1、第二章第二章 基因操作的主要技術原理基因操作的主要技術原理 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 它是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，同時也是分子生物學研究方法的技術基礎。 基本原理 帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應活性的穩定的介質（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負極移向正極。根據核酸分子大小不同、構型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。 電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構型的核酸分子，構型緊密的

2、比松散型的開環DNA分子或線性DNA分子遷移率要快 凝膠電泳的分辨力： 與凝膠的類型類型和密度密度相關 瓊脂糖凝膠的分辨力在0.250Kb之間; 聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之間瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。 分為常熔點的瓊脂糖和低熔點（LMP）瓊脂糖。 LMP瓊脂糖 熔點：6265 熔解后，在37 可保持液態數小時； 在25 可保持液態約10min 回收DNA分子 在65 下將LMP瓊脂糖凝膠熔化； 加入過量的酚抽提DNA； 離心獲得含DNA分子的上清液； 直接酶切 瓊脂糖凝膠電泳的參數： 緩沖液：1 TAE（TBE TPE） 凝膠的含量：根據檢測的D

3、NA大小 加DNA樣品：0.5mM50% at 95 for 40 min1.110-4 substitutions per cycle0.5mM10mM5 to 3only5 adenosines PCR引物： 與待擴增的靶DNA區段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。 1.其長度通常在1530個核苷酸之間。 2.簡并引物 atggctant 3.嵌套引物嵌套引物 PCR擴增的長度：腺嘌呤腺嘌呤(A)的的N3 410倍倍 在六氫吡啶的作用下，從脫氧核糖上在六氫吡啶的作用下，從脫氧核糖上移去移去2個磷酸分子，使個磷酸分子，使DNA鏈在甲基化的鏈在甲基化的鳥嘌呤鳥嘌呤G位點斷裂。位點斷裂。CS

4、載體系統：末端標記載體載體系統：末端標記載體 核酸內切酶核酸內切酶Th111 特點：特點： 1. 產生產生5單堿基的突出末端，便于標記；單堿基的突出末端，便于標記； 2. Th111 位點十分位點十分稀少稀少； 3. 5突出末端可以是突出末端可以是G或或A，也可以是，也可以是T 或或C，選擇性強；，選擇性強； 4. 在載體中具有兩個在載體中具有兩個Th111 位點，可對位點，可對克隆在載體上的片斷任何一段作選擇性克隆在載體上的片斷任何一段作選擇性標記。標記。化學修飾法的優點：化學修飾法的優點： 1. 不需要體外酶切；不需要體外酶切； 2. 只要有末端標記，無論只要有末端標記，無論單雙鏈單雙鏈都

5、可用來都可用來測序。測序。 250個個bp 限制因素：測序膠的分辨率限制因素：測序膠的分辨率 DNA測序分析的自動化測序分析的自動化 用四甲基若丹明（用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作熒光劑，預先標記作熒光劑，預先標記M13引物引物DNA5-末端，末端，按標準的雙脫氧鏈終止法同引物進行反應，按標準的雙脫氧鏈終止法同引物進行反應，用聚丙烯酰胺電泳分析。在電泳過程中，用用聚丙烯酰胺電泳分析。在電泳過程中，用激光激發電泳的片斷產生熒光，被熒光感受激光激發電泳的片斷產生熒光，被熒光感受器接受，最終轉換成電信號，被計算機讀出，器接受，最終轉換成電信號，被計算機讀出，或打印出來或

6、打印出來 DNA雜交測序（雜交測序（sequence by hybridization）SBH 原理：原理： 如果一段短的如果一段短的DNA探針能夠與較長的靶探針能夠與較長的靶DNA片斷雜交，并形成完全的雙鏈體分子，片斷雜交，并形成完全的雙鏈體分子，那么我們便可以根據此來推斷在靶那么我們便可以根據此來推斷在靶DNA序序列長存在著相應的互補序列。列長存在著相應的互補序列。 步驟：步驟： 1.將待測的靶將待測的靶DNA分子與一組已知核苷分子與一組已知核苷酸序列的寡核苷酸探針進行雜交酸序列的寡核苷酸探針進行雜交 2. 對能與待測對能與待測DNA雜交的探針之間的雜交的探針之間的堿基重疊關系作比較分析，

7、據此推算靶堿基重疊關系作比較分析，據此推算靶DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。 兩種操作方式：兩種操作方式： 1. 將不同的寡核苷酸與固定在濾膜上的將不同的寡核苷酸與固定在濾膜上的靶靶DNA序列樣品進行雜交序列樣品進行雜交 2. 應用寡核苷酸矩陣芯片的應用寡核苷酸矩陣芯片的DNA雜交測雜交測序法序法 雜交的檢測：雜交的檢測： 磷光成像儀和圖象分析軟件磷光成像儀和圖象分析軟件 錯配錯配的堿基會導致雜交信號強度下降。的堿基會導致雜交信號強度下降。 6mer 500bp 7mer 2000bp 8mer 8000bp SBH的應用：的應用： 1.檢測靶檢測靶DNA的單堿基突變的單堿基突變 2. 用于不同片斷之間的序列比較分析用于不同片斷之間的序列比較分析 （同源性序列檢測）（同源性序列檢測） 3. 用表達序列標簽（用表達序列標簽（EST）的矩陣芯片，）的矩陣芯片，檢測