1、細(xì)菌形態(tài)學(xué)分類(lèi)一乳酸桿困乳酸桿菌的基本屬性：乳酸菌為一群可發(fā)酵碳水化合物以獲取能量，并生成大量乳酸的一類(lèi)細(xì)菌的總稱。利用發(fā)酵技術(shù)保藏食品，最典型的是通過(guò)乳酸菌的發(fā)酵。這在發(fā)酵乳工業(yè)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。利用天然的或經(jīng)篩選的乳酸菌發(fā)酵，已經(jīng)生產(chǎn)出多種不同類(lèi)型的發(fā)酵乳。因而分離和鑒定乳酸菌對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)和生活都具有非常重要的意義。無(wú)芽抱，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。微好氧，厭氧發(fā)酵，最適溫度 3040 攝氏度，最適 PH 值為 5.56.2,在微酸環(huán)境下可以生長(zhǎng)，中性或者偏堿性環(huán)境中則生長(zhǎng)速率下降。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，通常厭氧條件或者減少氧氣壓力和充有體積分?jǐn)?shù)為 5%10%的 CO2可以增加其表面生長(zhǎng)物，有

2、些菌株在分離時(shí)就是厭氧的。（一）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑：實(shí)驗(yàn)儀器：現(xiàn)有的儀器：欠缺的儀器：培養(yǎng)基和試劑：培養(yǎng)基：BCP 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基和 SL 培養(yǎng)基BCP 培養(yǎng)基：酵母膏 25g,蛋白陳 5g,葡萄糖 5g,澳甲酚紫 0.04g,瓊脂 15g,蒸儲(chǔ)水 1000ml,pH70;MRS 培養(yǎng)基（可以培養(yǎng)包括雙岐乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌）：重量（g）牛肉蛋白粉 10,魚(yú)肉汁 10,酵母浸出汁粉 5,葡萄糖 20,醋酸鈉 5,檸檬酸二鏤 2,吐溫 800.1,硫酸鎂 0.58,硫酸鎰 0.28,品質(zhì)管理檢測(cè)項(xiàng)目O1歷桿,科劃埃?？搜┍坛鄬偈┝①U.法門(mén)屬，事?tīng)柾幢?中*置*.等新不動(dòng)桿ft鼻胞y

3、y-MW曲杵布良MS-KV*施特氏爻肯巴瞬桿軍團(tuán)屬厭氧草竺陽(yáng)性革蘭陰性蒸溜水 1000ml,備注：用高壓鍋在 121c 滅菌 15min,調(diào)節(jié) pH6.26.4。乳酸桿菌選擇性瓊脂 SL：酪蛋白水解物 10g;酵母提取物 5g;檸檬酸二鏤 2g;乙酸鈉(CH3COONa?3H2O)25g;MgSO4?7H2O0.58g;瓊月旨 15g；葡萄糖 20g；吐溫 801.0ml;磷酸氫二鉀 6g；FeSO4?7H2O0.03g；MnSO4?4H2O0.15g。以上用量為 1000ml 培養(yǎng)基的用量。溶解瓊脂在500ml 的沸水中，溶解其他組分在 500ml 的水中，用冰醋酸調(diào) pH=5.4,并混合已

4、融化的瓊脂，進(jìn)一步煮沸 5 分鐘，傾倒平板或此熱的培養(yǎng)基適量分裝入滅菌的試管，這樣無(wú)需進(jìn)一步滅菌，避免重復(fù)融化和冷卻。乳酸桿菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況背景資料：培養(yǎng)基有 MRS 培養(yǎng)基、 RSMA 培養(yǎng)基、 番茄汁瓊脂培養(yǎng)基。 當(dāng)乳酸桿菌是待分離區(qū)系的優(yōu)勢(shì)菌時(shí)，常用 MRS 培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行分離。一些常見(jiàn)的食品污染菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等在 MRS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差或幾乎不生長(zhǎng)，從而減少了雜菌的污染，降低了分離難度。目前 MRS 培養(yǎng)基已經(jīng)成為國(guó)標(biāo)上公認(rèn)的用于乳酸桿菌分離較好的培養(yǎng)基。 常用于從乳酸桿菌發(fā)酵制品中分離菌種以及菌種分離后的傳代培養(yǎng)。番茄汁瓊脂培養(yǎng)基，這是一種傳統(tǒng)的用于分離乳酸

5、桿菌的培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)基由于含有一定量的番茄汁，為乳酸桿菌的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)，使得乳酸桿菌在此環(huán)境下更容易生長(zhǎng)。但由于配置過(guò)程中需要制備新鮮番茄汁，所以操作起來(lái)較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前已逐漸被 MRS等培養(yǎng)基所代替。某些選擇性培養(yǎng)基可用于從菌群復(fù)雜的基質(zhì)(例如腸道)內(nèi)進(jìn)行乳酸桿菌的分離。APT(AllPurposeTween)培養(yǎng)基通常用于從肉制品中分離乳酸桿菌，改良的 RogosaSL(RogosaSodiumLactateModified)完全選擇性培養(yǎng)基則常用于胃腸內(nèi)容物中乳酸桿菌的分離。Briggs瓊脂培養(yǎng)基和 sL(SodiumLactate)培養(yǎng)基常用于酸奶中乳酸桿菌分離。(二)檢測(cè)內(nèi)

6、容、流程、方式：內(nèi)容：1 通過(guò)對(duì)水體當(dāng)中的的乳酸桿菌的篩選培養(yǎng)，最后計(jì)數(shù)得到相應(yīng)水體當(dāng)中的乳酸桿菌的數(shù)量。方法為：逐級(jí)稀釋法。2 乳酸桿菌的定性流程：采集：每個(gè)采集點(diǎn)各自采集 10ml 的池塘水，經(jīng)過(guò)過(guò)濾雜質(zhì)(固體)，冷凍運(yùn)送等環(huán)節(jié)送到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部。稀釋平板測(cè)數(shù)法1、樣品稀釋液的制備準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品 10g,放入裝有 90mL 無(wú)菌水并放有小玻璃珠的 250mL 三角瓶中， 用手或置搖床上振蕩 20min,使微生物細(xì)胞分散，靜置 2030s,即成 101稀釋液；再用 1mL 無(wú)菌吸管，吸取 101稀釋液 1mL,移入裝有 9mL 無(wú)菌水的試管中，吹吸 3 次，讓菌液混合均勻，即成 102稀釋液；

7、再換一支無(wú)菌吸管，吸取 102稀釋液 1mL,移入裝有 9mL 無(wú)菌水的試管中，也吹吸 3 次，即成 103稀釋液；以此類(lèi)推，連續(xù)稀釋?zhuān)瞥?10 一4、10 一5、106、107、108、109等一系列稀釋菌液。用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí)，待測(cè)菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測(cè)菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測(cè)定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí)，采用 107、10-8、109稀釋度，測(cè)定土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用 10 一4、10 一5、10 一6稀釋度，測(cè)定放線菌數(shù)量時(shí)，采用 10 一3、104、105稀釋度，測(cè)定真菌數(shù)量時(shí)，采用 102103104稀釋度。2、平板接種培養(yǎng)平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和

8、涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。混合平板培養(yǎng)法將無(wú)菌平板編上 107、10-8、109號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)，用無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取 1X10-9稀釋?各 1mL 放入編號(hào) 109的 3 個(gè)平板中，同法吸取 108稀釋液各 1mL 放入編號(hào) 1M08的 3 個(gè)平板中，再吸取 1X10-7稀釋?各 1mL 放入編號(hào) 1*10 一7的 3 個(gè)平板中，由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換。然后在 9 個(gè)平板中分別倒入已熔化并冷卻至 4550c 的細(xì)菌培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷凝后倒置，在 30C 下培養(yǎng)。至菌落長(zhǎng)出后即可計(jì)數(shù)。涂抹平板計(jì)數(shù)法涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同，所不同

9、的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無(wú)菌吸管吸取 0.1mL 菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上，每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)。再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上 2030min,使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出后即可計(jì)數(shù)。圖示稀釋平板測(cè)數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)劃線法（不采用，因?yàn)樾枰獙?duì)乳酸菌和大腸桿菌進(jìn)行篩選培養(yǎng)）：用滅菌接種環(huán)沾取 10-1 稀釋液 1 環(huán)于已凝固的平板上進(jìn)行劃線（圖示）。劃線可按以下兩種方式進(jìn)

10、行，一種為交叉劃線法，是在平板的一邊做第一次Z 字形劃線。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿 70。角，將接種環(huán)在火上燒過(guò)并冷卻后，通過(guò)第一次劃線部分，做第二次Z字形劃線。同法進(jìn)行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法，是從平板邊緣的一點(diǎn)開(kāi)始，連續(xù)作緊密的波浪式劃線，直至平板中央。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿 180。，再?gòu)钠桨辶硪贿叄ú粺臃N環(huán)）同樣劃線至平板中央。劃線法實(shí)質(zhì)上屬于一種由點(diǎn)到線”的稀釋法，較適用于含菌比較單一的材料的純化，對(duì)于土壤這類(lèi)微生物高度混雜的樣品則較少使用。以上各種分離法，都應(yīng)按無(wú)菌操作進(jìn)行。所用的培養(yǎng)基若在倒平板前，按 50 四/mL 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放線菌酮（起抑制霉菌的作用），效果會(huì)更好。

11、3、培養(yǎng)（16 個(gè)小時(shí)即可）將上述接種過(guò)土壤懸液的平板倒置，于 2830c 培養(yǎng)，至長(zhǎng)出菌落為止（2436h）。4、挑菌純化在平板上選擇分離較好的有代表性的單菌落接種斜面，同時(shí)作涂片檢查，若發(fā)現(xiàn)不純，應(yīng)挑取此菌落做進(jìn)一步劃線分離，或制成菌懸液再做稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體。5、計(jì)數(shù)a1”單選取混菌法和涂抹法中每皿菌落數(shù) 30300 的平板，分別按稀釋平板測(cè)數(shù)法”中的混合平板測(cè)數(shù)法”和涂抹平板測(cè)數(shù)法”中的公式計(jì)數(shù)。這樣求得的是每克原始土樣中的活菌數(shù)，若要折算為每克干土的含菌數(shù)，還應(yīng)將此數(shù)值除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（烘干土的質(zhì)量/原土樣白質(zhì)量）。（四）數(shù)據(jù)的收集整理：數(shù)據(jù)庫(kù)模板的建立二大腸桿

12、菌（一）大腸桿菌的基本屬性：（二）儀器和試劑：儀器：試齊 I：液態(tài)培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)該在 950ml 去離子水中加入：胰化蛋白月東 10g,酵母提取物5g,NaCl10g。搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解.用 5mol/LNaOH 調(diào) pH 至 7.0 用去離子水定容至 1L.在 15Psi 高壓下蒸汽滅菌 20min。固態(tài)培養(yǎng)基： LB 固體培養(yǎng)基 1L 和液體一樣， 加 15g 瓊脂粉， 一定要在溫度降下之前加好抗生素，并且倒好板。LB 固體培養(yǎng)基倒板1 .配制：100mlLB 培養(yǎng)基加入 1.5g 瓊脂粉。2 .抗生素的加入：高壓滅菌后，將融化的 LB 固體培養(yǎng)基置與 55c 的水浴中，待培

13、養(yǎng)基溫度降到 55c 時(shí)（手可觸摸）加入抗生素，以免溫度過(guò)高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。3 .倒板：一般 10ml 倒 1 個(gè)板子。培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開(kāi)蓋子，在紫外下照 10-15 分鐘。4 .保存：用封口膠封邊，并倒置放于 4c 保存，一個(gè)月內(nèi)使用。（1）普通培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加 1.5%瓊脂制成，先配液體培養(yǎng)基，然后加入 1.5%瓊脂，高壓滅菌 20min,取出后再無(wú)菌狀態(tài)下鋪平板（2）選擇性培養(yǎng)基：將消毒好的固體培養(yǎng)基置室溫下冷卻 50c 時(shí)加抗生素或其他必加成分，搖勻后倒入滅菌皿中厚度 2-3mm,室溫固化。（抗生素用三蒸水溶解后，用無(wú)菌濾頭過(guò)濾到無(wú)菌瓶中，氨芳青霉

14、素終濃度 50l/ml 新制備的固體培養(yǎng)基較濕，鋪上的液體不易吸收，可在室溫下放 2-3 天，或37c 放半小時(shí)，然后 4c 保存?zhèn)溆?。?）LB 培養(yǎng)基中所用抗生素終濃度：氨茉青霉素-50 口/ml;氯霉素-20 口/ml;慶大霉素-15科l/刑卡那霉素-30科l/ml春日霉素-1000科l/刑壯觀霉素-100科l/刑鏈霉素-30科l/ml四環(huán)素-12l/mk（三）培養(yǎng)檢測(cè)方法：乳品中大腸桿菌檢測(cè)國(guó)標(biāo) GB/T4789.38-2008 的具體步驟及達(dá)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)：第一法大腸桿菌 MPN 計(jì)數(shù)操作步驟6.1、 樣品的稀釋6.1.1、固體和半固體樣品：以無(wú)菌操作取 259 樣品，置盛有 225mL

15、磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)， 8000r/min1000r/min 均質(zhì) 1min2min,制成 l:10 樣品勻液， 或置盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min2min 制成 1:10的樣品勻液。6.1.2、液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取樣品 25mL 置盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）中，充分振搖，制成 1:10 的樣品勻液。6.1.3、樣品勻液的 pH 值應(yīng)在 6.57.5 之間，必要時(shí)分別用 1mol/L 氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L 鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。6.1.4、用 1mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10

16、 樣品勻液 1mL,沿管壁徐徐注人盛有 9mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支 1mL 無(wú)菌吸管或吸頭反復(fù)吹打，使其棍合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。6.1.5、根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成 10 倍遞增系列樣品勻液。每遞增稀釋1次， 換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。 從制備樣品勻液至樣品接種完畢， 全過(guò)程不得超過(guò)15min。6.2、 初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇 3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液）。每個(gè)稀釋度接種 3 管月桂基磺酸鹽胰蛋白陳（LST）肉湯，每管接種 1mL（如接種量超過(guò) 1mL,則用

17、雙料 LST 肉湯）。36C1C 培養(yǎng) 24hi2h,觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h+2h。記錄在 24h48h 內(nèi)產(chǎn)氣的 LST 肉湯管數(shù)。如所有 LST 肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸桿菌MPN 結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。6.3、 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)分別從所有培養(yǎng) 48h2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的 LST 肉湯管中取培養(yǎng)物 1 環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至 45C 的 EC 肉湯管中，放人帶蓋的 44.5C/C 水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng) 24hi2h,檢查小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h2h。記錄在 24h 和 48h 內(nèi)產(chǎn)氣的

18、EC 肉湯管數(shù)。 如所有 EC 肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸桿菌 MPN 結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行 EMB 平板分離培養(yǎng)。6.4、 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng)輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物劃線分別接種于 EMB 平板，36C1C培養(yǎng) 18h24h。檢驗(yàn)平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。6.5、 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)從每個(gè)平板上挑 5 個(gè)典型菌落，如無(wú)典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，36CC,培養(yǎng)18h24h。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。6.6、 生化試驗(yàn)6.6.1、靛基質(zhì)試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種蛋白陳水，36CC 培養(yǎng) 24hj2h 后

19、，加 Kovacs 靛基質(zhì)試劑 0.2mL0.3mL，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。6.6.2、 MR-VP 試驗(yàn)： 將培養(yǎng)物接種 MR-VP 培養(yǎng)基， 36C1C 培養(yǎng) 48hd2h。移取培養(yǎng)物 1mL至 13mnK100mm 試管中，加 5%笫蔡酚乙醇溶液 0.6mL、40%氫氧化鉀溶液 0.2mL 和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置 2h,如出現(xiàn)伊紅色，為 VP 試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR-VP 培養(yǎng)液的剩余部分再培養(yǎng) 48h 后滴加 5 滴甲基紅指示劑。培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。6.6.3、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種 Koser 氏檸檬酸鹽肉湯，36C1C 培養(yǎng) 96

20、h2h,記錄有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。6.7、 大腸桿菌 MPN 計(jì)數(shù)的報(bào)告大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC 生化試驗(yàn)為+-或-+-。只要有 1 個(gè)菌落鑒定為大腸桿菌，其所代表的LST 肉湯管即為大腸桿菌陽(yáng)性。依據(jù) LST 肉湯陽(yáng)性管數(shù)查 MPN 表，報(bào)告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌 MPN 值。第二法大腸桿菌 VRB-MUG 平板計(jì)數(shù)法8、樣品稀釋按 6.1 進(jìn)行。9、檢驗(yàn)選取 2 個(gè)3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別取 1mL 注人兩個(gè)無(wú)菌平皿。 另取 1mL 稀釋液注人一個(gè)無(wú)菌平皿中， 作空白對(duì)照。 將 45C10.5C 的 VRB 瓊脂 10mL15m

21、L 傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加 3mL4mLVRB-MUG 瓊脂覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，361C 培養(yǎng) 18h24h。選擇菌落數(shù)為 10100 的平板，暗室中 360nm366nm 波長(zhǎng)紫外燈照射下，計(jì)數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。檢驗(yàn)時(shí)用已知 MUG 陽(yáng)性菌株（如大腸桿菌 ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如 ATCC13048）做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。10、大腸桿菌平板計(jì)數(shù)的報(bào)告兩個(gè)平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數(shù)，以 CFU/g（CFU/mL）表示。第三法大腸桿菌 PetrifilmTM 測(cè)試片計(jì)數(shù)法12、樣品稀釋按 6.1 進(jìn)行。13、檢驗(yàn)接種和培養(yǎng)選取 2 個(gè)3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液， 每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。 將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，。揭開(kāi)上層膜，用吸管吸取樣品勻液 1ml