1、2 蛋白質樣品的初級分離蛋白質樣品的初級分離混合物分離混合物分離破破 碎碎選選 材材離離 心心沉沉 淀淀萃萃 取取吸吸 附附膜分離膜分離初初 級級 分分 離離（pretreatment）第一節第一節 蛋白質樣品的選材與破碎蛋白質樣品的選材與破碎1 制備蛋白質的原材料的選擇和處理制備蛋白質的原材料的選擇和處理n微生物微生物：注意生長期注意生長期 分泌到培養基中代謝產物、胞外酶分泌到培養基中代謝產物、胞外酶 菌體含有的生化物質如胞內酶、核酸菌體含有的生化物質如胞內酶、核酸n植物植物： 去殼、脫脂、品種、季節、生長發育去殼、脫脂、品種、季節、生長發育n動物動物： 含量豐富的臟器組織為原材料含量豐富的

2、臟器組織為原材料 1.1 天然蛋白質的制備材料天然蛋白質的制備材料n對于處理的材料，若不立即進行試驗，對于處理的材料，若不立即進行試驗，應冷凍保存。應冷凍保存。n對易分解的蛋白質應選用新鮮材料制對易分解的蛋白質應選用新鮮材料制備。備。1.2 重組蛋白質的制備材料重組蛋白質的制備材料 重組蛋白可在重組蛋白可在E.coli、酵母、昆蟲和、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等體系中得到高效表達，其哺乳動物細胞等體系中得到高效表達，其表達形式一般可分為：表達形式一般可分為： （1）細胞外的分泌表達；）細胞外的分泌表達； （2）細胞內可溶性表達；）細胞內可溶性表達； （3）細胞內不溶性表達（包涵體）細胞內不溶性表

3、達（包涵體）1.3 制備蛋白質的原材料的預處理制備蛋白質的原材料的預處理 為了純化蛋白質，采用有效的方法進行為了純化蛋白質，采用有效的方法進行組織細胞或培養細胞的破碎是提取胞內蛋組織細胞或培養細胞的破碎是提取胞內蛋白質的關鍵步驟。白質的關鍵步驟。1.3.1 細胞的破碎方法細胞的破碎方法依是否外加作用力可分為：依是否外加作用力可分為：n機械破碎法機械破碎法n非機械破碎法非機械破碎法高壓勻漿、高速珠磨、超聲波破碎等高壓勻漿、高速珠磨、超聲波破碎等化學法、生物法以及滲透壓沖擊法、化學法、生物法以及滲透壓沖擊法、凍融法和干燥法等凍融法和干燥法等依所用方法的屬性可分為：依所用方法的屬性可分為：n物理法：

4、物理法：n化學法化學法n生物法生物法勻漿法、珠磨法、超聲法等勻漿法、珠磨法、超聲法等滲透沖擊和增溶法滲透沖擊和增溶法主要是酶溶法主要是酶溶法1.3.1.11.3.1.1機械破碎法機械破碎法高速攪拌珠磨法（高速攪拌珠磨法（fine grinding） 高壓勻漿法（高壓勻漿法（homogenization）超聲波破碎法（超聲波破碎法（ultrasonication）振蕩珠擊破碎法振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead)1.3.1.11.3.1.1機械破碎法機械破碎法1高速攪拌珠磨法（高速攪拌珠磨法（fine grinding）：）：是將細胞懸浮是將細胞懸浮液與研磨劑（如：玻璃小珠、石英砂或氧化

5、鋁等）一起液與研磨劑（如：玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等）一起快速攪拌或研磨，利用玻璃珠間以及玻璃珠與細胞間的快速攪拌或研磨，利用玻璃珠間以及玻璃珠與細胞間的互相剪切、碰撞促進細胞壁破裂而釋放出細胞內含物。互相剪切、碰撞促進細胞壁破裂而釋放出細胞內含物。 影響珠磨破碎的因素影響珠磨破碎的因素：轉盤外緣速率：在一定范圍內細胞破碎：轉盤外緣速率：在一定范圍內細胞破碎的比速率與轉盤外緣速率成正比；細胞濃度：該影響目前還沒的比速率與轉盤外緣速率成正比；細胞濃度：該影響目前還沒有定論；磨珠大小及用量：一定范圍內，細胞破碎速率與磨珠有定論；磨珠大小及用量：一定范圍內，細胞破碎速率與磨珠大小成反比，與磨珠用量成

6、正比。溫度：大小成反比，與磨珠用量成正比。溫度：540內對破碎物內對破碎物影響較小，但對于熱不穩定性產物，應采用冷卻裝置控溫。流影響較小，但對于熱不穩定性產物，應采用冷卻裝置控溫。流量：提高流量，則降低細胞的破碎程度和釋放蛋白的產量。量：提高流量，則降低細胞的破碎程度和釋放蛋白的產量。 珠磨法珠磨法優點優點：可實現連續操作；：可實現連續操作；缺點缺點：破碎中產生大量：破碎中產生大量的熱量會使樣品迅速升溫，需采取冷卻裝置。適用于真的熱量會使樣品迅速升溫，需采取冷卻裝置。適用于真菌和藻類細胞。菌和藻類細胞。 是最有效的一種細胞物理破碎法。在工業規模的是最有效的一種細胞物理破碎法。在工業規模的破碎中

7、，常采用高速珠磨機。破碎中，常采用高速珠磨機。1.3.1.11.3.1.1機械破碎法機械破碎法2高壓勻漿法（高壓勻漿法（homogenization）：）：是利用是利用高壓迫使細胞懸浮液通過針型閥后，因高速撞擊高壓迫使細胞懸浮液通過針型閥后，因高速撞擊和突然減壓而使細胞破碎的方法。和突然減壓而使細胞破碎的方法。操作方式操作方式: 可采用單次通過勻漿器或多次循環通過等方式，也可可采用單次通過勻漿器或多次循環通過等方式，也可連續操作。在工業規模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃連續操作。在工業規模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環的操作方法。度高或處于

8、生長靜止期的細胞，常采用多次循環的操作方法。影響因素：影響因素：循環次數循環次數(N)： Rm / ( Rm-R) =Np溫度：破碎率隨溫度升高而增加溫度：破碎率隨溫度升高而增加操作壓力：細胞破碎速率與操作壓力大小成正比操作壓力：細胞破碎速率與操作壓力大小成正比針型閥與閥座的形狀及二者的距離針型閥與閥座的形狀及二者的距離優點：優點：可多次循環，操作方便、成本較低。因此，該法可多次循環，操作方便、成本較低。因此，該法已大規模應用于多種微生物細胞，尤其是酵母和細菌。已大規模應用于多種微生物細胞，尤其是酵母和細菌。式中：式中：R為蛋白質釋放量，為蛋白質釋放量，Rm為蛋白質最大釋放量，為蛋白質最大釋放

9、量，p為操作壓力，為操作壓力，是與溫度有關的速度常數，是與溫度有關的速度常數，為指數值：為指數值：是有機體抵抗破碎能力的一種量度，與生物體的類型及是有機體抵抗破碎能力的一種量度，與生物體的類型及生理狀況有關：不同生物其生理狀況有關：不同生物其值不同（研究表明釀酒酵值不同（研究表明釀酒酵母母=2.9，大腸桿菌，大腸桿菌=2.21）；而同一微生物，有時所）；而同一微生物，有時所用培養基不同用培養基不同值也會不同（如大腸桿菌生長在復雜培值也會不同（如大腸桿菌生長在復雜培養基上比生長在簡單培養基上的養基上比生長在簡單培養基上的值大）值大）如：操作溫度由如：操作溫度由530時，細胞破碎率提高了約時，細胞

10、破碎率提高了約1.5倍，但是，高溫破碎只適用于非熱變性產物，對于熱變倍，但是，高溫破碎只適用于非熱變性產物，對于熱變性物質，可在進口處用干冰調節溫度，使出口溫度調節性物質，可在進口處用干冰調節溫度，使出口溫度調節在在20左右左右操作壓力不能過高：這是由于破碎過程中能耗與操作壓操作壓力不能過高：這是由于破碎過程中能耗與操作壓力成線性關系，提高壓力就要增加能耗，且壓力過大會力成線性關系，提高壓力就要增加能耗，且壓力過大會引起閥座的劇烈破損引起閥座的劇烈破損1.3.1.11.3.1.1機械破碎法機械破碎法3超聲波破碎法（超聲波破碎法（ultrasonication）：）：是利用超聲波是利用超聲波振蕩

11、器發射的振蕩器發射的1525 kHz的超聲波探頭來處理細胞懸浮的超聲波探頭來處理細胞懸浮液而使細胞破碎的方法。液而使細胞破碎的方法。破碎原理：破碎原理：在超聲波作用下，液體發生空化作用，空穴在超聲波作用下，液體發生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產生極大的沖擊波和剪切力，使細的形成、增大和閉合產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。胞破碎。影響參數：影響參數：振幅：振幅直接與聲能有關，影響蛋白質釋放的比振幅：振幅直接與聲能有關，影響蛋白質釋放的比速率（正相關）；細胞懸浮液的黏度：黏度影響能耗并會抑制速率（正相關）；細胞懸浮液的黏度：黏度影響能耗并會抑制空穴現象；珠粒的大小：細小珠粒利于空穴的形成

12、，并產生輔空穴現象；珠粒的大小：細小珠粒利于空穴的形成，并產生輔助助“研磨研磨”效應，從而提高破碎速率。其它：如：探頭的形狀效應，從而提高破碎速率。其它：如：探頭的形狀和材料，細胞懸浮液的流速、體積等。和材料，細胞懸浮液的流速、體積等。特點：特點：該法是一種強烈的破碎細胞的方法，操作簡便，液體量損該法是一種強烈的破碎細胞的方法，操作簡便，液體量損失少，適用于多種微生物細胞。但是超聲處理易使敏感型活性物失少，適用于多種微生物細胞。但是超聲處理易使敏感型活性物質失活，操作過程產熱大，對冷卻裝置要求苛刻，故不易放大，質失活，操作過程產熱大，對冷卻裝置要求苛刻，故不易放大，目前仍主要應用于實驗室研究。

13、目前仍主要應用于實驗室研究。 1.3.1.11.3.1.1機械破碎法機械破碎法4振蕩珠擊破碎法振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead)：將等體積的小量將等體積的小量組織樣品與高密度的組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的放入可密封的2ml螺螺旋蓋微量管中旋蓋微量管中,再加入緩沖液與穩定成份到再加入緩沖液與穩定成份到1.5ml的體積的體積, 用用6500RPM振蕩機高速上下振動振蕩機高速上下振動8秒秒,休息休息8秒秒,再振動再振動8秒即可秒即可.是目前最快且一次可處理最多樣品的方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法. 一臺機器最一臺機器最多可以一天處理多可以一天處理2400支樣

14、品支樣品.對小量且多樣的人很方便對小量且多樣的人很方便.機械法破碎細胞的缺陷機械法破碎細胞的缺陷 需要高能量，并且產生高溫和高剪切力，因此易使需要高能量，并且產生高溫和高剪切力，因此易使不穩定產品變性失活；不穩定產品變性失活；破碎目標不具專一性（被破碎的有機體或釋放產物破碎目標不具專一性（被破碎的有機體或釋放產物是非專一的）、易形成碎片顆粒，這為后續分離純化是非專一的）、易形成碎片顆粒，這為后續分離純化工作帶來難度。工作帶來難度。 1.3.2.21.3.2.2非機械破碎法非機械破碎法化學破碎法化學破碎法生物破碎法（酶溶法）生物破碎法（酶溶法）物理法物理法1.3.1.21.3.1.2非機械破碎法

15、非機械破碎法1）化學破碎法化學破碎法：采用化學法處理可以溶解細胞或抽：采用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內組分。這種用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提提胞內組分。這種用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞內某些組分的方法就稱為化學破碎法細胞內某些組分的方法就稱為化學破碎法 。作用機理作用機理：表面活性劑、變性劑等化學試劑可以改變：表面活性劑、變性劑等化學試劑可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內含物有選擇地滲透出來。細胞壁或膜的通透性從而使內含物有選擇地滲透出來。 常用化學試劑：酸、堿、表面活性劑、變性劑、金屬常用化學試劑：酸、堿、表面活性劑、變性劑、金屬螯合劑、和某些有機溶劑（如苯、甲苯）等。螯合劑、和

16、某些有機溶劑（如苯、甲苯）等。常用化學破碎法：常用化學破碎法：滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法、增溶法增溶法和和脂溶法脂溶法等。等。 滲透壓沖擊法：將細胞首先置于滲透壓沖擊法：將細胞首先置于高滲介質高滲介質，由于滲透壓的作用，由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發生收縮，待達到平衡后，將介質細胞內水分便向外滲出，細胞發生收縮，待達到平衡后，將介質快速稀釋，或將細胞快速轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然快速稀釋，或將細胞快速轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，且

17、操作簡單，但僅適用滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，且操作簡單，但僅適用于細胞壁較脆弱的、經酶需處理的、或細胞壁合成受抑制而強于細胞壁較脆弱的、經酶需處理的、或細胞壁合成受抑制而強度減弱的菌體細胞。度減弱的菌體細胞。是用表面活性劑處理細胞，利用其增溶作用，增加細胞壁和膜是用表面活性劑處理細胞，利用其增溶作用，增加細胞壁和膜的通透性使細胞破碎的方法。此技術可與研磨法聯合使用。常的通透性使細胞破碎的方法。此技術可與研磨法聯合使用。常用的表面活性劑：用的表面活性劑：SDS(十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉)、Triton X-100等。等。 許多有機溶劑能與細胞壁和膜的脂質作用，從而導致細胞壁膨許多有機

18、溶劑能與細胞壁和膜的脂質作用，從而導致細胞壁膨脹、破裂，釋放出內含物。常用的脂溶劑：氯仿、甲苯、丙酮脹、破裂，釋放出內含物。常用的脂溶劑：氯仿、甲苯、丙酮等。此技術也可以與研磨法聯合使用。等。此技術也可以與研磨法聯合使用。 化學破碎法的特點化學破碎法的特點存在的問題存在的問題：時間長，效率低；化學試劑毒性較：時間長，效率低；化學試劑毒性較強，同時對產物也有毒害作用，進一步分離時需強，同時對產物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。 優點優點：

19、多用于破碎細菌，且作用比較溫和；提取：多用于破碎細菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細胞。核酸時，常用此法破碎細胞。1.3.2.21.3.2.2非機械破碎法非機械破碎法2）生物破碎法（酶溶法）生物破碎法（酶溶法）：是利用生物酶消化溶解：是利用生物酶消化溶解細胞壁和膜，從而導致細胞壁膨脹、破裂，釋放出內細胞壁和膜，從而導致細胞壁膨脹、破裂，釋放出內含物的方法。含物的方法。常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶、：溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1,6-葡聚糖葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鏈內切酶、纖維酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鏈內切酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等。素酶、蝸牛酶

20、和酯酶等。自溶自溶：將新鮮的生物材料存放于一定的：將新鮮的生物材料存放于一定的pH 和適當的和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶的作用溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來，此法稱為自溶下發生溶解，使細胞內含物釋放出來，此法稱為自溶法。法。自溶是一種特殊的酶溶方式自溶是一種特殊的酶溶方式。優點：優點：作用條件溫和；細胞壁損壞的程度可以控作用條件溫和；細胞壁損壞的程度可以控制；內含物成分不易受到破壞；產物可選擇性釋制；內含物成分不易受到破壞；產物可選擇性釋放；適用多種微生物。放；適用多種微生物。缺點：溶酶價格高，回收利用困難，大規模使用成本太高

21、；缺點：溶酶價格高，回收利用困難，大規模使用成本太高；通用性差，不同的菌種需選擇不同的酶，且最佳條件不易確通用性差，不同的菌種需選擇不同的酶，且最佳條件不易確定；存在產物抑制作用：這可能是導致胞內物質釋放率低的定；存在產物抑制作用：這可能是導致胞內物質釋放率低的一個重要因素。一個重要因素。 酶解破碎適用于多種微生物酶解破碎適用于多種微生物 ，但目前仍局限于實驗室規模應，但目前仍局限于實驗室規模應用。用。另外，另外，溶酶有高度的專一性溶酶有高度的專一性，如溶菌酶主要作用于細菌細，如溶菌酶主要作用于細菌細胞，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶。如：將酵母細胞懸于胞，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶。如：

22、將酵母細胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.4)中，加中，加1蝸蝸牛酶，在牛酶，在30處理處理30分鐘，即可使大部分細胞壁破裂。分鐘，即可使大部分細胞壁破裂。 例如：酵母在例如：酵母在4550下保溫下保溫20h左右，即可發生自溶。左右，即可發生自溶。但該法使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使但該法使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞，同時也有可能會把某些要提取的有效細胞壁和膜破壞，同時也有可能會把某些要提取的有效成分分解。另外，自溶的時間較長，不易控制，故在制成分分解。另外，自溶的時間較長，不易控制，故在制備生物活性時

23、很少用之。備生物活性時很少用之。1.3.1.21.3.1.2非機械破碎法非機械破碎法3）物理法物理法：主要通過各種物理因素使組織細胞破碎：主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。的方法。常用的物理法：常用的物理法：反復凍融法反復凍融法、急熱驟冷法急熱驟冷法和和干燥法干燥法等。等。 是將細胞放在低溫（是將細胞放在低溫（-15），然后在室溫中融化，反復），然后在室溫中融化，反復多次，細胞壁破裂。多次，細胞壁破裂。原理原理：因突然冷凍，細胞內冰晶的：因突然冷凍，細胞內冰晶的形成及剩余細胞液的鹽濃度的突然增高，造成胞內外溶形成及剩余細胞液的鹽濃度的突然增高，造成胞內外溶劑濃度的突然改變而引起溶脹，使

24、細胞結構破碎而破壞劑濃度的突然改變而引起溶脹，使細胞結構破碎而破壞細胞。細胞。 特點：此法適用于組織細胞，多用于動物性材料，對微生物細特點：此法適用于組織細胞，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差。因此，反復凍融在實際操作中最好與超聲波破碎胞作用較差。因此，反復凍融在實際操作中最好與超聲波破碎或酶解一起使用，否則凍融后黏度很大，蛋白質容易聚集，通或酶解一起使用，否則凍融后黏度很大，蛋白質容易聚集，通常都是反復凍融后超聲波處理。常都是反復凍融后超聲波處理。 先將材料在先將材料在90左右的水浴中維持數分鐘，立即放入冰浴中使左右的水浴中維持數分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞

25、可以被破碎。細菌或病之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此技術。毒中提取蛋白質和核酸時可用此技術。 經干燥后的菌體，其細胞膜的滲透性發生變化，同時部分菌體經干燥后的菌體，其細胞膜的滲透性發生變化，同時部分菌體會產生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內會產生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內物質就會被抽提出來。物質就會被抽提出來。 小結小結 眾多細胞破碎方法中，眾多細胞破碎方法中，高壓均漿高壓均漿和和珠磨珠磨兩種機械破碎方法，處兩種機械破碎方法，處理量大，速度非常快，理量大，速度非常快，目前在工業生長上應用最廣泛目前在工業生長

26、上應用最廣泛。但在機。但在機械法破碎過程中，容易產生大量的熱量，使料液溫度升高，而械法破碎過程中，容易產生大量的熱量，使料液溫度升高，而易造成生化物質的破壞，特別是在超聲波處理時。因此，易造成生化物質的破壞，特別是在超聲波處理時。因此，超聲超聲波振蕩法波振蕩法主要適用于實驗室或小規模的細胞破碎主要適用于實驗室或小規模的細胞破碎。 非機械法非機械法一一般僅適用于小規模應用般僅適用于小規模應用。滲透壓沖擊。滲透壓沖擊和和凍結融解法凍結融解法都屬于較都屬于較溫和的方法，但溫和的方法，但破碎作用較弱，它們常與酶解法結合起來使用，破碎作用較弱，它們常與酶解法結合起來使用，提高破碎效果。提高破碎效果。干燥

27、法干燥法屬于較激烈的一種破碎方法，屬于較激烈的一種破碎方法，容易引起容易引起蛋白質或其它組分變性蛋白質或其它組分變性。 各種組織適用的細胞破碎方法各種組織適用的細胞破碎方法 細胞破碎方法細胞破碎方法組織種類組織種類旋刀式勻漿旋刀式勻漿大多數動植物組織大多數動植物組織手動式勻漿手動式勻漿柔軟的動物組織柔軟的動物組織超聲超聲細胞混懸液細胞混懸液高速勻漿高速勻漿細菌、酵母植物細胞細菌、酵母植物細胞研磨研磨細菌、植物細胞細菌、植物細胞高速珠磨高速珠磨細胞混懸液細胞混懸液酶溶酶溶細菌、酵母細菌、酵母去垢劑滲透去垢劑滲透 組織培養細胞組織培養細胞有機溶劑滲透有機溶劑滲透細菌、酵母細菌、酵母低滲裂解低滲裂解

28、紅細胞、細菌紅細胞、細菌凍融裂解凍融裂解培養細胞培養細胞細胞細胞 聲波聲波 機械機械 滲透壓滲透壓 凍融凍融動植物動植物 + + + + + + +革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 + + + + + + +革蘭氏陽性芽孢菌革蘭氏陽性芽孢菌 + + + + + + +酵母酵母 + + + + + + +革蘭氏陽性球菌革蘭氏陽性球菌 + - + + - + +菌絲菌絲 - + - +- + - +孢子孢子 - - - -1.3.1.3選擇破碎方法的依據選擇破碎方法的依據n細胞的處理量細胞的處理量 n細胞的密度和細胞壁的強度細胞的密度和細胞壁的強度n目標產物對破碎條件的敏感性以及目標產物對破碎條件的敏感性

29、以及產物在產物在細胞中的位置細胞中的位置n破碎程度破碎程度 n產物的穩定性產物的穩定性 n提取分離的難易提取分離的難易 其一般原則為：目標產物若在細胞其一般原則為：目標產物若在細胞質內，需用機械破碎法；若細胞膜質內，需用機械破碎法；若細胞膜附近，則可選用較溫和的非機械法；附近，則可選用較溫和的非機械法；若與細胞膜或壁相結合，則可采用若與細胞膜或壁相結合，則可采用機械法和化學法相結合的方法。機械法和化學法相結合的方法。 1.1.直接測定破碎前后的細胞數：直接測定破碎前后的細胞數： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數器直接計數；破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數器直接計數； 破碎后，用染色法區分破碎細胞與

30、完整細胞。破碎后，用染色法區分破碎細胞與完整細胞。 2.2.測定導電率：測定導電率： 利用破碎前后導電率的變化測定破碎程度。利用破碎前后導電率的變化測定破碎程度。 3.3.測定釋放的蛋白質量或酶活力：測定釋放的蛋白質量或酶活力： 測定破碎液中胞內蛋白質或目的酶的釋放量，估算破碎率。測定破碎液中胞內蛋白質或目的酶的釋放量，估算破碎率。 1.3.1.4 細胞破碎確認細胞破碎確認 細胞破碎率的評價細胞破碎率的評價破碎率：破碎率：被破碎細胞的數量占原始細胞數量的被破碎細胞的數量占原始細胞數量的百分比數，即：百分比數，即： Y(%)=(N0-N) / N0100 。注：注： N0 原始細胞數量；原始細胞

31、數量；N經經t時間操作后保留下時間操作后保留下來的未損害完整細胞數量。來的未損害完整細胞數量。 細胞破碎率的計算方法細胞破碎率的計算方法 N0和和N主要通過主要通過直接計數法直接計數法和和間接計數法間接計數法兩兩種方法獲得。種方法獲得。 通過平板計數技術或在血球計數板上用顯微鏡觀察法通過平板計數技術或在血球計數板上用顯微鏡觀察法直接對適當稀釋后的樣品進行計數直接對適當稀釋后的樣品進行計數 是在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合是在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通常做法：通常做法：將破將破碎后的細胞懸浮液離心分離

32、掉固體（完整細胞和碎碎后的細胞懸浮液離心分離掉固體（完整細胞和碎片），然后用片），然后用Lowry法測量上清中的蛋白質含量。其法測量上清中的蛋白質含量。其破碎率可通過被釋放出來化合物的量破碎率可通過被釋放出來化合物的量R與所有細胞的與所有細胞的理論最大釋放量理論最大釋放量Rm之比進行計算。之比進行計算。 作作 用用 方方 法法機械機械液體剪切液體剪切 超聲波超聲波 機械攪拌壓力機械攪拌壓力固體剪切固體剪切 研磨研磨桿和臼桿和臼 球磨機球磨機壓力壓力Hughes壓榨機壓榨機 X 壓榨機壓榨機非機械非機械 脫水脫水空氣干燥空氣干燥 真空干燥真空干燥 冷凍干燥冷凍干燥 溶劑干燥溶劑干燥溶胞作用溶胞作

33、用 物理作用物理作用滲透沖擊滲透沖擊 壓力釋放壓力釋放 凍結和融化凍結和融化化學作用化學作用陽陰離子洗滌劑陽陰離子洗滌劑 抗生素抗生素 甘氨酸甘氨酸酶作用酶作用溶菌酶和有關的酶噬溶菌酶和有關的酶噬 菌體溶胞菌體溶胞 抗菌素抗菌素第二節 目標蛋白質的離心分離目標蛋白質的離心分離 離心分離技術是借助于離心機旋轉所產生的離心力，根據物質顆粒的沉降系數、質量、密度及浮力等因子的不同，而使物質分離的技術。2.1 2.1 離心技術的原理離心技術的原理 將處于懸浮狀態的細胞、細胞器、病毒和將處于懸浮狀態的細胞、細胞器、病毒和生物大分子等稱為生物大分子等稱為“顆粒顆粒”。每個顆粒都。每個顆粒都有一定有一定大小

34、、形狀、密度和質量大小、形狀、密度和質量。當離心。當離心機轉子高速旋轉時這些顆粒在介質中發生機轉子高速旋轉時這些顆粒在介質中發生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和力的方向有關。上的力的大小和力的方向有關。 離心力：離心力： Fc = m ac m r r 2 2 m r r （2 N/60）2 2 N為離心機為離心機每分鐘轉數每分鐘轉數 （r/min ）；）； Fc通常以相對離心力通常以相對離心力RCF（relative centrifugal force）表示，即離心力表示，即離心力F的大小相當于地球引力（重力常數的大小相當于地球引力（重力

35、常數g）的多）的多少倍。少倍。一般用一般用g g（或數字（或數字 g g）表示。）表示。2.1.1 2.1.1 相對離心力相對離心力RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相對離心力與轉速之間的關系此公式描述了相對離心力與轉速之間的關系 旋轉半徑用旋轉半徑用r r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm 通通 常：常：低速離心以低速離心以每分鐘的轉數每分鐘的轉數表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。高速離心（超速），常以高速離心（超速

36、），常以相對離心力相對離心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g。 兩者可換算或查測算圖。兩者可換算或查測算圖。計算近似計算近似RCF的列線圖的列線圖2.1.2 沉降系數沉降系數:（sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentation velocity）, ,用用S表示表示。 由于許多生物大分子的由于許多生物大分子的S S值很小，所以定值很小，所以定義義10 10 13 s 為一個沉降單位，為一個沉降單位，1S = 1 10 13 s。 常用常用S表示某些生物大分子、亞細胞及亞表示某些生

37、物大分子、亞細胞及亞細胞器的大小，如細胞器的大小，如16sRNA，蛋白質的沉降系，蛋白質的沉降系數一般在數一般在1 200之間。之間。 2.1.3 離心條件的確定離心條件的確定 離心力離心力 離心時間（與顆粒的沉降時間有關）離心時間（與顆粒的沉降時間有關） 溫度和溫度和pH值（防止欲分離物質的凝集、值（防止欲分離物質的凝集、變性和失活）變性和失活） n：轉子每分鐘轉數，r/min 36004222rnmrmF2.2 2.2 離心機的種類離心機的種類 按離心機轉速的不同，分為：按離心機轉速的不同，分為： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 名稱名稱 轉速轉速(r/min)(r/min)

38、 注意事項注意事項 低速離心機低速離心機 60006000 常溫，注意樣品熱變性和常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡離心管平衡 高速離心機高速離心機 60006000 2500025000冷凍（防止溫度升高），冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 超速離心機超速離心機 2500025000冷凍真空系統（減少空冷凍真空系統（減少空氣阻力和摩擦），氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 離心機的種類離心機的種類 l溫度類型：溫度類型：常溫及常溫及冷凍冷凍l超速離心機均為冷超速離心機均為冷凍型。凍型。l使用冷凍離心機時使用冷凍離心機時提前降溫，預冷離提前降溫，預冷離心頭。心

39、頭。l使用超速離心機時使用超速離心機時先抽真空。先抽真空。l角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式及外擺式：外擺式一般為低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩、蓋、旋緊。作注意穩、蓋、旋緊。l材質：玻璃，材質：玻璃，塑料塑料l強度：和離強度：和離心速度相配心速度相配l大小：和轉大小：和轉子配套子配套l高速超速管高速超速管要加蓋要加蓋l平衡、定溫、定速、定時。平衡、定溫、定速、定時。2.3 2.3 離心分離技術的種類離心分離技術的種類 差速離心法是指通過不斷差速離心法是指通過不斷增加相對離心力增加

40、相對離心力，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時間下分批離心方法。及不同離心時間下分批離心方法。差速離差速離心法一般用于分離沉降系數相差較大的顆心法一般用于分離沉降系數相差較大的顆粒粒。主要用于分離細胞器和病毒。主要用于分離細胞器和病毒。 差速離心法差速離心法(differential centrifugation) 密度梯度離心法密度梯度離心法 亦稱亦稱平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心法。密度梯度離。密度梯度離心法包括心法包括速度區帶速度區帶和和等密度離心等密度離心二種方二種方法。后者又可分為預制梯度等密度及自法。后者又可分為預制梯度等密度及

41、自形成梯度等密度兩種方法。形成梯度等密度兩種方法。 速度區帶離心法速度區帶離心法 在在離心前離心管內預先裝入密度梯度介質離心前離心管內預先裝入密度梯度介質(如蔗糖、甘油、如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等等)，待分離，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。由于離心力的作用，同梯度液一起離心。由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管按不同沉降速度向管底沉降底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連形成一系列界面清楚的不連續區帶續區帶。沉降

42、系數越大，往下沉降越快，。沉降系數越大，往下沉降越快，所呈的區帶也越低。沉降系數較小的顆粒，所呈的區帶也越低。沉降系數較小的顆粒，則在較上部分依次出現。則在較上部分依次出現。 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心等密度離心法等密度離心法 某些密度梯度介質經過離心后會自身形成某些密度梯度介質經過離心后會自身形成梯度，如細胞分離液梯度，如細胞分離液Percoll。待分離樣品。待分離樣品可和梯度介質先均勻混合，梯度介質由于可和梯度介質先均勻混合，梯度介質由于離心力的作用離心力的作用逐漸形成管逐漸形成管底部濃底部濃而而管頂稀管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的顆的密度梯度，與此同時原來分布均勻的顆粒也

43、發生重新分布。當管底介質的密度大粒也發生重新分布。當管底介質的密度大于顆粒的密度時，顆粒上浮；當管頂介質于顆粒的密度時，顆粒上浮；當管頂介質的密度小于顆粒的密度時，則顆粒沉降；的密度小于顆粒的密度時，則顆粒沉降；最后顆粒進入到一個它本身的密度位置，最后顆粒進入到一個它本身的密度位置，顆粒不再移動，形成穩定的區帶。顆粒不再移動，形成穩定的區帶。 2.4 超速離心超速離心 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)既可以既可以用來分離純化蛋白質，也可以用作測定用來分離純化蛋白質，也可以用作測定蛋白質的分子量。蛋白質的分子量。 超速：超速：50000-120000rpm大容量冷凍

44、離心機2.5 應用應用 根據不同離心目的，分為根據不同離心目的，分為制備性離心：制備性離心： 分離純化和制備分離純化和制備分析性離心：分析性離心： 測分子量、沉降系數、密度、純度測分子量、沉降系數、密度、純度第三節第三節 蛋白質的沉淀分級蛋白質的沉淀分級 概念概念 溶液中溶質由液相變成固相析出的過程。溶液中溶質由液相變成固相析出的過程。 本質本質 通過改變條件使膠粒發生聚結，降低其在通過改變條件使膠粒發生聚結，降低其在 液液相中的溶解度，增加了固相中的分配率。相中的溶解度，增加了固相中的分配率。 作用作用 分離、澄清、濃縮、保存分離、澄清、濃縮、保存3.1 沉淀技術沉淀技術3.2 沉淀的分類沉

45、淀的分類大大小小0.1 1 m0.02 m大大小小G.G. Chen et al. Powder Technology 139 (2004),180-185.溶劑性質對沉淀的影響溶劑性質對沉淀的影響3.3 沉淀的形成過程沉淀的形成過程文獻選讀文獻選讀文獻選讀無定形沉淀形成示意無定形沉淀形成示意晶形沉淀過程示意SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-

46、SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO

47、42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+S

48、O42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-

49、SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+成核作用成核作用Ba2+Ba2+SO42-SO42-Ba2+Ba2+SO42-SO42-AgAgCr2O7CrO4AgAgKQSS初始速度Q 瞬時濃度瞬時濃度S 晶核的溶解度晶核的溶解度，相相對對過過飽飽和和度度SSQ lgNQ異相成核異相成核異相成核異

50、相成核均相成核均相成核臨界點臨界點3.4 3.4 沉淀微粒大小的影響因素沉淀微粒大小的影響因素3.5 沉淀的純度沉淀的純度表面吸附表面吸附例例Ba2+SO42-沉淀沉淀用用SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ba2+Ca2+Ca2+NO3-Cl-Cl-Cl-K+Na+SO42-SO42-吸附層吸附層溶解度溶解度(mol/L)：25CNa2SO4 1.4K2SO4 0.64CaSO4 3.610-4BaSO4 10-5Ca(NO3)2 3.2CaCl2 9.4Ca2+NO3-Cl-K+Na+表面吸附影響因

51、素表面吸附影響因素例：以氨水沉淀例：以氨水沉淀Fe(OH)3時，時，Ca2+ 、Mg2+ 、 Zn2+ 、 Ni2+ 4種種雜質離子的吸附量的變化示意如圖雜質離子的吸附量的變化示意如圖吸附百分數吸附百分數c(NH4Cl)0固定固定c(NH3)CaMgZnNi吸附百分數吸附百分數c(NH3)0固定固定c(NH4Cl)CaMgZnNi包藏包藏 occlusion雜質離子100 mol BaSO4中沾污鹽的量n/mol1000g 水中沾污鹽的溶解量n/molBa2+加到SO42-中SO42- 加到Ba2+中I-Br -Cl -ClO3 - NO3 -Na+ Ca2+0.0050.350.452.75

52、.49.915.90.0321.652.79.819.64.13.65.643.551.831.370.463.00.02（30C)混晶或固溶體混晶或固溶體后沉淀后沉淀例，在例，在0.01 mol/L Zn2+的的0.15 mol/L HCl，通，通H2S, ZnS形形成過飽和溶液，若加入成過飽和溶液，若加入Cu2+ZnCuSSS共沉淀與后沉淀對分析結果的影響的處理共沉淀與后沉淀對分析結果的影響的處理 3.6 3.6 沉淀條件的選擇沉淀條件的選擇晶形沉淀晶形沉淀稀稀熱熱慢慢攪攪陳陳相對過飽和度小，減少均相成核；相對過飽和度小，減少均相成核；減少雜質吸附量減少雜質吸附量增大溶解度，減少相對過飽和

53、度，減少均相成核；增大溶解度，減少相對過飽和度，減少均相成核；增大擴散速度，有利于沉淀長大；增大擴散速度，有利于沉淀長大；減少吸附減少吸附減少均相成核；減少均相成核； 有利于沉淀長大有利于沉淀長大減少包藏；減少包藏；晶形完整化晶形完整化控制相對過飽和度小，沉淀陳化控制相對過飽和度小，沉淀陳化無定形沉淀無定形沉淀減少水合，使其聚集緊密，便于減少水合，使其聚集緊密，便于過濾；減少雜質吸附過濾；減少雜質吸附減少水合，減少吸附，防止膠溶減少水合，減少吸附，防止膠溶減少水合。減少水合。沉淀完后，稀釋攪拌，減少雜沉淀完后，稀釋攪拌，減少雜質吸附質吸附減少水合減少水合利于凝聚、沉降利于凝聚、沉降3.7 沉淀

54、方法分類沉淀方法分類 鹽析鹽析 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀 等電點沉淀等電點沉淀 非離子聚合物沉淀非離子聚合物沉淀 其他沉淀技術其他沉淀技術生成鹽復合物生成鹽復合物選擇性變性選擇性變性親和沉淀親和沉淀3.7.1 鹽析鹽析3.7.1.1 原理原理 “鹽溶鹽溶” 低濃度中性鹽離子對蛋白質分子表面極性基團及水低濃度中性鹽離子對蛋白質分子表面極性基團及水活度的影響，增加蛋白質與溶劑相互作用力，使其活度的影響，增加蛋白質與溶劑相互作用力，使其溶解度增大。溶解度增大。 “鹽析鹽析” 中性鹽濃度增加至一定值時，水分子定向排列，活中性鹽濃度增加至一定值時，水分子定向排列，活度大大減少，蛋白質表面電荷被中和，水膜

55、被破壞，度大大減少，蛋白質表面電荷被中和，水膜被破壞，從而聚集沉淀。從而聚集沉淀。影響鹽析的因素影響鹽析的因素 鹽離子種類和濃度鹽離子種類和濃度 生物分子種類和濃度生物分子種類和濃度 pH值值 溫度溫度3.7.1.2 公式和討論公式和討論 純蛋白質有鹽析經驗公式：純蛋白質有鹽析經驗公式：log S = kSIS 蛋白質溶解度（蛋白質溶解度（g/L）；）； I=0時時log S，它取決于鹽和，它取決于鹽和Pr的性質，溫度，的性質，溫度，pH；kS 鹽析常數，決定于加入鹽性質及鹽析常數，決定于加入鹽性質及Pr性質；性質；I 鹽濃度（鹽濃度（mol/L）原始濃度原始濃度P P小，鹽析所需小，鹽析所需

56、I高；高；P大，鹽析所需大，鹽析所需I低低 對混合對混合Pr的鹽析，的鹽析，P大，會發生嚴重共沉作用，一大，會發生嚴重共沉作用，一般控制濃度為般控制濃度為2.53%。混合混合Pr的鹽析的鹽析 合適鹽析范圍的選擇合適鹽析范圍的選擇 不同不同Pr鹽析峰有重疊，須權衡純度回收率。鹽析峰有重疊，須權衡純度回收率。 改變原始濃度改變原始濃度 一種蛋白質的不同濃度的沉淀曲線會變化一種蛋白質的不同濃度的沉淀曲線會變化 二次鹽析二次鹽析 在原鹽濃度下二次鹽析，可除去易溶雜質，但不在原鹽濃度下二次鹽析，可除去易溶雜質，但不能除去難溶雜質。能除去難溶雜質。3.7.1.3 鹽析操作要點鹽析操作要點 可使用的中性鹽有

57、：可使用的中性鹽有：(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4 NaCl 、NaAc 、 Na3PO4 、檸檬酸鈉等、檸檬酸鈉等 以以(NH4)2SO4 、Na2SO4最廣泛，前者最受歡迎最廣泛，前者最受歡迎鹽的種類及選擇：鹽的種類及選擇：鹽析范圍的確定鹽析范圍的確定 可采用鹽濃度對蛋白質沉淀量的鹽析曲可采用鹽濃度對蛋白質沉淀量的鹽析曲線測得。（從回收率和純度考慮）線測得。（從回收率和純度考慮）確定鹽析范圍舉例確定鹽析范圍舉例 取小樣分段鹽析，從回收率和純度考慮來取小樣分段鹽析，從回收率和純度考慮來確定范圍確定范圍鹽的加入方式鹽的加入方式 固體固體 緩慢加，防泡沫，要平衡緩慢加，防泡沫，要平

58、衡 液體液體（飽和鹽溶液）（飽和鹽溶液） 要求鹽析范圍小于要求鹽析范圍小于50%飽和度飽和度 鹽析反應完全需要一定時間，一般硫酸銨全部加鹽析反應完全需要一定時間，一般硫酸銨全部加完后，應放置完后，應放置30min以上才可進行固以上才可進行固-液分離。液分離。 透析鹽析透析鹽析 將將Pr溶液盛于透析袋中，放入一定濃度的鹽溶液盛于透析袋中，放入一定濃度的鹽溶液中，由于滲透壓的作用，袋中鹽濃度連溶液中，由于滲透壓的作用，袋中鹽濃度連續性變化，使續性變化，使Pr沉淀。沉淀。 反抽提法（反抽提法（Back-Extraction） 將包括要分離的將包括要分離的Pr在內的多種在內的多種Pr一起沉淀出一起沉淀

59、出來，然后選擇適當的遞減濃度的硫酸銨來抽來，然后選擇適當的遞減濃度的硫酸銨來抽提沉淀物。提沉淀物。3.7.1.4 鹽析操作的其他方法鹽析操作的其他方法3.7.1. 5 沉淀的再溶解沉淀的再溶解將沉淀溶于下一步所需的緩沖液將沉淀溶于下一步所需的緩沖液（12倍）倍）3.7.1. 6 脫脫 鹽鹽 透析透析 超濾超濾 根據所加操作壓所用膜平均孔徑的不根據所加操作壓所用膜平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透。同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透。 凝膠過濾層析凝膠過濾層析 此法脫鹽時間短，效果好。此法脫鹽時間短，效果好。3.7.2 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀3.7.2.1 基本原理基本原理 使溶液的介

60、電常數大大降低，從而增加使溶液的介電常數大大降低，從而增加帶電粒子自身之間的作用力，易聚集沉帶電粒子自身之間的作用力，易聚集沉淀；介電常數與靜電引力的關系，可用淀；介電常數與靜電引力的關系，可用庫侖公式表示庫侖公式表示: 爭奪酶、蛋白質等物質表面的水分子，爭奪酶、蛋白質等物質表面的水分子，破壞水化層，使分子易碰聚產生沉淀。破壞水化層，使分子易碰聚產生沉淀。幾種溶劑的介電常數幾種溶劑的介電常數3.7.2.2 特特 點點 優點優點 分辨能力比鹽析高分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他即一種生物分子或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉析；沉析不用脫鹽