1、第四章第四章 沉沉 淀淀 法法 (precipitation)(precipitation)生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程原料液原料液細胞分離細胞分離( (離心，過濾離心，過濾) )細胞胞內產物細胞胞內產物路線一路線一路線二路線二細胞破碎細胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產物清液胞外產物粗分離粗分離( (沉淀沉淀/ /超過濾超過濾/ /萃取萃取) )純化純化( (層析、離子交換、吸附層析、離子交換、吸附) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超濾凝膠過濾、超濾) )濃縮濃縮( (超濾超濾) )精制精制( (結晶、干燥結晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解(

2、(加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復性復性沉淀：利用沉析劑使生化物質在溶液中的溶解度降低沉淀：利用沉析劑使生化物質在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。而形成無定形固體沉淀的過程。沉淀法的目的：沉淀法的目的：(通過沉淀達到濃縮的目的；通過沉淀達到濃縮的目的；(沉淀方法可有選擇地沉淀雜質或有選擇地沉淀所需沉淀方法可有選擇地沉淀雜質或有選擇地沉淀所需成分，初步純化成分，初步純化 ；(將已純化的產品由液態變成固態，加以保存或進一將已純化的產品由液態變成固態，加以保存或進一步處理。步處理。沉淀法是最古老的分離和純化生物物質的方法，但目沉淀法是最古老的分離和純化生物物質的方法，但目前仍廣泛應用在

3、工業上和實驗室中。前仍廣泛應用在工業上和實驗室中。4.1 概述沉淀法的原理：沉淀法的原理：(生物分子在水中形成穩定的溶液是有條件的，生物分子在水中形成穩定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數。任何能夠影響這些就是溶液的各種理化參數。任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩定性。這些條件的因素都會破壞溶液的穩定性。(沉淀法基本原理沉淀法基本原理就是采用適當的措施改變溶液就是采用適當的措施改變溶液的理化參數，控制溶液的各種成分的溶解度，的理化參數，控制溶液的各種成分的溶解度，根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，離的目的，(溶劑組分的改

4、變或加入某些沉淀劑以及改變溶溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變溶液的液的pHpH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。度產生明顯的改變。 概 述n沉淀操作常在發酵液經過過濾和離心（除去不沉淀操作常在發酵液經過過濾和離心（除去不溶性雜質及細胞碎片）以后進行，得到的沉析溶性雜質及細胞碎片）以后進行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經進一步提純，如透物可直接干燥制得成品或經進一步提純，如透析、超濾、層析或結晶制得高純度生化產品。析、超濾、層析或結晶制得高純度生化產品。n操作方式可分連續法或間歇法兩種，規模較小操作方式可分連續法或間歇法兩種，規模較小

5、時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進行：通常按三步進行： 概述概述沉淀法操作步驟沉淀法操作步驟：首先加入沉淀劑，首先加入沉淀劑，沉淀劑的陳化，促進粒子生長；沉淀劑的陳化，促進粒子生長；離心或過濾，收集沉淀物。離心或過濾，收集沉淀物。加沉淀劑的方式和陳化條件對產物的純度、加沉淀劑的方式和陳化條件對產物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響收率和沉淀物的形狀都有很大影響。 概述概述沉淀生成動力學溶解度值的降低是一個動力學過程。當體系變得不溶解度值的降低是一個動力學過程。當體系變得不穩定以后，分子互相碰撞并產生聚并作用。通常認穩定以后，分子互相

6、碰撞并產生聚并作用。通常認為相互碰撞由下面幾種運動引起：為相互碰撞由下面幾種運動引起：熱運動，熱運動，BromnianBromnian運動；運動；對流運動，由機械攪拌產生；對流運動，由機械攪拌產生；差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。為了簡化沉淀過程動力學，為了簡化沉淀過程動力學，可把沉淀過程分成下述個步驟：可把沉淀過程分成下述個步驟：n(1) (1) 初始混合初始混合n(2) (2) 新相生成新相生成n(3) (3) 布朗運動凝集布朗運動凝集n(4) (4) 機械碰撞凝集機械碰撞凝集n(5) (5) 聚集體陳化聚集體陳化n(6) (6) 聚集體沉淀

7、聚集體沉淀沉淀生成動力學沉淀生成動力學沉淀法不僅用于實驗室中，因其不需專門設備，沉淀法不僅用于實驗室中，因其不需專門設備，且易于放大，也廣泛用于生產的制備過程，且易于放大，也廣泛用于生產的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。時最常用的方法。l優點：操作簡單、經濟、濃縮倍數高優點：操作簡單、經濟、濃縮倍數高l缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強性不強概概 述述沉淀法的分類沉淀法的分類根據所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：根據所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1 1

8、）鹽析法；）鹽析法；（2 2）等電點沉淀法；）等電點沉淀法；（3 3）有機溶劑沉淀法；）有機溶劑沉淀法；（4 4）非離子型聚合物沉淀法；）非離子型聚合物沉淀法；（5 5）聚電解質沉淀法；）聚電解質沉淀法；（6 6）復合鹽沉淀法等）復合鹽沉淀法等（7 7）親和沉淀法）親和沉淀法（8 8）選擇性沉淀法。）選擇性沉淀法。 蛋白質的溶解特性蛋白質的溶解特性n蛋白質是兩性高分子電解質（蛋白質是兩性高分子電解質（amphoteric amphoteric polymerpolymer），主要由疏水性各不相同的），主要由疏水性各不相同的2020種氨基酸種氨基酸組成。組成。n在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸

9、殘基具有在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏向內部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區。疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區。疏水性氨基酸含量高的蛋白質的疏水區大，疏水性水性氨基酸含量高的蛋白質的疏水區大，疏水性強。強。n親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質立體結構的親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質立體結構的外表面。外表面。n因此，蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成因此，蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區、親水區和疏水區構成荷電區、親水區和疏水區構成。蛋白質分子表面的憎水區域和荷電區域蛋白質分子表面

10、的憎水區域和荷電區域蛋白質的溶解特性蛋白質的溶解特性n蛋白質的溶解行為由其組成、構象以及分子周蛋白質的溶解行為由其組成、構象以及分子周圍溶液性質所決定。圍溶液性質所決定。n蛋白質在自然環境中通常是可溶的，所以其大蛋白質在自然環境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內部大部分是疏水的。部分是親水的，但其內部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白質比起在化學上類似的一般而言，小分子蛋白質比起在化學上類似的大分子蛋白質更易溶解。大分子蛋白質更易溶解。防止蛋白質凝聚沉淀的屏障防止蛋白質凝聚沉淀的屏障u蛋白質周圍的水化層蛋白質周圍的水化層（hydration shell)，保保護了蛋白質粒子，避免

11、了相互碰撞，護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞，使蛋白質使蛋白質形成穩定的膠體溶液。形成穩定的膠體溶液。u蛋白質兩性電解質，分子間靜電排斥作用。蛋白質兩性電解質，分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質粒子在水溶液中是帶電（存在雙電層）蛋白質粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。蛋白質表面的電荷與溶液中反身基團的電離。蛋白質表面的電荷與溶液中反離子的電荷構成雙電層。離子的電荷構成雙電層。4.4.鹽析鹽析鹽析鹽析概念：概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等生物大分子物質在水溶液中的

12、溶解度降低，產生沉生物大分子物質在水溶液中的溶解度降低，產生沉淀的過程。淀的過程。鹽析是可逆的，而變性是不可逆的鹽析是可逆的，而變性是不可逆的早在早在18591859年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分蛋白質，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級中使用，得到了比較滿意的結果。級中使用，得到了比較滿意的結果。 鹽析法機理鹽析法機理（1 1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，于是蛋白質分

13、子周圍的水化膜層減弱乃至消失，力，于是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質分子因熱運動碰撞聚集。使蛋白質分子因熱運動碰撞聚集。（2 2）破壞水化膜，暴露出憎水區域破壞水化膜，暴露出憎水區域，由于憎水由于憎水區域間作用使蛋白質聚集而沉淀，憎水區域越多，越區域間作用使蛋白質聚集而沉淀，憎水區域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和電荷，減少靜電斥力中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白中性鹽加入蛋白質溶液后，蛋白質表面電荷大量被中和，靜電斥力降質溶液后，蛋白質表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。沉

14、淀。鹽析過程鹽析過程 當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現以下兩當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現以下兩種情況：種情況：（1）“鹽溶鹽溶”現象現象(salt-in)低鹽濃度下，增加蛋低鹽濃度下，增加蛋白質分子間靜電斥力，蛋白質溶解度增大白質分子間靜電斥力，蛋白質溶解度增大 。（2）“鹽析鹽析”現象現象(salt-out)高鹽濃度下，中和高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質溶解度隨之下降電荷、破壞水化膜，蛋白質溶解度隨之下降 。l鹽析作用要強鹽析作用要強l鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽需有較大的溶解度l鹽析用鹽必須是惰性的鹽析用鹽必須是惰性的l來源豐富、經濟來源豐富、經濟1）鹽析用鹽的選

15、擇）鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規律為：一定差異，一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱用較強，半徑大的低價離子作用較弱陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 ：檸檬酸檸檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-陽離子鹽析效果：陽離子鹽析效果：NH4+ K+Na+ 高價陽離子高價陽離子陰離子的影響大于陽離子陰離子的影響大于陽離子鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫

16、酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑u（1 1）價廉；）價廉；u（2 2）溶解度大，溫度系數小，許多蛋白質可以鹽析出來；）溶解度大，溫度系數小，許多蛋白質可以鹽析出來；u（3 3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，u（4 4）不易引起蛋白質變性。）不易引起蛋白質變性。 鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇缺點：缺點：（1）水解變酸；）水解變酸；（2）高）高pH 釋氨，腐蝕；釋氨，腐蝕；（3）殘留產品有影響。）殘留產品有影響。鹽析操作(加鹽方式）硫酸銨的加入有以下幾種方法：硫酸銨的加入有以下幾種方法：1 1）加入固體鹽法）加

17、入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入。況；工業上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入。攪拌可加速溶解和膠體溶液的破壞，有利于蛋白質的沉淀，但攪拌可加速溶解和膠體溶液的破壞，有利于蛋白質的沉淀，但強烈攪拌會產生泡沫。引起蛋白質表面變性或活力下降，并會強烈攪拌會產生泡沫。引起蛋白質表面變性或活力下降，并會使沉淀破碎，形成細小顆粒，沉淀不完全，增加過濾的困難。使沉淀破碎，形成細小顆粒，沉淀不完全，增加過濾的困難。所以攪拌需適中。所以攪拌需適中。2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于

18、要求飽和度不高而原來溶液體積不大用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優點在于硫酸銨濃度變化有連續性，鹽析目的蛋白析出。該法優點在于硫酸銨濃度變化有連續性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結晶。效果好，但程序煩瑣，故多用于結晶。u一般說來，離子強度越大，蛋

19、白質的溶解度越一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。低。u在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。子強度順次進行。u每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍離心每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。使另一種蛋白質組分鹽析出來。 u組成相近的蛋白質，分子量越大，沉淀所需鹽組成相近的蛋白質，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質分子不對稱性越大，也越易的量越少；蛋白質分子不對稱性越大，也越易沉淀。沉淀。2 2）鹽濃度對鹽析效果的影響

20、）鹽濃度對鹽析效果的影響 S=-S=-s sS S蛋白質的溶解度，蛋白質的溶解度，g/L; g/L; I I離子強度，離子強度， I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i離子離子i i的摩爾濃度；的摩爾濃度；ZiZi所帶電荷所帶電荷常數，圖中常數，圖中截距截距KsKs鹽析常數，圖中直線斜率鹽析常數，圖中直線斜率CohnCohn經驗式經驗式蛋白質溶解度與鹽濃度的關系蛋白質溶解度與鹽濃度的關系和和Ks的物理意義的物理意義n代表截距，即當離子強度為零，也就是純水中代表截距，即當離子強度為零，也就是純水中的假想溶解度的對數。與蛋白質種類、溫度、的假想溶解度的對數。與蛋白質種類、溫

21、度、pHpH值有值有關，與鹽無關；關，與鹽無關；nKsKs鹽析常數，代表圖中直線的斜率；鹽析常數，代表圖中直線的斜率；n從一些實驗結果表明，從一些實驗結果表明，KsKs與溫度和與溫度和pHpH無關，但和蛋白無關，但和蛋白質與鹽的種類有關。但這種變化不是很大，例如以硫質與鹽的種類有關。但這種變化不是很大，例如以硫酸銨作為沉淀劑時，酸銨作為沉淀劑時，KsKs值對不同的蛋白質來說，其變值對不同的蛋白質來說，其變化不會超過化不會超過1 1倍。倍。用鹽析法分離蛋白質的二種方法用鹽析法分離蛋白質的二種方法鹽析法分為兩類，鹽析法分為兩類，第一類叫第一類叫Ks分段鹽析法，分段鹽析法，在一定在一定pH和溫度下通

22、和溫度下通過改變離子強度實現，過改變離子強度實現，（固定固定pH, 溫度，溫度，改變鹽改變鹽濃度濃度），），由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，易產生共沉淀現象，用于早期的粗提液；用于早期的粗提液；第二種叫第二種叫分段鹽析法，分段鹽析法，在一定離子強度下通過在一定離子強度下通過改變改變PH和溫度來實現，（固定離子強度，和溫度來實現，（固定離子強度，改變改變pH及溫度及溫度），由于溶質溶解度變化緩慢，且變），由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進一步分化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進一步分離純化和結晶。離純化和結

23、晶。鹽析用鹽量的確定鹽析用鹽量的確定- -飽和度：飽和度：u飽和度（飽和度（Saturation）的概念：）的概念： 以硫酸銨為例：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和溶解度時，硫酸銨的飽和溶解度是是767g/L定義為定義為100%飽和度飽和度u目標蛋白質的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸目標蛋白質的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。u對多數蛋白質，當達到對多數蛋白質，當達到85%飽和度時，溶解度飽和度時，溶解度都小于都小于 0.l mg/L，通常為兼顧收率與純度，飽，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在和度的操作范圍在40%-60%

24、之間。之間。原蛋白溶液體積為原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達到，欲使其硫銨飽和度達到S，需加入飽和硫酸銨溶液的體積數？需加入飽和硫酸銨溶液的體積數？ X=VS/(1-S) X：應加入的飽和硫銨溶液的體積：應加入的飽和硫銨溶液的體積 V：原蛋白質的溶液的體積：原蛋白質的溶液的體積 S：應達到的硫銨飽和度：應達到的硫銨飽和度原來蛋白溶液的飽和度為原來蛋白溶液的飽和度為S1，現希望其飽和度增加，現希望其飽和度增加為為S2，需加入多少體積的飽和硫酸銨溶液，需加入多少體積的飽和硫酸銨溶液? X=V (S2- S1)/(1-S2) X：應加入的飽和硫銨體積：應加入的飽和硫銨體積 V：原有溶液的體積：

25、原有溶液的體積 S ：原溶液硫銨的飽和度：原溶液硫銨的飽和度 S ：要達到的硫銨的飽和度：要達到的硫銨的飽和度加固體硫銨的方法加固體硫銨的方法考慮到在鹽析時，如加飽和硫銨溶液會使考慮到在鹽析時，如加飽和硫銨溶液會使溶液體溶液體積增大或使蛋白質濃度降低積增大或使蛋白質濃度降低，因此加入固體硫銨，因此加入固體硫銨比較適合，可用公式計算。比較適合，可用公式計算。在在20 時使時使1L M1摩爾濃度時（摩爾濃度時（NH4）2SO4溶液增溶液增至至M2摩爾濃度，所需加入（摩爾濃度，所需加入（NH4）2SO4的克數的克數C： C =533（M -M ）/(4.05-0.3M2) C：需加硫銨的g數 M1：

26、原溶液的濃度摩爾數 M2：需達到的濃度摩爾數在在20 時使時使1升升S1飽和度時（飽和度時（NH4）2SO4溶液增溶液增至至S2飽和度，所需加入（飽和度，所需加入（NH4）2SO4的克數：的克數：C =533（S2-S1）/(100-0.3S2) C：需加硫銨的g數 S1：原溶液的飽和度 S2：需達到的飽和度以上數據都可在有關書上查到以上數據都可在有關書上查到 204060800100總蛋白總蛋白目標蛋白質目標蛋白質上清液蛋白濃度上清液蛋白濃度l由于不同的蛋白質溶解度由于不同的蛋白質溶解度不同，沉淀時所需的離子不同，沉淀時所需的離子強度也不相同，強度也不相同，l如果需要先除去些雜蛋白，如果需要

27、先除去些雜蛋白，然后在較高的飽和度下，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白質，則可采沉淀目標蛋白質，則可采用分段鹽析用分段鹽析改變鹽的濃度，可將混合改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質分批鹽析分液中的蛋白質分批鹽析分開。開。l如半飽和硫酸銨可沉淀血如半飽和硫酸銨可沉淀血漿球蛋白，飽和硫酸銨則漿球蛋白，飽和硫酸銨則可沉淀包括血漿清蛋白。可沉淀包括血漿清蛋白。 分段鹽析(fractional salting out)鹽析的影響因素：3）pH值u一般來說，蛋白質所帶凈電荷越多溶解度越大，一般來說，蛋白質所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質溶解凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋

28、白質溶解度最小。度最小。u為提高鹽析效率，多將溶液為提高鹽析效率，多將溶液pHpH值調到目的蛋白的值調到目的蛋白的等電點處。等電點處。 u注意在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃注意在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃度下所測的結果是不同的，需根據實際情況調整度下所測的結果是不同的，需根據實際情況調整溶液溶液pHpH值，以達到最好的鹽析效果。值，以達到最好的鹽析效果。在進行鹽析時，必在進行鹽析時，必須控制須控制pHpH圖中直線都相互平圖中直線都相互平行行pH值鹽析影響因素：4）溫度的影響u在低離子強度或純水中，蛋白在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度質溶解度在一定范圍內隨溫

29、度增加而增加。增加而增加。u但在高濃度下，蛋白質、酶和但在高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。升而下降。u在一般情況下，蛋白質對鹽析在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4進行。進行。u隨溫度升高減小，熱促失水隨溫度升高減小，熱促失水膜膜uKsKs不隨溫度而變不隨溫度而變鹽析的影響因素：5）蛋白質濃度 沉淀蛋白質鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃沉淀蛋白質鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃度有關。度有關。Z高濃度蛋

30、白溶液可以節約鹽的用量，若蛋白濃度過高，高濃度蛋白溶液可以節約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發生嚴重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。會發生嚴重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。Z在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會降低。作用比較少，但回收率會降低。Z因此需要在兩者之間進行適當選擇。因此需要在兩者之間進行適當選擇。Z分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。Z一般認為一般認為2.

31、5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白質濃度比較適中。相當于的蛋白質濃度比較適中。相當于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/mL。u對起始濃度為對起始濃度為 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，大部分蛋白質在硫溶液，大部分蛋白質在硫酸銨飽和度為酸銨飽和度為 58-6558-65之間沉淀出來；之間沉淀出來；u但對稀釋但對稀釋1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，飽和度達到溶液，飽和度達到66%66%時才開始時才開始沉淀，而相應的沉淀范圍為沉淀，而相應的沉淀范圍為66-73%66-73%飽和度。飽和度。鹽析注意事項鹽析注意事項(選擇適宜飽和度選擇適宜飽和度(采用分步

32、鹽析采用分步鹽析(鹽析的成敗決定于溶液的鹽析的成敗決定于溶液的pHpH值與離子強度，穩定值與離子強度，穩定pHpH用磷酸緩用磷酸緩沖液沖液(在加入鹽時應該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應在加入鹽時應該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應該更注意緩慢，如果出現一些未溶解的鹽，應該等其完全溶該更注意緩慢，如果出現一些未溶解的鹽，應該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導致酶失活。解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導致酶失活。(鹽析后最好緩慢攪拌一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。鹽析后最好緩慢攪拌一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。(為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測

33、酶活性。為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。(鹽析后的蛋白質最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，鹽析后的蛋白質最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾一般可用超濾鹽析注意事項鹽析注意事項硫酸銨的使用硫酸銨的使用硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質巰基有敏感硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質巰基有敏感作用，使用前用作用，使用前用H H2 2S S處理處理高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0PH=5.0左右），使用前左右），使用前也需要用氨水調節至所需也需要用氨水調節至所需PHPH。硫酸銨容易吸潮，計算飽和度需注意硫酸銨容易吸潮

34、，計算飽和度需注意固體硫酸銨加入后體積變大固體硫酸銨加入后體積變大加入固體鹽后體積的變化已考加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；慮在表中；鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。的離心操作，耗時耗能。離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。鹽析法特點：鹽析法特點：n成本低，不需要特別昂貴的設備。成

35、本低，不需要特別昂貴的設備。n操作簡單、安全。操作簡單、安全。n不會引起蛋白質變性，經透析去鹽后，能得不會引起蛋白質變性，經透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質。到保持生物活性的純化蛋白質。1.分離效果不理想，通常只是作為初步的分離分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結合其它的純化方法。純化，還需要結合其它的純化方法。 4.等電點沉淀法等電點沉淀法 isoelectric point 等電點沉淀法等電點沉淀法在低的離子強度下，調在低的離子強度下，調pHpH至等電點，使蛋白質至等電點，使蛋白質所帶凈電荷為零，降低所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力了靜電斥力，而疏水力能使

36、分子間相互吸引，能使分子間相互吸引，形成沉淀的操作稱為等形成沉淀的操作稱為等電點沉淀電點沉淀不同的兩性電解質具有不同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為不同的等電點，以此為基礎可進行分離。基礎可進行分離。生產胰島素時，在粗提生產胰島素時，在粗提液中先調液中先調pH8.0pH8.0去除堿性去除堿性蛋白質，再調蛋白質，再調pH3.0pH3.0去除去除酸性蛋白質。酸性蛋白質。pH=pIn蛋白質的離子化情況既與蛋白質的詳細結構有關，也與蛋白質的離子化情況既與蛋白質的詳細結構有關，也與溶液的溶液的pHpH值有關。一般來說，溶液的值有關。一般來說，溶液的pHpH值高，蛋白質帶值高，蛋白質帶負電；負電；pH

37、pH值低，蛋白質帶正電。當溶液的值低，蛋白質帶正電。當溶液的pHpH值為某一值值為某一值時，蛋白質幾乎不帶電，即時，蛋白質幾乎不帶電，即凈電荷為零凈電荷為零，或者說它帶相，或者說它帶相等的正電荷和負電荷，這時的等的正電荷和負電荷，這時的pHpH值稱為等電點，常用值稱為等電點，常用pIpI表示。表示。n兩性電解質在溶液中兩性電解質在溶液中pHpH處于等電點處于等電點pIpI時，分子表面靜電時，分子表面靜電荷為零，導致賴以穩定的荷為零，導致賴以穩定的雙電層及水化膜削弱或破壞雙電層及水化膜削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低并沉淀析出。分子間引力增加，溶解度降低并沉淀析出。等電點沉淀法等電點沉淀法

38、等電點沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體等電點沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物系引入的外來物( (雜質雜質) )也少。也少。是一種常用的分離是一種常用的分離純化方法，純化方法，收率低：收率低：但兩性溶質（蛋白質）在等電點附近但兩性溶質（蛋白質）在等電點附近（處）仍有一定的溶解度，（處）仍有一定的溶解度，( (有時甚至比較大有時甚至比較大) )，所以所以等電點沉淀往往不完全。等電點沉淀往往不完全。即等電點沉淀法往即等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率。往不能獲得高的回收率。等電點沉淀的特點：等電點沉淀的特點：分辨率較低：許多分子的等電點比較接近，容易分辨率較低：許多分子的等電點

39、比較接近，容易發生共沉淀，所以分辨率較低。發生共沉淀，所以分辨率較低。因此很少單獨使因此很少單獨使用等電點沉淀法作為主要純化手段，往往與鹽析，用等電點沉淀法作為主要純化手段，往往與鹽析，有機溶劑沉淀等方法結合使用，在實際應用種主有機溶劑沉淀等方法結合使用，在實際應用種主要用于去雜蛋白。要用于去雜蛋白。n在蛋白質疏水性比較大和結合水比較小時的沉淀在蛋白質疏水性比較大和結合水比較小時的沉淀更有效。更有效。n最大缺點：最大缺點：無機酸有引起較大的蛋白質不可逆變無機酸有引起較大的蛋白質不可逆變性的危險。性的危險。 等電點沉淀注意事項等電點沉淀注意事項(1) 生物高分子的等電點易受鹽離子的影響發生變化。

40、生物高分子的等電點易受鹽離子的影響發生變化。 由于無機離子的影響，蛋白質的等電點通常會發生由于無機離子的影響，蛋白質的等電點通常會發生“漂移漂移”，陽，陽-高，陰高，陰-低。即：若蛋白質分子結合低。即：若蛋白質分子結合多量陽離子如：如多量陽離子如：如Zn2+、Ca2+ 、Mg2+等，會造成等等，會造成等電點升高；若蛋白質分子結合多量陰離子如：如電點升高；若蛋白質分子結合多量陰離子如：如Cl-、SO42-、HPO42-等，則等電點降低。等，則等電點降低。n自然界中許多蛋白質較易結合陰離子，自然界中許多蛋白質較易結合陰離子，使等電點向使等電點向酸側移動酸側移動。(2)在使用等電點沉淀時還應考慮目的

41、物的穩定性。在使用等電點沉淀時還應考慮目的物的穩定性。 有些蛋白質或酶在等電點附近不穩定。如有些蛋白質或酶在等電點附近不穩定。如-糜蛋糜蛋白酶白酶(pI=8.18.6)，胰蛋白酶，胰蛋白酶(pI=10.1)，它們在，它們在中性或偏堿的環境中由于自身或其他蛋白水解酶中性或偏堿的環境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。所以在實際操作中應避的作用而部分降解失活。所以在實際操作中應避免溶液免溶液pH上升至上升至5以上。以上。(3)生物大分子在等電點附近鹽溶作用很明顯。生物大分子在等電點附近鹽溶作用很明顯。 所以無論是單獨使用或與溶劑沉淀法合用，都必所以無論是單獨使用或與溶劑沉淀法合用，都必

42、須控制溶液的離子強度。須控制溶液的離子強度。4.4. 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法organic sovent organic sovent precipitationprecipitationl概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。l有機溶劑對于許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生有機溶劑對于許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。化物質都能發生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。l優點在于：優點在于：1 1）分辨

43、能力比鹽析法高，即蛋白質等只在一）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2 2）沉淀不用脫鹽，過）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；濾較為容易；l缺點是缺點是:1:1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2 2）操作要求在低溫下進行。）操作要求在低溫下進行。3 3）成本高）成本高l總體來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。總體來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法機理有機溶劑沉淀法機理 *A 降低溶劑介電常數降低溶劑介電常數（介電常數（

44、介電常數D有機有機 D水）水） ，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質、核酸分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質、核酸等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。淀。*B 破壞水化膜：破壞水化膜：由于使用的有機溶劑與水互溶，由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質分子周圍的水化它們在溶解于水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質分層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質分子的溶劑化能力，破壞蛋白質的水化層，使蛋白子的溶劑化

45、能力，破壞蛋白質的水化層，使蛋白質沉淀。質沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基團暴露并有機溶劑疏水基團結疏水基團暴露并有機溶劑疏水基團結合形成疏水層。合形成疏水層。有機溶劑沉淀法機理有機溶劑沉淀法機理降低介電常數破壞水化膜 后來又提出了另外一種說法，后來又提出了另外一種說法，認為有機溶劑沉淀認為有機溶劑沉淀法的機理是有機溶劑可能破壞蛋白質的某種鍵比法的機理是有機溶劑可能破壞蛋白質的某種鍵比如氫鍵，使其空間結構發生某種程度的變化，致如氫鍵，使其空間結構發生某種程度的變化，致使一些原來包在內部的疏水基團暴露于表面，并使一些原來包在內部的疏水基團暴露于表面，并與有機溶劑的疏水基團結合形成疏水作用，從而

46、與有機溶劑的疏水基團結合形成疏水作用，從而使蛋白質沉淀。當蛋白質的空間結構發生變形超使蛋白質沉淀。當蛋白質的空間結構發生變形超過一定程度時，便會導致完全的變性。過一定程度時，便會導致完全的變性。常用的有機溶劑沉析劑常用的有機溶劑沉析劑選擇依據：選擇依據：(水溶性要好，沉淀用溶劑一般需能與水無限混溶，水溶性要好，沉淀用溶劑一般需能與水無限混溶，一些與水部分混溶或微溶的溶劑如氯仿、乙醚等一些與水部分混溶或微溶的溶劑如氯仿、乙醚等也有使用，但使用對象和方法不盡相同。也有使用，但使用對象和方法不盡相同。(沉淀作用要強，介電常數要小沉淀作用要強，介電常數要小(致變性作用要小致變性作用要小(毒性要小、揮發

47、性適中。沸點過低雖有利于除去毒性要小、揮發性適中。沸點過低雖有利于除去和回收，但揮發損失較大，且不安全。給勞動保和回收，但揮發損失較大，且不安全。給勞動保護及安全生產帶來麻煩。護及安全生產帶來麻煩。(容易獲取容易獲取 沉淀蛋白質和酶常用的是沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮乙醇、甲醇和丙酮。沉淀。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇乙醇是最常用的沉淀劑。是最常用的沉淀劑。(乙醇：乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒，常用于蛋沉析作用強，揮發性適中，無毒，常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；(丙酮丙

48、酮：沉析作用大于乙醇，用量小。如代替乙醇可：沉析作用大于乙醇，用量小。如代替乙醇可減少用量減少用量1/4-1/3，但沸點低、揮發大、著火點低、，但沸點低、揮發大、著火點低、對肝臟有一定毒性。應用范圍不廣；對肝臟有一定毒性。應用范圍不廣；(甲醇：甲醇：沉析作用與乙醇相當，對蛋白質的變性作用沉析作用與乙醇相當，對蛋白質的變性作用比乙醇和丙酮都小，但由于口服有強毒，限制了它比乙醇和丙酮都小，但由于口服有強毒，限制了它的使用。的使用。(其他溶劑：其他溶劑：如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、2-甲甲基基-2,4-戊二醇戊二醇(MPD)，乙腈，也可作沉淀劑用，乙腈，也可作沉淀劑用，但

49、遠不如上述乙醇、丙酮、甲醇使用普遍。但遠不如上述乙醇、丙酮、甲醇使用普遍。(60%乙醇的介電常數是乙醇的介電常數是48，丙酮的介電常數是，丙酮的介電常數是22，2.5mol/L甘氨酸的介電常數很大，可以用甘氨酸的介電常數很大，可以用作蛋白質等生物高分子溶液的穩定劑。作蛋白質等生物高分子溶液的穩定劑。溶劑濃度的計算溶劑濃度的計算 V=V0(S2-S1)/( 100-S2) V- V-需加入的有機溶劑的體積；需加入的有機溶劑的體積； V Vo o-原溶液體積；原溶液體積； S S1 1-原溶液中有機溶劑的濃度；原溶液中有機溶劑的濃度； S S2 2-需達到的有機溶劑的濃度；需達到的有機溶劑的濃度；

50、該公式與鹽析公式一樣該公式與鹽析公式一樣未考慮混合后體積的變化未考慮混合后體積的變化，實，實際上等體積的乙醇和水相混后體積會縮小際上等體積的乙醇和水相混后體積會縮小5，如此，如此的體積變化對大多數工作影響不大，在有精確要求的的體積變化對大多數工作影響不大，在有精確要求的場合可按摩爾比計算，這樣可將體積變化因素抵消。場合可按摩爾比計算，這樣可將體積變化因素抵消。（1）溫度）溫度n低溫有利于防止溶質變性；低溫有利于防止溶質變性；有機溶劑與水混合時要產生相有機溶劑與水混合時要產生相當數量的熱量，從而使體系的溫度升高，增加有機溶劑對當數量的熱量，從而使體系的溫度升高，增加有機溶劑對蛋白質的變性作用。因

51、此，在使用有機溶劑沉淀生物高分蛋白質的變性作用。因此，在使用有機溶劑沉淀生物高分子時子時務必要控制在低溫下進行。務必要控制在低溫下進行。n另外低溫有利于提高收率（溫度越低，溶解度越小）。另外低溫有利于提高收率（溫度越低，溶解度越小）。由由于大多數蛋白質在乙醇于大多數蛋白質在乙醇- -水混合溶液中的溶解度隨溫度下水混合溶液中的溶解度隨溫度下降而減少，低溫對提高收率也是有利的。降而減少，低溫對提高收率也是有利的。有機溶劑沉淀法的影響因素有機溶劑沉淀法的影響因素n用有機溶劑沉淀蛋白質時必須嚴格控制溫度。用有機溶劑沉淀蛋白質時必須嚴格控制溫度。n蛋白質在有機溶劑存在時，溶解度多隨溫度升高蛋白質在有機溶

52、劑存在時，溶解度多隨溫度升高而增加，如果形成沉淀后溫度升高，沉淀可能重而增加，如果形成沉淀后溫度升高，沉淀可能重新溶解，如果溫度下降可能使沉淀增多新溶解，如果溫度下降可能使沉淀增多( (雜蛋白雜蛋白) )。n一般都要低溫操作。一般都要低溫操作。n在有的情況下，把沉淀后清液的溫度降低可沉淀在有的情況下，把沉淀后清液的溫度降低可沉淀出另一種產品，這就是所謂出另一種產品，這就是所謂溫差分級沉淀。溫差分級沉淀。A A、預冷、預冷：為了達此目的，常將待分離的溶液和有機溶劑分別：為了達此目的，常將待分離的溶液和有機溶劑分別進行預冷。后者最好預冷至進行預冷。后者最好預冷至-10-10-20-20，在具體操作

53、時還應，在具體操作時還應不斷攪拌。不斷攪拌。 攪拌的作用一方面是為了散熱，一方面為了防止溶劑局部過攪拌的作用一方面是為了散熱，一方面為了防止溶劑局部過濃引起的變性作用和分辨率下降現象發生。為了以上目的，濃引起的變性作用和分辨率下降現象發生。為了以上目的，溶劑的加入速度也須控制，不宜太快。溶劑的加入速度也須控制，不宜太快。B B、短時間的老化處理：、短時間的老化處理：為減少溶劑對蛋白的變性作用，通常為減少溶劑對蛋白的變性作用，通常使沉淀在低溫下作短時間的老化處理（使沉淀在低溫下作短時間的老化處理（0.5-2h0.5-2h）后即進行離）后即進行離心分離，接著真空抽去剩余的溶劑，或將沉淀溶入大量的緩

54、心分離，接著真空抽去剩余的溶劑，或將沉淀溶入大量的緩沖液中以稀釋溶劑，減少有機溶劑與目的產物的接觸。沖液中以稀釋溶劑，減少有機溶劑與目的產物的接觸。 控制溫度的具體做法：控制溫度的具體做法：（2）pHnpH對溶劑的沉淀效果影響很大，適宜的對溶劑的沉淀效果影響很大，適宜的pH可使沉淀效果可使沉淀效果增強，提高產品的收率，同時還可提高分辨率。增強，提高產品的收率，同時還可提高分辨率。n許多蛋白質在等電點附近有較好的沉淀效果，但不是所有的蛋白質都是這樣，甚至有少數蛋白質在等電點附近不太穩定。n在控制溶液pH時有一點要特別注意，即：務必使溶液中大務必使溶液中大多數蛋白質分子帶有相同電荷，而不要讓目的物

55、與主要雜多數蛋白質分子帶有相同電荷，而不要讓目的物與主要雜質分子帶相反電荷，以致出現較嚴重的共沉作用。質分子帶相反電荷，以致出現較嚴重的共沉作用。（3）離子強度）離子強度 n較低離子強度的存在往往有利于沉淀作用，甚至還有保護較低離子強度的存在往往有利于沉淀作用，甚至還有保護蛋白質，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩定介質蛋白質，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩定介質pH的作用。的作用。n用溶劑沉淀蛋白質時離子強度以用溶劑沉淀蛋白質時離子強度以0.01-0.05mol/L為好，通為好，通常不應超過常不應超過5%的含量。的含量。n如離子強度過高則溶劑用量大，沉淀物還會夾帶許多的鹽。如離子強度過高

56、則溶劑用量大，沉淀物還會夾帶許多的鹽。（4）樣品濃度）樣品濃度n與鹽析相似，樣品較稀時增加了溶劑投入量和損耗，降低與鹽析相似，樣品較稀時增加了溶劑投入量和損耗，降低了溶質收率，還易產生稀釋變性，但共沉作用小，分離效了溶質收率，還易產生稀釋變性，但共沉作用小，分離效果較好。果較好。n反之，濃的樣品會增強共沉作用，降低分辨率，然而減少反之，濃的樣品會增強共沉作用，降低分辨率，然而減少了溶劑用量，提高了回收率，變性的危險性也小于稀溶液。了溶劑用量，提高了回收率，變性的危險性也小于稀溶液。一般認為蛋白質的初濃度以一般認為蛋白質的初濃度以0.5%2%為好，粘多糖則以為好，粘多糖則以1%2%較合適。較合適

57、。 （5）金屬離子助沉作用）金屬離子助沉作用n在用溶劑沉淀生物高分子時還須注意到一些金屬離在用溶劑沉淀生物高分子時還須注意到一些金屬離子如子如ZnZn2+2+，CaCa2+2+等可與某些呈陰離子狀態的蛋白質等可與某些呈陰離子狀態的蛋白質形成復合物。形成復合物。n這種復合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，這種復合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑耗量，有利于沉淀形成，并降低溶劑耗量，0.005-0.005-0.02mol/L0.02mol/L的的ZnZn2+2+可使溶劑用量減少可使溶劑用量減少l/3l/3至至1/21/2，使，使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的

58、陰離子用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子的存在的存在( (如磷酸根如磷酸根) )。實際操作時往往先加溶媒沉淀。實際操作時往往先加溶媒沉淀除去雜蛋白，再加除去雜蛋白，再加ZnZn2+2+沉淀目的物。沉淀目的物。n某些大分子聚合物，具有沉淀蛋白質的作用。某些大分子聚合物，具有沉淀蛋白質的作用。n非離子多聚物是非離子多聚物是20世紀世紀60年代發展起來的一類重年代發展起來的一類重要沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白要沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白(IgG)和沉和沉淀一些細菌與病毒，近年來逐漸廣泛應用于核酸淀一些細菌與病毒，近年來逐漸廣泛應用于核酸和酶的分離純化。和酶的分離純化。n所用非離子

59、多聚物包括所用非離子多聚物包括各種不同分子量各種不同分子量的：的：聚乙聚乙二醇二醇(PEG)、壬苯乙烯化氧、壬苯乙烯化氧(NPEO)、葡聚糖、右、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。旋糖苷硫酸酯。4.5 非離子型聚合物非離子型聚合物聚乙二醇聚乙二醇n結構式：結構式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OHnPEG相對分子質量從相對分子質量從200D到到20KDa的不同聚合程的不同聚合程度的產品都是有效的。度的產品都是有效的。n通常在蛋白質沉淀中使用通常在蛋白質沉淀中使用PEG-6000或或PEG-4000。使用使用PEG沉淀分離蛋白質方法的優點沉淀分離蛋白質方法的優點 沉淀溫度只需控制在室溫條

60、件下；沉淀溫度只需控制在室溫條件下； 沉淀的顆粒往往比較大，產物比較容易收集；沉淀的顆粒往往比較大，產物比較容易收集； PEG非但不會使蛋白質變性，而且可以提高它的非但不會使蛋白質變性，而且可以提高它的穩定性。穩定性。使用使用PEG沉淀分離蛋白質方法的缺點沉淀分離蛋白質方法的缺點1、PEG比其他沉淀劑更難從蛋白質溶液中除去，為比其他沉淀劑更難從蛋白質溶液中除去，為此需用超濾和液液萃取來解決。此需用超濾和液液萃取來解決。2、價格較昂貴。、價格較昂貴。n一是一是選用兩種水溶性非離子多聚物組成液選用兩種水溶性非離子多聚物組成液- -液兩相系統。液兩相系統。使使生物大分子或微粒在兩相系統中不等量分配，