1、Time resolved FluoroimmunoassayTime resolved FluoroimmunoassayTRFIATRFIA第二軍醫大學實驗診斷教研室第二軍醫大學實驗診斷教研室長征醫院實驗診斷科長征醫院實驗診斷科全軍臨床免疫中心全軍臨床免疫中心譚龍益譚龍益 博士博士 qABO血型檢測血型檢測q細菌鑒定細菌鑒定q肥大氏反應肥大氏反應q瓊脂糖擴散試驗瓊脂糖擴散試驗q免疫電泳免疫電泳q放射免疫分析技術放射免疫分析技術 radioimmunoassay RIAradioimmunoassay RIA靈敏度高：達到靈敏度高：達到ng甚至甚至pg水平水平特異性強特異性強重復性高重復性高

2、標本用量少標本用量少極大地推動了臨床和科研進步極大地推動了臨床和科研進步標記原理為以后的檢測技術的發展奠定了基礎。標記原理為以后的檢測技術的發展奠定了基礎。同位素高度靈敏免疫反應特異性同位素高度靈敏免疫反應特異性w125125I I的半衰期短而導致其試劑有效期短。的半衰期短而導致其試劑有效期短。w標記物標記物125125I I的穩定性差，導致試劑盒批間、批內的的穩定性差，導致試劑盒批間、批內的變異較大；標準曲線有效期短，必須每次定標，造變異較大；標準曲線有效期短，必須每次定標，造成浪費。成浪費。w操作繁瑣，出報告時間長。操作繁瑣，出報告時間長。w無法保存備用。無法保存備用。w放射性（放射性（1

3、25125I I），對環境的污染及對身體的危害，），對環境的污染及對身體的危害，已經為重視環保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅已經為重視環保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）尚存幾個放免試驗室）酶免疫分析法酶免疫分析法enzyne immunoassay EIA enzyne immunoassay EIA 避免了對環境和人體危害。避免了對環境和人體危害。試劑有效期較長。試劑有效期較長。操作簡單，不需要特殊設備，容易推廣。操作簡單，不需要特殊設備，容易推廣。 曾經一度被認為是取代放免的檢測手段。曾經一度被認為是取代放免的檢測手段。酶的高效催化免疫反應特異性酶的高效催化免疫反應特異

4、性w靈敏度、重復性不及放免，易造成漏檢和靈敏度、重復性不及放免，易造成漏檢和假陽性。假陽性。w因酶的純度和反應過程容易受環境因素影因酶的純度和反應過程容易受環境因素影響，導致穩定性不好。響，導致穩定性不好。化學發光免疫分析法（化學發光免疫分析法（CLIACLIA） chemiluminescen immunoassaychemiluminescen immunoassay單個樣本檢測速度快，適合做急診。單個樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。靈敏度較高。自動化程度高。自動化程度高。光反應的高度靈敏免疫反應特異光反應的高度靈敏免疫反應特異 發光過程短，樣品不能重復檢測。發光過程短，樣品不能重

5、復檢測。 本底較高，易受環境物質干擾。本底較高，易受環境物質干擾。 試劑穩定性較差，需多次定標。試劑穩定性較差，需多次定標。 檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。方面能力不足。 非開放性試劑；試劑價格高。非開放性試劑；試劑價格高。電化學發光免疫分析（電化學發光免疫分析（ECLECL） electrochemiluminescenceelectrochemiluminescencew8080年代末期問世的新型化學發光免疫分析方法。年代末期問世的新型化學發光免疫分析方法。電化學免疫反應電化學免疫反應電化學發光底物電化學發光底物- - 三聯吡啶釕三聯

6、吡啶釕 N N羥基琥珀酰胺羥基琥珀酰胺(NHS)(NHS)酯酯電極表面的電化學發光反應電極表面的電化學發光反應本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。可以作急診可以作急診w非開放性試劑系統。非開放性試劑系統。w試劑價格過高。試劑價格過高。免疫熒光測定技術免疫熒光測定技術(IFA)(IFA)Immunofluorescence assayImmunofluorescence assay熒光物質免疫反應熒光物質免疫反應細胞免疫、微生物、自身免疫等細胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高敏感度不高 本底高本底高鑭系元素標記技術免疫反應鑭系元素標記技術免疫反應一、基本原理

7、固相固相Ab受檢受檢抗原抗原Eu標記標記抗體抗體ExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitation二、二、TRFIATRFIA的主要特點的主要特點（一）靈敏度高、特異性強（一）靈敏度高、特異性強w酶聯免疫酶聯免疫（精度：（精度：1010-9 -9 mol/L mol/L ）w放射免疫放射免疫（精度：（精度：1010-12-12mol/L mol/L ）w化學發光化學發光（精度：（精度：1010-15-15mol/L mol/L ） 電化學發光電化學發光（精度：（精度：1010-17-1

8、7mol/L mol/L ）w時間分辨熒光時間分辨熒光（精度：（精度：1010-18-18mol/L mol/L ）w生物芯片生物芯片試劑試劑 DELFIA Immulite ACS-180AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/mCEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/LTSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/mlFSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/m 0.3-200mU/mlPro

9、g0.08-120nmol/L 無無 0.1-40ng/mlProlactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/mlq以上數據均出自于各制造廠家自己的產品說明書以上數據均出自于各制造廠家自己的產品說明書鑭系元素：鑭系元素：1515種種 EuEu、TbTb、 SmSm、 NdNd、 Dy Dy EuEu螯合物螯合物激發光激發光熒光熒光EuEu螯合物熒光的特點螯合物熒光的特點高強度高強度長壽命長壽命EuEu螯合物螯合物714000ns714000ns1 Eu螯合物的熒光衰變時間很長，極大地降低螯合物的熒光衰變時間很長，極大地降低了檢測背景。了檢測背景。20

10、0800400600熒光強度熒光強度激發激發短壽命熒光短壽命熒光白蛋白白蛋白 4.1ns球蛋白球蛋白 3.0nsFITC 4.5ns測量時間測量時間新循環新循環1000次循環次循環/s2 stokes2 stokes位移大位移大, ,激發光譜與發射光譜無重疊激發光譜與發射光譜無重疊, ,很容易排除散射光對發射光譜的影響很容易排除散射光對發射光譜的影響. .stokesstokes位移位移: :最大激發波長至最大發射波長最大激發波長至最大發射波長 之間的距離之間的距離激發光激發光發射光發射光Eu螯合物熒光光譜螯合物熒光光譜300600400500波長波長nm熒光強度熒光強度273nm異硫氰酸熒光

11、素發射光譜異硫氰酸熒光素發射光譜300600400500波長波長nm熒光強度熒光強度發射光發射光激發光激發光50nmEu螯合物熒光光譜螯合物熒光光譜300600400500波長波長nm熒光強度熒光強度異硫氰酸熒光素發射光譜異硫氰酸熒光素發射光譜300600400500波長波長nm熒光強度熒光強度3 3 激發光譜帶較寬、可增加激發能，提高靈敏度激發光譜帶較寬、可增加激發能，提高靈敏度4 4 發射光譜很窄，發射光譜很窄，50%50%的發射光譜寬度的發射光譜寬度10nm10nm，利用利用6156155 5范圍的濾光片，只允許此波段內范圍的濾光片，只允許此波段內發射光通過并被檢測，排除其它波長的熒光，

12、發射光通過并被檢測，排除其它波長的熒光，一方面降低了背景，另一方面使能量消耗減一方面降低了背景，另一方面使能量消耗減少，提高提高檢測靈敏度。少，提高提高檢測靈敏度。異硫氰酸熒光素發射光譜異硫氰酸熒光素發射光譜300600400500波長波長nm熒光強度熒光強度Eu螯合物熒光光譜螯合物熒光光譜300600400500波長波長nm熒光強度熒光強度5 Eu5 Eu螯合物有相對高的比活性螯合物有相對高的比活性比活性：單位時間內，每個標記分子的可探比活性：單位時間內，每個標記分子的可探 測事件的數目測事件的數目 熒光物質相對比活性很高熒光物質相對比活性很高 原因：在測定原因：在測定時，熒光物質可反復被激

13、活。時，熒光物質可反復被激活。基態基態激發態激發態激發光激發光躍遷躍遷發射熒光發射熒光常用標記物的相對比活性常用標記物的相對比活性125125I I標記物標記物 1 1個個可探測事件可探測事件/s/7.5/s/7.5* *10106 6分子分子化學發光標記物化學發光標記物 1 1個個可探測事件可探測事件/s/s/標記分子標記分子熒光標記物熒光標記物 很多個很多個可探測事件可探測事件/s/s/標記分子標記分子（二）線性范圍寬（二）線性范圍寬標準曲線穩定，試劑保質期長標準曲線穩定，試劑保質期長0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3DE

14、LFIA hFSHN=6時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩定，時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標線定標（三）重復性好（三）重復性好 同一標本連續同一標本連續2020次檢測，次檢測，CVCV值值22。 同一批（同一批（1010個）標本連續個）標本連續3 3天檢測，其天檢測，其CVCV值值=2.9%=2.9%。 檢測后反應板連續檢測后反應板連續3 3天重復閱讀，天重復閱讀，CV 1CV 1TRFIATRFIA檢測檢測HBsAgHBsAg的重復性的重復性6003007002001000- 50100時間延遲

15、（時間延遲（微秒）微秒）強度強度發射光波長（納米）發射光波長（納米）500利用不同波長和不同時間檢測，利用不同波長和不同時間檢測， 在同一孔中可測量多個鑭系元素的量在同一孔中可測量多個鑭系元素的量（四）同一標本孔同時檢測多個項目（四）同一標本孔同時檢測多個項目技術技術特點特點檢驗先進性檢驗先進性時間分辨時間分辨光譜分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離特異性熒光與非特異性熒光分離發射熒光與激發熒光分離發射熒光與激發熒光分離零本底、高特異性零本底、高特異性解離解離- -增強增強熒光性大大提高熒光性大大提高穩定的熒光螯合物穩定的熒光螯合物線性范圍更寬線性范圍更寬重復性更好重復性更好原子標記原子標

16、記 標記位點多，可達標記位點多，可達2020個個 對標記物結構及活性影響小對標記物結構及活性影響小 無衰變無衰變 受環境影響小受環境影響小高穩定性，高精確度高穩定性，高精確度試劑保質期至少一年試劑保質期至少一年標準曲線保留時間長標準曲線保留時間長同一批次只需兩點定標同一批次只需兩點定標多標記多標記單，雙，三，四標記單，雙，三，四標記同一試劑盒可同時測多個同一試劑盒可同時測多個項目項目三、應用三、應用w內分泌科檢查內分泌科檢查n甲狀腺系列甲狀腺系列： TSHTSH，Ultra TSHUltra TSH，T3T3，T4T4，n FT3FT3，FT4FT4，TBGTBG，TGTGn糖尿病系列糖尿病系

17、列： InsulinInsulin， C-PeptieC-Peptien生長激素類生長激素類： hGHhGHn其他其他： CortisolCortisolw婦產科檢查婦產科檢查nFSHFSH，LHLH，HCGHCG，ProlactinE2ProlactinE2，E3E3，TestoTesto，ProgProg，SHBGSHBGw腫瘤科檢查腫瘤科檢查AFP CEA PSA hTGAFP CEA PSA hTG，-2 Micro NSE PAP -2 Micro NSE PAP PSAPSA（Free/TotalFree/Total） PSA EQMPSA EQMCA-50 CA-125 CA-1

18、99 CA-50 CA-125 CA-199 CA-153CA-153* * CA-724 CA-724* * CY-211 CY-211* *w遺傳科檢查遺傳科檢查n產前篩查產前篩查： hAFP/ hAFP/ HCG HCG ，PAPPAPAPPAn新生兒篩查新生兒篩查：Neo-TSHNeo-TSH，Neo-T4Neo-T4，Neo-IRTNeo-IRT， n Neo-17a-OH ProgNeo-17a-OH Prog，PKUPKUn核酸探針及基因雜交檢測，多標記定量核酸探針及基因雜交檢測，多標記定量PCRPCR檢測。檢測。w肝炎系列肝炎系列n甲肝，乙肝，丙肝甲肝，乙肝，丙肝w血液科檢測血

19、液科檢測n貧血檢查貧血檢查：FerritinFerritin，Vit B12Vit B12，Folic acidFolic acidn白血病：白血病：免疫細胞分型等免疫細胞分型等w細胞學檢查細胞學檢查n細胞毒試驗等多種檢測項目，細胞質及組織細胞毒試驗等多種檢測項目，細胞質及組織化學分析等多種檢測項目化學分析等多種檢測項目n酶類檢測及細胞受體檢測（包括酶類檢測及細胞受體檢測（包括MHCMHC，HLAHLA等等多種檢測）多種檢測）w科研工具科研工具n單標記檢測，雙標記檢測，三標記檢測，四單標記檢測，雙標記檢測，三標記檢測，四標記檢測標記檢測時間分辨熒光免疫測定技術時間分辨熒光免疫測定技術在病毒性肝

20、炎診斷和療效監測中的應用在病毒性肝炎診斷和療效監測中的應用病毒性肝炎的種類病毒性肝炎的種類Hepatitis A Virus Hepatitis B VirusHepatitis C VirusHepatitis D VirusHepatitis E VirusHepatitis G VirusTTVHepatitis Gvirus (HGV) Science. 1996 Jan 26;271(5248):505-8. An RNA virus, hepatitis G virus (HGV), from the plasma of a patient with chronic hepatit

21、is. entire genome (9392 nucleotides)encoding a polyprotein of 2873 amino acids. qHGV was associated with acute and chronic hepatitis. The virus is transfusion-transmissible. It has a global distribution present within the volunteer blood donor population.19962003各年度HGV相關論文數量統計05010015020012345678年度篇

22、數9699 0001 02039798 HGVand GBV-C were two isolates of the same virus. The HGV/GBV-C genome sequence and organization are closely r e l a t e d t o h e p a t i t i s C v i r u s .qinfection is common and frequently persists in humans, qinfection has not been found to be associated with any known dise

23、ase state. (acute or chronic hepatitis) qgrow in lymphocytes , not in hepatocytes, Recent studies suggest : GBV-C infection in HIV-positive people is associated with prolonged survival. coinfection of human lymphocytes with GBV-C and HIV lead to decreased HIV replication. HGV may provide novel appro

24、aches for treating HIV and AIDS.TT virus (TTV) found in 1997 from a hepatitis patient without virus markers. However, the real impact of TTV on liver diseases remains uncertain to date. Due to the lack of suitable cell systems to support the growth of TTV, the biology of TTV is still obscure.HBsAgHB

25、cAgHBV DNAPolymerase一、一、HBV的主要生物學性狀的主要生物學性狀HBV感染感染 病毒在體內大量復制病毒在體內大量復制 免疫反應免疫反應 病毒核酸進入血液病毒核酸進入血液 釋放病毒蛋白釋放病毒蛋白(Ag) 分子生物學方法分子生物學方法 刺激機體產生抗體刺激機體產生抗體 核酸定性或定量核酸定性或定量 血清學方法血清學方法 病毒抗原或抗體病毒抗原或抗體 臨床診斷和療效觀察臨床診斷和療效觀察二、二、HBV感染診斷的主要實驗室指標感染診斷的主要實驗室指標血清免疫學檢測的臨床意義血清免疫學檢測的臨床意義1 HBV感染診斷的主要指標感染診斷的主要指標2 判斷機體對判斷機體對HBV的免疫

26、狀況主要指標的免疫狀況主要指標3 判斷病程的主要指標判斷病程的主要指標 Acute Hepatitis B DNA4-12周周1-2周周2周周3月月36月月潛伏潛伏期期急性急性早期早期潛伏潛伏后期后期急急性性期期康復期痊愈痊愈標標志志物物相相對對濃濃度度有傳染性有傳染性可能有傳可能有傳染性染性有 免有 免疫 力疫 力血清血清學轉學轉換期換期 HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBc IgMAnti-HBeAnti-HBsChronic HBV Infection潛伏期潛伏期(4-12周周)急性感染急性感染(6個月個月)慢性感染慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBc Ig

27、MHBeAgAnti-HBeDNA3 HBV3 HBV血清學標志物與血清學標志物與HBV DNAHBV DNA的關系的關系血清學標志物：血清學標志物： 反映機體對病毒的免疫狀況，病程，反映機體對病毒的免疫狀況，病程， 判斷病情。判斷病情。 不能完全反映病毒在體內復制狀況。不能完全反映病毒在體內復制狀況。HBVDNAHBVDNA 反映病毒在體內復制水平，觀察藥物療效，反映病毒在體內復制水平，觀察藥物療效， 部分部分“ “ 小三陽小三陽”及低水平病毒復制時出現陰性。及低水平病毒復制時出現陰性。 不能反映機體的免疫狀況和病情不能反映機體的免疫狀況和病情三、三、 時間分辨熒光檢測時間分辨熒光檢測 HB

28、sAgHBsAg與其它方法的比較與其它方法的比較TRFIATRFIA與與Elecsys Systems 2010Elecsys Systems 2010檢測檢測 HBsAgHBsAg定性結果比較定性結果比較TRFIATRFIA陽性陽性陰性陰性合計合計陽性陽性60060陰性陰性04040總數總數6040100Elecsys Systems 2010Elecsys Systems 2010靈敏度靈敏度40（040）100100靈敏性靈敏性60（060）100100兩者符合率兩者符合率 100與與 EIA EIA 檢測檢測 HBsAgHBsAg定性結果比較定性結果比較TRFIATRFIAEIAEIA

29、陽性陽性陰性陰性合計合計陽性陽性59160陰性陰性04040總數總數5941100與與Elecsys Systems 2010Elecsys Systems 2010檢測檢測 HBsAgHBsAg定量結果比較定量結果比較Elecsys Systems 2010 Elecsys Systems 2010 檢測檢測 HBsAgHBsAg（COICOI）與）與TRFIATRFIA檢測檢測HBsAgHBsAg（ng/Lng/L）的相關性）的相關性0.9870.987TRFIATRFIA在乙肝在乙肝“兩對半兩對半”定量檢測應用定量檢測應用 一、一、 極大地提高了檢測的靈敏度極大地提高了檢測的靈敏度 TR

30、FIA 檢測HbsAg靈敏度可達0.2ng/ml，而酶標（ELISA）檢測HbsAg靈敏度是2ng/ml，也就是說只有血清中的HbsAg達到2ng/ml酶標才會呈陽性。1縮短急性乙肝縮短急性乙肝HBsAg 檢測檢測“窗口期窗口期” 2如病毒發生變異后，表達量較低，常規如病毒發生變異后，表達量較低，常規ELISA測不出抗原，而測不出抗原，而TRFIA定量具有極高定量具有極高的靈敏度，可發現并極有可能同時檢測出的靈敏度，可發現并極有可能同時檢測出HbsAg和抗和抗-Hbs。 3 可發現低濃度可發現低濃度HbsAg攜帶者。攜帶者。 特別是一些群體如醫護工作者、病人家屬等，由于特別是一些群體如醫護工作

31、者、病人家屬等，由于長期密切接觸，但又非直接經血傳播感染成急性乙肝，長期密切接觸，但又非直接經血傳播感染成急性乙肝，而是長期少量感染，并刺激機體產生一定的免疫力，而是長期少量感染，并刺激機體產生一定的免疫力，可能呈低濃度感染，特別應當引起人們的足夠重視，可能呈低濃度感染，特別應當引起人們的足夠重視，密切關注并采取措施防止發展成乙肝或慢性攜帶者。密切關注并采取措施防止發展成乙肝或慢性攜帶者。二、二、 動態觀察療效和病情監測。動態觀察療效和病情監測。 疾病的發生、發展、療效、預后是一個動態的疾病的發生、發展、療效、預后是一個動態的變化的過程，變化的過程，TRFIA定量檢測乙肝定量檢測乙肝“兩對半兩

32、對半”各項各項標志物的濃度變化可對乙肝的病程、治療、預后起標志物的濃度變化可對乙肝的病程、治療、預后起一個全程動態檢測的作用，能夠為醫生對病情療效一個全程動態檢測的作用，能夠為醫生對病情療效作出合理的解釋提供依據，指導治療。作出合理的解釋提供依據，指導治療。1定量分析定量分析HbsAg和抗和抗-Hbs的濃度變化，可以預見的濃度變化，可以預見急性乙肝是否處于恢復期。急性乙肝是否處于恢復期。 如如HbsAg濃度降低，抗濃度降低，抗-Hbs的濃度逐漸升高，的濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復期發展。反之，可說明病情正往恢復期發展。反之，HbsAg濃度處濃度處于較高水平或上升趨勢，而抗于較高水平或上升趨

33、勢，而抗-Hbs一直處于較底水一直處于較底水平，則容易發展為慢性乙肝或攜帶者。平，則容易發展為慢性乙肝或攜帶者。2定量分析定量分析HbeAg和抗和抗-Hbe的濃度變化，可以反的濃度變化，可以反映病情變化和治療效果。映病情變化和治療效果。 明確檢測明確檢測HbeAg向抗向抗-Hbe轉換的時期，即表轉換的時期，即表現為現為HbeAg濃度下降和抗濃度下降和抗-Hbe濃度升高的過程。濃度升高的過程。 高濃度的高濃度的HbeAg還可間接提示病毒處于高復還可間接提示病毒處于高復制狀態，具有較高的傳染性。制狀態，具有較高的傳染性。 高濃度的抗高濃度的抗-Hbe一方面提示病情的好轉，而一方面提示病情的好轉，而

34、在某些時候（如肝功能指標很差）可能與肝壞死、在某些時候（如肝功能指標很差）可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關。肝硬化、肝癌有關。3抗抗-Hbc濃度的高低可以反映病毒感染的狀濃度的高低可以反映病毒感染的狀態。態。 乙肝急性感染常常呈現高濃度的抗乙肝急性感染常常呈現高濃度的抗-Hbc，恢復期濃度降低。慢性乙肝呈抗恢復期濃度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持續高濃持續高濃度。度。 低濃度的抗低濃度的抗-Hbc一般為恢復期或既往感染。一般為恢復期或既往感染。 4 有利于對慢性肝炎活動性和非活動性的有利于對慢性肝炎活動性和非活動性的判斷。非活動性慢性乙肝各項指標相對穩判斷。非活動性慢性乙肝各項指標相對穩定，活動性往往呈進行性變化。定，活動性往往呈進行性變化。q三、三、 血清血清HBV-DNA熒光定量熒光定量PCR測定可以直接測定可以直接反映病毒復制狀態，具有很多臨床應用價值，但不反映病毒復制狀態，具有很多臨床應用價值，但不能完全反映病毒復制靜息期肝細胞內能完全反映病毒復制靜息期肝細胞內HBV病毒狀態。病毒狀態。HBV-DNA陰性并不完全代表體內陰性并不完全代表體內HBV已被清除，結已被清除，結合合“兩對半兩對半”各項指