1、流式細胞術描述流式細胞術Flow cytometry，FCM 第一頁，共六十六頁。流式細胞術描述1. 流式細胞儀流式細胞儀(Flow Cytometer):是現代物理電子技術、激光技是現代物理電子技術、激光技術、計算機技術于一體的先進科學技術設備。術、計算機技術于一體的先進科學技術設備。2. 流式細胞術流式細胞術(Flow Cytometry):利用流式細胞儀對處利用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐于快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐個個(zhg)、多參數、快速的定性、定量分析或分選的技、多參數、快速的定性、定量分析或分選的技術。術。基本概念基本概念第二頁

2、，共六十六頁。流式細胞術描述第一節第一節 流式細胞儀基本結構與原理流式細胞儀基本結構與原理第二節第二節 流式細胞術的數據分析流式細胞術的數據分析第三節第三節 流式細胞儀分析的技術要求流式細胞儀分析的技術要求(yoqi)(yoqi)第四節第四節 流式細胞術的應用流式細胞術的應用第三頁，共六十六頁。流式細胞術描述 一、一、流式細胞儀基本結構流式細胞儀基本結構(jigu)(jigu)與功能與功能 二、流式細胞術的重要術語二、流式細胞術的重要術語 三、三、流式細胞術基本原理流式細胞術基本原理 四、四、流式細胞術的樣本設置流式細胞術的樣本設置第一節第一節 流式細胞儀基本流式細胞儀基本(jbn)(jbn)

3、結構與原理結構與原理第四頁，共六十六頁。流式細胞術描述 四、流式細胞術的樣本四、流式細胞術的樣本(yngbn)設置設置n1. 常用對照陰性對照陽性(yngxng)對照空白對照補償對照n2.一套完整的流式細胞術檢測樣本設置第五頁，共六十六頁。流式細胞術描述陰性(ynxng)對照 作用是調節各熒光探測器合適的放大倍數，將儀器歸零，即確定待測標本的基礎熒光域值n免疫球蛋白同型對照免疫球蛋白同型對照（同型抗體為沒有(mi yu)特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白。反映待測標本對抗體非特異性結合的 水平）n陰性細胞對照陰性細胞對照（用已知不表達某種抗原的細胞進行平行實驗，通常用于確定抗體的特異性

4、）第六頁，共六十六頁。流式細胞術描述陽性(yngxng)對照 即用已知表達某種抗原的細胞(xbo)（陽性細胞(xbo)）細胞(xbo)進行平行實驗，通常用于檢測抗體是否有問題或確定實驗方法的穩定性、準確性。第七頁，共六十六頁。流式細胞術描述空白對照 即不進行標記的細胞。有些細胞內物質會同樣被激發(jf)而產生自發熒光。空白對照的主要作用用于確定待測標本的基礎熒光域值或檢測染色方法是否成功。第八頁，共六十六頁。流式細胞術描述補償(bchng)對照 由于光譜的重疊(chngdi)，對于多色分析樣本必須設置補償對照。補償對照主要用于多色分析時熒光光譜重疊(chngdi)的補償調節。 補償對照是將用于

5、多色標記的各種熒光抗體分別與樣本反應，一一進行單色標記，以測定熒光信號的重疊并作適當調節。第九頁，共六十六頁。流式細胞術描述2.一套完整一套完整(wnzhng)的流式細胞術檢測樣本設置的流式細胞術檢測樣本設置 流式細胞術的基本原理是利用流式細胞術的基本原理是利用細胞標記前后的熒光細胞標記前后的熒光(ynggung)強度改強度改變變來確定細胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用于確定其基礎熒光域來確定細胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用于確定其基礎熒光域值的對照（如空白對照或陰性對照），又要有已標記的待測樣本。一套值的對照（如空白對照或陰性對照），又要有已標記的待測樣本。一套完整的流式樣本設置可根據

6、其不同的標記方法進行如下設置。完整的流式樣本設置可根據其不同的標記方法進行如下設置。 直接標記樣本直接標記樣本 對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（同型抗體對照）對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（同型抗體對照）和待測樣本。對于直接標記多色樣本，在單色基礎上另加補償對和待測樣本。對于直接標記多色樣本，在單色基礎上另加補償對照。照。 間接標記樣本間接標記樣本 對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（一抗同型抗體對照）和待對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（一抗同型抗體對照）和待測樣本。測樣本。 對于多色樣本，在單色基礎上另加補償對照，一般不建議使用。對于多色樣本，在單色基礎上另加補償對照，一

7、般不建議使用。第十頁，共六十六頁。流式細胞術描述三、流式細胞術基本原理三、流式細胞術基本原理n1.1.流式細胞術分析的基本原理流式細胞術分析的基本原理n2.2.流式細胞術分選的基本原理流式細胞術分選的基本原理n3.3.流式細胞儀熒光流式細胞儀熒光(ynggung)(ynggung)補償設置補償設置第十一頁，共六十六頁。流式細胞術描述1.流式細胞術分析(fnx)的基本原理n前向散射與側向散射是細胞前向散射與側向散射是細胞的固有屬性，暫稱為物理屬的固有屬性，暫稱為物理屬性。性。n熒光信號熒光信號(xnho)是人們通過不是人們通過不同手段將熒光物質結合在細胞同手段將熒光物質結合在細胞上，是人為屬性，

8、暫稱為化學上，是人為屬性，暫稱為化學屬性。屬性。第十二頁，共六十六頁。流式細胞術描述R1：淋巴細胞R2：單核細胞R3：粒細胞R4：紅細胞裂解碎片(su pin)和少量血小板 將目的細胞群圈定將目的細胞群圈定(qun dn)（即設門），然后將門內細胞以（即設門），然后將門內細胞以FSC或或SSC為橫坐標，為橫坐標，熒光信號為縱坐標的散點分布圖表示出來，此圖中細胞會出現在與其熒光信號為縱坐標的散點分布圖表示出來，此圖中細胞會出現在與其FSC或或SSC相應的相應的位置，并只可能表現兩種情況：熒光信號弱或無、熒光信號強或有。位置，并只可能表現兩種情況：熒光信號弱或無、熒光信號強或有。 第十三頁，共六十

9、六頁。流式細胞術描述 調節電壓可改變目的細胞的熒光信號強弱，那么如何判斷特異性調節電壓可改變目的細胞的熒光信號強弱，那么如何判斷特異性熒光信號的有無？熒光信號的有無？ 需要設置陰性對照以確定細胞自身基礎需要設置陰性對照以確定細胞自身基礎(jch)熒光域值，并通過它熒光域值，并通過它來判斷待測樣本中是否有特異性熒光信號。來判斷待測樣本中是否有特異性熒光信號。 第十四頁，共六十六頁。流式細胞術描述 首先通過調節電壓將陰性對首先通過調節電壓將陰性對照細胞的基礎熒光域值調至陰性照細胞的基礎熒光域值調至陰性致信區內致信區內(q ni)(q ni)，然后對陰性置，然后對陰性置信區進行界定，大于陰性置信區信

10、區進行界定，大于陰性置信區的熒光信號為特異性熒光信號。的熒光信號為特異性熒光信號。 對于流式樣本來說，設置陰性對于流式樣本來說，設置陰性對照是必須的，且陰性置信區一旦對照是必須的，且陰性置信區一旦設定，將作為后續樣本的陰、陽性設定，將作為后續樣本的陰、陽性判斷的基礎，不能隨意變動。判斷的基礎，不能隨意變動。第十五頁，共六十六頁。流式細胞術描述2.流式細胞術分選的基本原理1. 分選速度：幾千個細胞分選速度：幾千個細胞/秒秒2. 分選純度分選純度: 99.5%左右左右(zuyu) 分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比。分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比。3. 分選收獲率分選收獲率: 90-95%

11、 分離后所得的細胞亞群數占原細胞樣品中該亞群細胞數的百分離后所得的細胞亞群數占原細胞樣品中該亞群細胞數的百分比。分比。第十六頁，共六十六頁。流式細胞術描述3.3.流式細胞儀熒光補償流式細胞儀熒光補償(bchng)(bchng)設置設置以以FITC、PE雙色分析為例：雙色分析為例：（1）先調節陰性對照管（即同型對照）先調節陰性對照管（即同型對照IgGFITC、IgGPE）：先將原補償）：先將原補償清零，通過調節電壓，使陰性群落清零，通過調節電壓，使陰性群落(qnlu)在在FITC和和PE雙陰性區。陰性雙陰性區。陰性對照的作用是，調節各熒光探測器合適的放大倍數，即歸零。對照的作用是，調節各熒光探測

12、器合適的放大倍數，即歸零。第十七頁，共六十六頁。流式細胞術描述（2）FITC標記標記(bioj)抗體抗體/IgGPE：(IgGPE為同型對照為同型對照) 此時電壓已通過陰此時電壓已通過陰性對照設定，絕不能變動。當性對照設定，絕不能變動。當PE探測器檢測到的探測器檢測到的FITC信號恰好完全消信號恰好完全消除時，補償便是正確的，即除時，補償便是正確的，即FITC單陽性細胞的單陽性細胞的PE信號與陰性對照的信號與陰性對照的PE信號一致。信號一致。 注：首先要知道雙陰性細胞的情況，其次是在檢測管中，必須要有注：首先要知道雙陰性細胞的情況，其次是在檢測管中，必須要有FITC單陽性細胞和雙陰性細胞。單陽

13、性細胞和雙陰性細胞。第十八頁，共六十六頁。流式細胞術描述第十九頁，共六十六頁。流式細胞術描述（3）IgGFITC/PE標記抗體：同理，將進入FITC探測器的PE信號降至本底一致，前提是必須有PE單陽性細胞和雙陰性細胞。（4）當設置好以上(yshng)補償條件后，即補償調節完畢。第二十頁，共六十六頁。流式細胞術描述（5）進行多色分析時，必須(bx)做各熒光間的補償。方法同上，先準備各種標記的熒光陰性對照，確定合適的電壓，并逐一調節各熒光標記抗體，與其他熒光對照，然后調節特異性熒光對每個熒光的補償。第二十一頁，共六十六頁。流式細胞術描述二、流式細胞術的重要二、流式細胞術的重要(zhngyo)術語術

14、語n1.1.前向散射與側向散射前向散射與側向散射n2. Coulter2. Coulter效應與電子體積效應與電子體積(tj)(tj)n3.3.熒光信號及其面積與寬度熒光信號及其面積與寬度n4.4.光譜重疊與熒光補償光譜重疊與熒光補償n5.5.細胞基礎熒光域值與陰性對照置信區間細胞基礎熒光域值與陰性對照置信區間第二十二頁，共六十六頁。流式細胞術描述1.前向散射(snsh)與側向散射(snsh)前向散射光前向散射光 (forward scatter)(forward scatter)： FSCFSC信號的強弱與細胞的大小相關信號的強弱與細胞的大小相關側向側向(c xin)(c xin)散射光（散

15、射光（side scatter)side scatter)： SSCSSC信號的強弱與細胞內的顆粒多少相關信號的強弱與細胞內的顆粒多少相關第二十三頁，共六十六頁。流式細胞術描述第二十四頁，共六十六頁。流式細胞術描述 利用前向角和利用前向角和測向角散射光可測向角散射光可以把外周血白細以把外周血白細胞分成胞分成(fn chn)三群，淋三群，淋巴細胞、單核巴細胞、單核細胞和粒細胞。細胞和粒細胞。散射光的測定散射光的測定(cdng)第二十五頁，共六十六頁。流式細胞術描述2.Coulter效應(xioyng)與電子體積 Coulter Coulter效應原理：微小效應原理：微小(wixio)(wixio

16、)粒子并不導電，但通粒子并不導電，但通過充滿電解液的小孔時可產生過充滿電解液的小孔時可產生電阻變化，細胞體積越大，電電阻變化，細胞體積越大，電阻的改變越大。可將電阻變化阻的改變越大。可將電阻變化記錄為電位變化，用于微小記錄為電位變化，用于微小(wixio)(wixio)粒子體積測量和計數粒子體積測量和計數上。采用這種方法計算該顆粒上。采用這種方法計算該顆粒的體積就是電子體積。的體積就是電子體積。第二十六頁，共六十六頁。流式細胞術描述3.熒光(ynggung)信號及其面積與寬度熒光信號被光電倍增管收集，形成信號脈沖，每個信號脈沖都有其高度、面積熒光信號被光電倍增管收集，形成信號脈沖，每個信號脈沖

17、都有其高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個與寬度。每種顏色的熒光占用一個(y )特定的檢測器，每種顏色的檢測器特定的檢測器，每種顏色的檢測器稱為一個稱為一個(y )熒光通道。熒光通道。脈沖高度表示熒光信號的強度，表示為脈沖高度表示熒光信號的強度，表示為FLn-Height，n為儀器的熒光收集器序數。為儀器的熒光收集器序數。脈沖面積（脈沖面積（FLn-A）是采用積分計算的熒光通量。（熒光脈沖面積比高度更能準確）是采用積分計算的熒光通量。（熒光脈沖面積比高度更能準確反映反映DNA含量，用于含量，用于DNA倍體分析）倍體分析）脈沖寬度（脈沖寬度（FLn-W）反映熒光的分布，）反映熒光的分布，常用

18、來區分雙連體細胞常用來區分雙連體細胞。第二十七頁，共六十六頁。流式細胞術描述第二十八頁，共六十六頁。流式細胞術描述4.光譜(gungp)重疊與熒光補償 利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光(ynggung)(ynggung)通道的通道的信號加以扣除的技術稱信號加以扣除的技術稱“熒光補償熒光補償”第二十九頁，共六十六頁。流式細胞術描述5.細胞基礎熒光域值與陰性(ynxng)對照置信區間對于對于(duy)流式樣本，由于細胞的自發熒光、熒光抗體會與待測標本中的細胞發生少流式樣本，由于細胞的自發熒光、熒光抗體會與待測標本中的細胞發生少量非特異性結合，

19、在流式細胞儀上可檢出一定的信號，這部分信號稱為基礎熒光量非特異性結合，在流式細胞儀上可檢出一定的信號，這部分信號稱為基礎熒光域值。域值。在流式標本檢測過程中，通常需要通過調節電壓將陰性細胞的基礎熒光域值在流式標本檢測過程中，通常需要通過調節電壓將陰性細胞的基礎熒光域值置于置于95%或或99%的置信區間內，作為陰性對照可信區間設定。的置信區間內，作為陰性對照可信區間設定。第三十頁，共六十六頁。流式細胞術描述一、流式細胞儀基本結構一、流式細胞儀基本結構(jigu)與功與功能能n1. 流式細胞儀基本流式細胞儀基本(jbn)結構結構n2. 流式細胞儀的基本功能與應用流式細胞儀的基本功能與應用第三十一頁

20、，共六十六頁。流式細胞術描述2. 流式細胞儀的基本功能與應用流式細胞儀的基本功能與應用(yngyng)n定性或定量分析功能定性或定量分析功能細胞膜：細胞膜：細胞表面抗原，表面糖類細胞表面抗原，表面糖類(tn li)(tn li)，表面受體，膜電位，表面受體，膜電位，膜結合鈣離子，細胞表面電荷等，這對確定細胞的性質及其功能重膜結合鈣離子，細胞表面電荷等，這對確定細胞的性質及其功能重要。要。細胞質：細胞質：各種細胞成分，包括蛋白質、各種細胞成分，包括蛋白質、RNARNA、各種細胞器中的特殊成、各種細胞器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細胞因子等。分、各種抗原、基因編碼蛋白、細胞因子等。細胞核

21、：細胞核：DNADNA、RNARNA、蛋白質等、蛋白質等n分選功能分選功能可將具有特定性狀或功能的細胞從混合細胞群中分離出來，可將具有特定性狀或功能的細胞從混合細胞群中分離出來，再進行分析或培養。優點：分選純度高（可達再進行分析或培養。優點：分選純度高（可達99%99%），分選），分選回收率高，可分選活細胞。回收率高，可分選活細胞。第三十二頁，共六十六頁。流式細胞術描述1. 流式細胞儀基本流式細胞儀基本(jbn)結構結構n流動室與液流系統流動室與液流系統n光源與光學系統光源與光學系統激發光源激發光源光學系統光學系統n信號收集與光電轉換信號收集與光電轉換(zhunhun)系統系統n計算機與分析系

22、統計算機與分析系統第三十三頁，共六十六頁。流式細胞術描述流動流動(lidng)室與室與液流系統液流系統第三十四頁，共六十六頁。流式細胞術描述PMTPMTPMTPMT二分二分(r fn)鏡鏡帶通濾光片帶通濾光片激光激光(jgung)1234Flow cell 由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學元件組成，它由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學元件組成，它們分別將不同們分別將不同(b tn)波長的光信號送入到不同波長的光信號送入到不同(b tn)的探測器。濾光片主要分為四類：的探測器。濾光片主要分為四類：長通濾光片長通濾光片（LP）、短通濾光片（）、短通濾光片（SP）、帶通濾光）、帶通濾光片（片（BP

23、）和）和二分鏡二分鏡光學系統光學系統 第三十五頁，共六十六頁。流式細胞術描述第三十六頁，共六十六頁。流式細胞術描述第三十七頁，共六十六頁。流式細胞術描述激發光源n激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向(fngxing)、同步的穩定光照n激光波長: 臺式機為固定波長488nm, 633nm ，大型機波長譜線寬包括325，457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm第三十八頁，共六十六頁。流式細胞術描述信號收集與光電轉換信號收集與光電轉換(zhunhun)系統系統 主要由光電轉換器件、放大器和信號處理電路組成主要由光電轉換器件、

24、放大器和信號處理電路組成n光電轉換器件主要功能光電轉換器件主要功能(gngnng)(gngnng)是將光信號轉換成電流是將光信號轉換成電流信號。由光電二極管和光電倍增管（信號。由光電二極管和光電倍增管（PMTPMT）來執行。）來執行。n放大器分兩類：線性放大和對數放大。放大器分兩類：線性放大和對數放大。n信號處理系統的主要功能是將電信號轉變成脈沖信號、數信號處理系統的主要功能是將電信號轉變成脈沖信號、數字信號最終傳送給計算機系統進行處理。字信號最終傳送給計算機系統進行處理。第三十九頁，共六十六頁。流式細胞術描述計算機與分析計算機與分析(fnx)系統系統n計算機系統用于控制整個儀器的運行，數據(

25、shj)采集和數據(shj)分析。n各公司所產的流式細胞儀都有自己特有的分析系統。第四十頁，共六十六頁。流式細胞術描述第二節第二節 流式細胞術的數據分析流式細胞術的數據分析n一、參數前向散射光前向散射光FSC: 反映顆粒的大小反映顆粒的大小(dxio)側向散射光側向散射光SSC: 細胞內部結構復雜程度細胞內部結構復雜程度熒光熒光FL: 細胞被染上熒光部分數量的多少細胞被染上熒光部分數量的多少n二、數據的顯示與分析n三、設門第四十一頁，共六十六頁。流式細胞術描述二、數據的顯示(xinsh)與分析n1.單參數單參數(cnsh)直方圖直方圖n2.二維散點圖二維散點圖n3.二維等高線圖二維等高線圖n4

26、.假三維圖假三維圖n5.三維圖三維圖第四十二頁，共六十六頁。流式細胞術描述 以分布直方圖以分布直方圖( distribution histogram )( distribution histogram )來顯示，橫軸為該參來顯示，橫軸為該參數測量強度相對值，單位是道數。強度分布可以數測量強度相對值，單位是道數。強度分布可以(ky)(ky)是線性的，也可是線性的，也可以以(ky)(ky)是對數的。縱軸一般是細胞數或細胞出現的頻數是對數的。縱軸一般是細胞數或細胞出現的頻數。1.1.單參數單參數(cnsh)(cnsh)直方圖直方圖第四十三頁，共六十六頁。流式細胞術描述看圖技巧：看圖技巧：1.1.先看

27、橫、縱坐標，了解檢測目的；先看橫、縱坐標，了解檢測目的；2.2.看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強度越強；看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強度越強；3.M13.M1的確定的確定(qudng)(qudng)是根據陰性對照細胞的基礎熒光域值設定的，峰形右移，熒光是根據陰性對照細胞的基礎熒光域值設定的，峰形右移，熒光信號大于基礎熒光域值（信號大于基礎熒光域值（M1M1），表示陽性（），表示陽性（M2M2）；）；4.4.數據統計時，檢測目的物一般用各數據統計時，檢測目的物一般用各MarkerMarker區內的細胞所占百分比或用平均熒光區內的細胞所占百分比或用平均熒光強度表示；強度表

28、示；5.5.幾個直方圖的比較，關鍵看幾個直方圖的比較，關鍵看MarkerMarker（M1M1、M2M2）的位置以及細胞數。）的位置以及細胞數。第四十四頁，共六十六頁。流式細胞術描述 能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系(gun x)(gun x)，橫、，橫、縱坐標分別代表兩個獨立參數，平面上每一個點表示具有相應坐標縱坐標分別代表兩個獨立參數，平面上每一個點表示具有相應坐標值的細胞。值的細胞。2.二維散點圖二維散點圖第四十五頁，共六十六頁。流式細胞術描述看圖技巧：1.先看x，y軸，了解代表參數的意義；2.再看其四個象限，并了解各象限意義；3.比較

29、幾個散點圖時，關鍵看四象限劃分區間的位置以及各象限散點的密度；4.數據統計時，檢測目的物一般(ybn)用各象限區內的細胞數占門內細胞百分比或用平均熒光強度表示。第四十六頁，共六十六頁。流式細胞術描述 用等高線來表示細胞用等高線來表示細胞(xbo)(xbo)數，在一條等高線上細胞數，在一條等高線上細胞(xbo)(xbo)數相數相同，不同的等高線上細胞數不同。同，不同的等高線上細胞數不同。3.二維等高線圖二維等高線圖第四十七頁，共六十六頁。流式細胞術描述 縱軸與橫軸分別代表縱軸與橫軸分別代表(dibio)(dibio)被測細胞的兩個測量參被測細胞的兩個測量參數數,Z,Z軸為細胞數。軸為細胞數。4

30、. .假三維圖假三維圖第四十八頁，共六十六頁。流式細胞術描述5.5.三維圖三維圖 任意選三個參數為任意選三個參數為x x，y y，z z軸，構成一個三維圖，每一群細胞根據軸，構成一個三維圖，每一群細胞根據各自參數處于一個相對獨立的空間各自參數處于一個相對獨立的空間(kngjin)(kngjin)，三維圖對比較復雜的亞群，三維圖對比較復雜的亞群的顯示更為直觀明了。的顯示更為直觀明了。第四十九頁，共六十六頁。流式細胞術描述三、設門流式細胞術數據分析的目的是通過與適當的陰性對照進行比較，流式細胞術數據分析的目的是通過與適當的陰性對照進行比較，來確定所分析樣本中表達標記物的細胞百分率。完成這一過程的第

31、一來確定所分析樣本中表達標記物的細胞百分率。完成這一過程的第一步就是需要確定我們所要研究的目的細胞群，其術語為設門步就是需要確定我們所要研究的目的細胞群，其術語為設門（gatinggating）。）。設門是指在細胞分布圖中指定某一個范圍或某一細胞性狀的細設門是指在細胞分布圖中指定某一個范圍或某一細胞性狀的細胞群，并對其進行單參數或多參數分析。胞群，并對其進行單參數或多參數分析。根據根據(gnj)(gnj)散射光設門散射光設門根據某一細胞性狀設門根據某一細胞性狀設門組合設門組合設門第五十頁，共六十六頁。流式細胞術描述第五十一頁，共六十六頁。流式細胞術描述 一、一、樣品樣品(yngpn)(yngp

32、n)制備：單細胞懸液制備：單細胞懸液 二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色 三、質量控制三、質量控制第三節第三節 流式細胞儀免疫流式細胞儀免疫(miny)(miny)分析的技術要分析的技術要求求第五十二頁，共六十六頁。流式細胞術描述一一、樣品、樣品(yngpn)(yngpn)制備制備流式細胞儀的樣品要求：流式細胞儀的樣品要求： 單細胞懸液，避免任何單細胞懸液，避免任何(rnh)(rnh)細胞沉積細胞沉積 被檢細胞或顆粒大小被檢細胞或顆粒大小0.20.240um40um 樣品中至少樣品中至少2000020000個細胞，濃度個細胞，濃度10105 5-10-

33、106 6個個/ /毫升毫升第五十三頁，共六十六頁。流式細胞術描述（一）外周血淋巴細胞樣品（一）外周血淋巴細胞樣品(yngpn)(yngpn)的制備的制備 利用紅細胞裂解利用紅細胞裂解(li ji)液去除紅細胞后，得到外周血中所有白細胞液去除紅細胞后，得到外周血中所有白細胞的流式細胞分析的二維散點圖的流式細胞分析的二維散點圖第五十四頁，共六十六頁。流式細胞術描述 單層培養細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法單層培養細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細胞從培養皿上消化下來，然后離心漂洗。使細胞從培養皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮懸浮(xunf)(xunf)培養細胞，可不用酶消化，直接吹打制備培養

34、細胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細胞懸液。成單細胞懸液。（二（二) ) 培養細胞的樣品培養細胞的樣品(yngpn)(yngpn)制備制備第五十五頁，共六十六頁。流式細胞術描述 機械法：機械法：剪碎法、網搓法、研磨法。剪碎法、網搓法、研磨法。 酶處理酶處理(chl)法：法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學試劑處理法：化學試劑處理法：EDTA、EGTA等。等。 表面活性劑處理法：表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。、皂素等。(三三)新鮮新鮮(xn xin)實體組織單細胞懸液的制備實體組織單細胞懸液的制備第五十六頁，共六十六頁。流式細胞術描述 機械

35、法機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較低往往常成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較低的細胞產量。的細胞產量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網過濾團塊等，如用低速離心去碎片，用尼龍網過濾團塊等，也可利用電子學技術處理的方法排除也可利用電子學技術處理的方法排除(pich)(pich)團塊和碎片團塊和碎片的干擾。的干擾。 酶學法、化學法酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想，但會造對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學成份的不良影響。成所測化學成份的不良影響。FCMFCM所測細胞是單個分散狀態；所測細胞是單個分散狀態；對細胞團塊，細胞碎片盡可能少；細胞的活性不受損害，對細胞團塊，細胞碎片盡可能

36、少；細胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。以保證下一步的熒光染色處理不受影響。 第五十七頁，共六十六頁。流式細胞術描述防止防止(fngzh)(fngzh)細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法：細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法：1 1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2 2、乙醇與甲醇保存法：、乙醇與甲醇保存法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：細胞不具有生物活性，但 細胞表面熒光染色分析不受影響。細胞表面熒光染色分析不受影響。

37、( (四）單細胞懸液的保存四）單細胞懸液的保存(bocn)(bocn)第五十八頁，共六十六頁。流式細胞術描述 染料的選擇和標記染色保證了熒光染料的選擇和標記染色保證了熒光(ynggung)信號的產生信號的產生（一）免疫熒光標記最常用的熒光染料（一）免疫熒光標記最常用的熒光染料熒光熒光(ynggung)染料染料 激發波長（激發波長（nm) 發射波長（發射波長（nm) 顏色顏色FITC 488 525 深藍色PE(RDI) 488 575 橙色(chn s)ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633

38、 670 紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色第五十九頁，共六十六頁。流式細胞術描述 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在488nm波長激發光激發后產生的發射波長激發另一熒光波長激發光激發后產生的發射波長激發另一熒光(ynggung)染料產生的熒光信號。染料產生的熒光信號。LaserCY5PECY5CY5488nm能量能量(nngling)傳遞染傳遞染料：料：第六十頁，共六十六頁。流式細胞術描述熒光染料與細胞成分的結合方式：熒光染料與細胞成分的結合方式： 結構親和方式結構親和方式 嵌入嵌入(qin r)結合方式結合方式 共價結合方式共價結合方式 熒光抗體特異性結合方式熒光抗體特異性結合方式1、直接免疫熒光染色、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色、間接免疫熒光染色（二）免疫熒光標記（二）免疫熒光標記(bioj)第六十一頁，共六十六頁。流式細胞術描述3、雙或多參數熒光抗體、雙或多參數熒光抗體(kngt)的組合標記的組合標記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色綠色、橙色(chn s