1、-周有文、張亞萍周有文、張亞萍什么是蛋白質(zhì)組？什么是蛋白質(zhì)組？主要方法 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 凝膠雙向電泳凝膠雙向電泳、HPLC； 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) Edman 測序、質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)； 圖像分析與生物信息 圖像分析軟件，數(shù)據(jù)庫； 相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)芯片等。 雙向電泳技術(shù)、計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及雙向電泳技術(shù)、計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。蛋白質(zhì)組研質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線如下圖：究的技術(shù)路線如下圖：樣品樣品細胞、組織、體液細胞、組織、體液雙向

2、電泳雙向電泳電轉(zhuǎn)印到膜上電轉(zhuǎn)印到膜上圖象分析，數(shù)據(jù)處理圖象分析，數(shù)據(jù)處理膠上原位酶切膠上原位酶切直接直接1繼續(xù)處理繼續(xù)處理2繼續(xù)繼續(xù)處理處理3常規(guī)蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)常規(guī)蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)Edman降解降解氨基酸分析氨基酸分析N端序列端序列氨基酸組成氨基酸組成肽混合物肽混合物MALDI/TOF/MS肽質(zhì)量指紋譜肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)庫檢索ESI/MS/MS肽序列標簽肽序列標簽PSD/MALDI/TOF/MS32蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定寡核苷酸合成寡核苷酸合成蛋白實驗蛋白實驗免疫組化免疫組化肽合成肽合成基因基因抗體抗體蛋白活力蛋白活力蛋白定位蛋白定位蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫雙向凝膠電泳一、雙向

3、凝膠電泳的原理二、雙向凝膠電泳技術(shù)操作的基本過程三、雙向凝膠電泳過程中需要注意的問題（一）、雙向凝膠電泳的原理等電聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 在等電聚焦中蛋白質(zhì)總是向與其等電點相同的pH位置移動并停留在此位置上 等電點相同的蛋白質(zhì)都聚焦在與等電點相同的pH位置上pH1pH14-pI+SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種陰離子去污劑 ，帶大量的負電荷 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合，其所帶負電荷大大超過蛋白質(zhì)所帶電荷量，消除了不同蛋白之間所帶電荷的差異 SDS-PAGE中，蛋白質(zhì)遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān) 先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同，利用等電聚

4、焦進行第一向分離，將等電點相同的蛋白質(zhì)集中在與等電點相同的pH區(qū) 再以與等電聚焦成90度角的方向進行SDS-PAGE第二向分離，將等電點相同的蛋白質(zhì)再按分子量大小彼此分開 以此將復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上以點的形狀分離。 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳是各種蛋白質(zhì)分離分析方法中唯一能同時分辨上千個蛋白質(zhì)點的技術(shù) 蛋白質(zhì)組學研究中主要的分離技術(shù)二）、雙向凝膠電泳技術(shù)操作的基本過程 提取蛋白樣品，進行樣品的預(yù)處理 進行第一向等電聚焦電泳 等電聚焦后的膠條經(jīng)過平衡 轉(zhuǎn)移到第二向凝膠上，與等電聚焦呈垂直方向進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 用銀或考馬斯亮藍染色，經(jīng)雙向凝膠電泳圖像分析軟件進行凝膠圖像分析

5、找出差異表達的蛋白質(zhì)點細胞的破碎cell disruption去除干擾物removal of interfering substances蛋白溶解 solubilization of the proteins離子，脂質(zhì)，多糖，DNA，RNA，酚類等樣品制備樣品制備中遵循以下原則樣品制備中遵循以下原則: 樣本制備步驟盡可能簡單樣本制備步驟盡可能簡單, 以避免不必要的蛋白質(zhì)損失；以避免不必要的蛋白質(zhì)損失； 裂解細胞或組織的方法應(yīng)盡可能減少蛋白酶解裂解細胞或組織的方法應(yīng)盡可能減少蛋白酶解(proteolysis) 或降解或降解(degradation) ;； 避免反復(fù)凍融樣本。避免反復(fù)凍融樣本。 樣

6、本于雙向電泳前新鮮制備及溶解樣本于雙向電泳前新鮮制備及溶解; 去除樣本中的脫氧核糖核酸去除樣本中的脫氧核糖核酸(DNA ) , 核糖核酸核糖核酸(RNA ) , 脂脂質(zhì)等；質(zhì)等； 在樣本加入尿素后避免加熱；在樣本加入尿素后避免加熱； 蛋白質(zhì)提取一般使用含有變性劑、表面活性劑、還原劑、蛋白質(zhì)提取一般使用含有變性劑、表面活性劑、還原劑、固定固定pH 梯度緩沖液梯度緩沖液( IPG buffer)。 提取的主要方法是對細胞、組織等樣品進行破碎、溶解、提取的主要方法是對細胞、組織等樣品進行破碎、溶解、失活或還原失活或還原,盡可能斷開蛋白質(zhì)間的連接鍵盡可能斷開蛋白質(zhì)間的連接鍵, 再采用三氯乙再采用三氯乙

7、酸與冷丙酮聯(lián)用來沉淀提取全部蛋白質(zhì)。酸與冷丙酮聯(lián)用來沉淀提取全部蛋白質(zhì)。第一向： 變性的等電聚焦電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點進行分離第二向：SDS 聚丙烯酰胺電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量進行分離（三）、雙向凝膠電泳過程中需要注意的問題1.雙向凝膠電泳結(jié)果的可重復(fù)性蛋白質(zhì)樣品制備是關(guān)鍵 1）.盡可能地使蛋白質(zhì)組中的各種蛋白質(zhì)成分都溶解在裂解液中 2）. 防止制備過程中蛋白成分的降解與修飾 3）. 要保證蛋白質(zhì)徹底變性 4）.取材要有重現(xiàn)性：用細胞 不用組織5）裂解液中需加： 尿素斷裂蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵 還原劑破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵 兼性離子去垢劑增加疏水性氨基酸殘基的溶解性 6） 整個制備過程需在低溫環(huán)境

8、中進行，在裂解液中加入蛋白酶抑制劑用固相pH梯度等電聚焦（IPG） 防止陰極飄移，pH 梯度不穩(wěn)定 載體兩性電解質(zhì)在電場中依據(jù)其等電點形成pH梯度，這種pH梯度因陰極飄移而不穩(wěn)定，缺少重現(xiàn)性。 IPG中的pH梯度是凝膠聚合過程中通過酸性和堿性丙烯酰胺緩沖液形成的，是穩(wěn)定的 雙向電泳中的等電聚焦選用IPG2 凝膠中蛋白質(zhì)的染色同位素 同位素是目前已知最靈敏的蛋白質(zhì)染色方法 同位素是在細胞代謝過程中摻入蛋白質(zhì)的，不同蛋白質(zhì)摻入的同位素量不同，因此同位素強度不能代表蛋白質(zhì)的實際豐度 同位素標記的蛋白質(zhì)不能直接用于后續(xù)的鑒定實驗 銀染色 銀染色是除同位素外最靈敏的染色方法 只需110ng蛋白質(zhì)即可顯示

9、出條帶。 酸性的硝酸銀染色法更適合酸性蛋白的染色， 堿性的銀氨染色法對堿性蛋白質(zhì)的靈敏度稍高 雙向電泳的染色（銀染）雙向電泳的染色（銀染） 考馬斯亮藍染色 考馬斯亮藍R-250為三苯基甲烷，考馬斯亮藍G-250為二甲花青亮藍 R-250比G-250的靈敏度稍高，100ng左右蛋白質(zhì)即可顯示出條帶，G-250更適合染色小分子多肽 方法簡便，是最常用的染色方法 脫色后的蛋白質(zhì)樣品可用于質(zhì)譜分析等后續(xù)研究 雙向電泳的染色（考馬斯亮藍染色）雙向電泳的染色（考馬斯亮藍染色） 非共價修飾的熒光染料 如Sypro red 和Sypro orange 靈敏度可與銀染媲美 方法簡單，一步染色，無需脫色 樣品可直

10、接用于序列測定和質(zhì)譜分析鋅、銅負染 凝膠背景為不透明的乳白色或青綠色，蛋白斑點則是透明的 靈敏度介于銀染和考馬斯亮藍染色之間 染色對后續(xù)分析的干擾較小 目前在蛋白質(zhì)組研究中經(jīng)常將兩種染色方法結(jié)合使用 先經(jīng)銀染分析確定有意義的蛋白斑點，再加大上樣量，重作電泳，用考馬斯亮藍染色 純化的樣品經(jīng)脫色后進一步進行質(zhì)譜鑒定 差異凝膠電泳（Differential gel electrophoresis） 2、質(zhì)譜儀的基本組成、質(zhì)譜儀的基本組成進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)離子源離子源質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器檢測器檢測器1.氣體擴散2.直接進樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學電離3.場致電離4.激光 1.單聚焦 2.雙聚焦

11、3.飛行時間4.四極桿 質(zhì)譜圖意義質(zhì)譜圖意義A: 離子的相對強度離子的相對強度(Y axis)B: 離子的質(zhì)量與電荷比離子的質(zhì)量與電荷比(m/z, X axis)C: 質(zhì)譜圖中最強的峰稱為基峰質(zhì)譜圖中最強的峰稱為基峰(base peak)D: 相對于特定的檢測器時稱為峰的絕對強度相對于特定的檢測器時稱為峰的絕對強度E: 所有質(zhì)譜峰對應(yīng)的是離子電信號強度和離子應(yīng)在所有質(zhì)譜峰對應(yīng)的是離子電信號強度和離子應(yīng)在m/z位置而非真實的離子強度和離子位置而非真實的離子強度和離子.F: 棒狀譜棒狀譜(centroidal peak) G: 高斯峰高斯峰(gauss peak)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜基

12、質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 （MALDI-TOF)MALDI-TOF)（1）主要技術(shù)主要技術(shù) 基質(zhì)輔助激光解吸電離基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)技術(shù) 線性飛行時間質(zhì)量檢測器線性飛行時間質(zhì)量檢測器( (time of flighttime of flight，TOF)TOF)MALDI原理：將分析物分散在基質(zhì)分子將分析物分散在基質(zhì)分子(尼古丁酸及其同系物尼古丁酸及其同系物)中并形成晶體，當用激光中并形成晶體，當用激光(337nm的氮激光的氮激光)照射晶體時，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)照射

13、晶體時，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)樣品之樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。基質(zhì)基質(zhì)的使用是這一電離技術(shù)的關(guān)鍵，基質(zhì)吸的使用是這一電離技術(shù)的關(guān)鍵，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量并氣化，同時將樣品分子帶入氣相，樣品分子只吸收少收了激光的大部分能量并氣化，同時將樣品分子帶入氣相，樣品分子只吸收少量激光能量，量激光能量，避免避免了了分子化學鍵的斷裂分子化學鍵的斷裂。基質(zhì)在樣品離子形成過程中充當了質(zhì)。基質(zhì)在樣品離子形成過程中充當了質(zhì)子化或去質(zhì)子化試劑，使樣品分子帶上子化或去質(zhì)子化試劑，使樣品分子帶上正電荷或負電荷正電荷或負電荷。 TOFTOF原理原理u離子源中每一

14、脈沖激光產(chǎn)離子源中每一脈沖激光產(chǎn)生的離子先經(jīng)過一個加速生的離子先經(jīng)過一個加速電場，獲得動能，再進入電場，獲得動能，再進入一個高真空無電場飛行管一個高真空無電場飛行管道離子在此無電場飛行道離子在此無電場飛行管道內(nèi)以在加速電場獲得管道內(nèi)以在加速電場獲得的速度飛行。質(zhì)量較輕的的速度飛行。質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，較早到離子飛行速度快，較早到達檢測器，較重的離子飛達檢測器，較重的離子飛行速度慢，較晚到達檢測行速度慢，較晚到達檢測器，器，離子的飛行時間與其離子的飛行時間與其質(zhì)荷比的平方根質(zhì)荷比的平方根(mz) 成正比，通過檢測飛行時成正比，通過檢測飛行時間來測定離子的質(zhì)荷比。間來測定離子的質(zhì)荷比。 酵母

15、雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)一、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理一、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理二、酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序二、酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序三、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用三、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用四、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展四、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展酵母雙雜交系統(tǒng)（酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system） 也叫相互作用陷阱（也叫相互作用陷阱（Interaction trap） 由由Fields和和Song于于1989年建立年建立 用于研究用于研究細胞內(nèi)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。互作用。（一）、酵母雙雜交技術(shù)原理酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子

16、結(jié)構(gòu)與功能的認識 真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域BDAD組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開 功能互相獨立功能互相獨立 空間較近時表現(xiàn)活性空間較近時表現(xiàn)活性 中間序列對活性無影響中間序列對活性無影響酵母轉(zhuǎn)錄因子酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端端C端端147AA213AABDADLexA蛋白蛋白 單純皰疹病毒的單純皰疹病毒的VP編碼區(qū)編碼區(qū) BDAD大腸桿菌的大腸桿菌的LexA蛋白蛋白 選擇酵母細胞作為雙雜交系統(tǒng)的宿主菌株：1.酵母細胞具有翻譯后加工功能 2. 酵母細胞有很多的營養(yǎng)缺陷型標記，篩選陽性克隆比較方便、容易。3. 酵母

17、細胞有性生殖形成二倍體細胞，轉(zhuǎn)化容易，轉(zhuǎn)化率高 構(gòu)建兩種可在大腸桿菌和酵母細胞中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒載體 1. Ampr基因基因-大腸桿菌篩大腸桿菌篩選標記選標記 2. Trp、Leu-酵母篩選標酵母篩選標記記3. X與與BD以融合蛋白形以融合蛋白形式表達，式表達，Y與與AD以融合以融合蛋白表達蛋白表達報告基因 在GAL4結(jié)合的順式作用元件下游需連接報告基因。 目前應(yīng)用最多的報告基因是LacZ基因，表達后能在X-Gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色菌落。 其次是His基因，表達后能使酵母菌在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長。 現(xiàn)在多提倡兩種報告基因同時應(yīng)用，顏色篩選和營養(yǎng)缺陷篩選同時進行，以降低假陽性的出現(xiàn) 酵母雙雜交原

18、理示意圖酵母雙雜交原理示意圖 （二）、酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序 1. 構(gòu)建X蛋白表達質(zhì)粒 將X蛋白基因與BD質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用Amp抗性標記篩選陽性克隆，測序驗證，并通過SDS-PAGE和Western Blotting檢測融合蛋白。 2. 構(gòu)建Y蛋白表達質(zhì)粒或預(yù)轉(zhuǎn)文庫 如Y蛋白是已知蛋白，則將Y蛋白基因與AD質(zhì)粒重組。如Y蛋白是未知蛋白，則需用AD質(zhì)粒構(gòu)建cDNA文庫。要求文庫含有足夠的轉(zhuǎn)化子，數(shù)量在107以上，保證文庫內(nèi)含有研究者所感興趣的蛋白。3. 從大腸桿菌中提取兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細胞 在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal的培養(yǎng)基上篩選 在此培養(yǎng)基上生長的藍色菌落證

19、明X蛋白和Y蛋白能互相作用。 酵母的接合型 a接合型接合型 接合型接合型 單倍體單倍體 二倍體二倍體 單倍體單倍體DNA-BD載體載體 DNA-AD載體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 a接合型酵母接合型酵母 接合型酵母接合型酵母Trp、Leu、HisTrp篩選篩選X和和Y蛋白相互作用蛋白相互作用Y基因與基因與DNA-AD質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌X-BD重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒Y-AD重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細胞共轉(zhuǎn)化酵母細胞Trp和和Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基Trp、Leu、His營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基X-gal藍色菌落藍色菌落X和和Y蛋白相互作用蛋白相互作用無菌落生長無

20、菌落生長X和和Y蛋白間無作用蛋白間無作用Amp培養(yǎng)基培養(yǎng)基X基因與基因與DNA-BD質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組（三）、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 1. 檢測兩種已知蛋白質(zhì)之間在體內(nèi)是否存在相互作用. 這是酵母雙雜交系統(tǒng)最基本用途 將兩種已知蛋白質(zhì)的編碼基因分別克隆到BD載體和AD載體上，共同轉(zhuǎn)染酵母細胞。若報告基因得到表達，則證明兩種蛋白質(zhì)之間在細胞內(nèi)存在相互作用。2. 篩選與已知蛋白質(zhì)相互作用的新的蛋白質(zhì)。 這是酵母雙雜交技術(shù)最廣泛，最有價值的用途 將已知蛋白質(zhì)基因克隆在BD載體上，將要篩選的 cDNA庫克隆在AD載體上，據(jù)此可從cDNA庫中篩選出能與已知蛋白質(zhì)相互作用的新蛋白質(zhì)。 3. 確定蛋白質(zhì)之間相互

21、作用的結(jié)構(gòu)域或活性區(qū) 將一個蛋白質(zhì)突變或缺失掉不同的片段，再檢測兩種蛋白質(zhì)在雙雜交系統(tǒng)中還能否保持轉(zhuǎn)錄激活作用，從而確定蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域或活性區(qū)。 4. 篩選多肽類新藥篩選多肽類新藥 將藥物作用的靶蛋白基因克隆在將藥物作用的靶蛋白基因克隆在BD載載體上，待篩選的多肽藥物基因克隆在體上，待篩選的多肽藥物基因克隆在AD載載體上，從中篩選作用于靶蛋白的多肽類新體上，從中篩選作用于靶蛋白的多肽類新藥藥 5. 繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)或圖譜 雙雜交系統(tǒng)的BD及AD質(zhì)粒均接上cDNA庫，讓它們隨機表達蛋白 通過檢測報告基因的表達可以證實一系列嶄新蛋白中兩兩間的相互作用 如能證實在蛋白質(zhì)A-B、B-C

22、和C-D間都存在相互作用，據(jù)此可繪制出ABCD的蛋白間聯(lián)系圖譜（四）、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展酵母雙雜交系統(tǒng)局限性酵母雙雜交系統(tǒng)局限性某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。-雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域作用的結(jié)構(gòu)域某些蛋白在酵母中某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達或不能準確定位不穩(wěn)定表達或不能準確定位到到胞核內(nèi)。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用胞核內(nèi)。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌噬菌體顯示系統(tǒng)體顯示系統(tǒng)。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯

23、后胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進行。無法進行。 有時有時DNA-BD或或AD融合部分不包括相互作用位融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。4. 哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細胞不能提供這樣的折疊和翻譯后修飾，而酵母細胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋環(huán)境。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究白等的研究 陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究。原表位特異性的抗體進行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實驗手段來驗證。其它的實驗手段來驗證。 1. 細菌雙雜交系統(tǒng) 直接在細胞質(zhì)內(nèi)研究蛋白之間相互作用，適用于不能進