白質含量檢測BCA法蛋白定量試劑盒檢測抗菌肽溶液的蛋白質含量，按試劑盒說明書操作。2.4電泳鑒定2.

12、4.1Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分離膠、夾層10%和4%的丙烯酰胺凝膠、濃縮膠分別為16.5%,3種膠長度比例為4：1.5：1,膠，厚度為0.75mm,陽極緩沖液為0.2mol/LTris緩沖液(pH8.9),陰極緩沖液為0.1mol/LTris(內含0.1mol/LTricine,0.1%SDS,pH8.25)溶液。每孔上樣量15pL30V恒壓電泳約30min,當樣品進入分離膠時，電壓升至100V約3h。2.4,2等電聚焦電泳按中國藥典三部(2005版)方法進行，不同之處在于配制凝膠時加入尿素，使最終的電泳膠含33%的尿素。抗菌活性檢測大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅

13、2.5綠假單胞菌培養基為MH(A)培養基；溶血性鏈球菌的培養基為在MH(A)培養基中加入10%的脫纖維羊血；白色念珠菌培養基為沙氏葡萄糖蛋白陳瓊中央孔加入注射脂培養基(SDA)o采用抑菌圈法，用水作為陰性對照，其中一孔加入相應抗生素為陽37。叵溫培養18h(白色念珠菌28c恒溫性對照，培養2d),觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm作為樣品最小抑菌濃度的檢測標準。2.6溶血活性檢測微量溶血試驗評估溶血活性。取健康人血液用3000r/min離心生理鹽水洗滌紅細胞至上清無色，12min,棄上清，用生理鹽水配成2%紅細胞懸液，100,50,40,將抗菌肽溶液用生理鹽水稀釋成500,30,20,10pg/m

14、L勺溶液，加入等體積的2%紅細胞100,陽性對照為0.1%TritonX-陰性對照為生懸液，37c孵育1h,理鹽水，每個樣品設3個平行孔，離540nm波長處測定心去掉完整的紅細胞。取上清，各管的吸光度值。穩定性實驗熱穩定性實驗100仙g/mLM菌肽?§液分50,60,70,80,90,100,121c下處理10別在40,min,冰浴冷卻，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試HCl譜(1.6cmX60cm)分離，用0.05mol/L的Tris-緩沖液(pH7.2)平衡色譜柱，樣品上樣后用同樣的流速為2.0mL/8min,每8min收集1緩沖液洗脫，中國生化藥物雜志Chines

15、eJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期271驗菌，未處理抗菌肽溶液為對照，測定其抑菌圈直徑，每個處理樣品重復試驗3次，根據抑菌圈直徑大小確定其熱穩定性。2.7.2酸堿穩定性實驗1001Ig/mL%菌肽溶液用0.1mol/LHCl溶液或0.1mol/LNaOH溶液調用磷酸鹽緩沖整樣品pH2.50;室溫放置2h,液將樣品pH值復調至7.2,未經處理的抗菌肽溶液為對照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試驗菌，每個處理樣品重復試驗3次，根據抑菌圈直徑大小確定其酸堿穩定性。3結果3.1大鯉皮膚分泌物中抗菌肽的分離純化Mr小于10000的溶液超濾液抗菌活性檢

16、測，具有明顯的抗菌活性。SephadexG-50ft色譜分離，得到2個明顯的主峰(圖1)。抗菌試驗表明，第2個主峰3689管收25柱色譜分集液有明顯的抗菌活性。SephadexG離，得到3個明顯的峰(圖2)。抗菌試驗表明，第2個峰1140管收集液有明顯的抗菌活性。.蛋白Marker；2.大鯉皮膚分泌液粗提物；3.SephadexG-5吩離25柱色譜分離后樣品后；4.SephadexG-1ProteinMarker；2.RawsubstanceThesubstanceaftertheSephadex25chroma-G-50chromatographyThesubstanceaftertheSe

17、phadexG-tography圖3Fig.3Tricine-SDS-PAGE電泳ElectrophoresisinTricine-SDS-PAGE3.4抗菌活性檢測抗菌肽溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌和白色念珠菌均有較強的抗菌活性，最小有效抑菌濃度分別為12,16,16,22,16,18pg/mL3.5溶血性檢測血平板檢測結果未見溶血現象。說明不同濃度的大鯉皮膚分泌液中抗菌肽溶液對人血紅細胞沒有溶血作用。圖1SephadexG-50765432109876543210,用-V-«*VJIm111oooooooooO凝膠過濾色譜結果3.63.

18、6.1穩定性試驗熱穩定性試驗結果見圖4。大鯉皮膚分泌液中抗菌肽對溫度有較好的耐受性，樣品在2040c抗菌活性沒有變化，100c煮沸10min還有抗121c保持10min后無抗菌活性0菌活性,圖2SephadexG-25H膠過濾色譜結果Fig.4aureus不同溫度處理后的抗菌肽抗菌活性EffectoftheextractsfromtheskinsecretionsoftheAn-driasdavidianusatdifferenttemperatureagainststaphylococcus3.6.2酸堿穩定性試驗結果見圖5。大鯉皮膚分泌物中抗菌肽在pH5.08.0時抗菌活性穩定，pH9.0

19、以上活性喪失。在pH3.0以下，272中國生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期Temporin-1Ja由于第11位的賴氨酸分子對比發現，13殘基被大冬氨酸殘基取代成為陰離子肽。Lai等發現從大蹊鈴蟾cDNA庫中篩選至陰勺陰離子抗菌肽maximinH5(ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2)僅具備有限的抗菌活性。本實驗從大鯉皮膚分泌液中得通過等點聚焦電泳檢測顯示出較強的到的抗菌肽，圖5Fig.5不同pH處理后抗菌肽的抗菌活性Effectofacidandalkalionantagonisticimpacto

20、ftheex-陽離子特征，該小分子肽也是一個堿性肽，我們推測其抗菌機制也可能是通過細胞膜而發揮作用的。目前，雖然從大鯉皮膚分泌液中純化得到了一種抗菌肽，但仍有許多問題需要闡明，如大鯉皮膚分泌物中是否還存在其它一些活性肽(廣譜性的和抗細菌的)以及它們的結構和功能等方面都需要做進一步研究，以獲得將大鯉皮膚分泌液中抗菌肽開發為新一代抗感染藥物所必須了解的信息。參考文獻：1張云.兩棲類動物皮膚分泌物及其生物學適應意義一大蹊2006,鈴蟾皮膚分泌物蛋白質多肽組的啟示J.動物學研究，27(1):101-l12.2茍小軍，鄒曉勇，楊燦宇.蛙皮多肽抗生素的研究進展J.成2006,25(1):25-30.都大學

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