1、不同類型細胞的培養特點第六章第六章 個別細胞和組織個別細胞和組織(zzh)的培養的培養第一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點類型：類型：正常正常(zhngchng)細胞培養細胞培養腫瘤細胞培養腫瘤細胞培養第二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第一節第一節 正常正常(zhngchng)細胞培養細胞培養v正常細胞，在體外培養時都正常細胞，在體外培養時都不易生長，建立不易生長，建立細胞系更難。細胞系更難。v正常細胞難培養的正常細胞難培養的原因原因(yunyn)是它們是分化的是它們是分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格細胞，對體外生存條件要求嚴格.v但只要一切條件適當仍有培養成功可能。但只要一切條件

2、適當仍有培養成功可能。第三頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點一、上皮細胞類培養一、上皮細胞類培養(piyng)v上皮細胞可來源于外、內、中三個胚層；上皮細胞可來源于外、內、中三個胚層；v培養中只有培養中只有(zhyu)源于外和內胚層的細胞能反映源于外和內胚層的細胞能反映出上皮細胞的特征，細胞呈膜狀生長的特點。出上皮細胞的特征，細胞呈膜狀生長的特點。第四頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v上皮細胞培養有三個難點：上皮細胞培養有三個難點：需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于利于(ly)細胞生長；細胞生長；需求特殊培養基；需求特殊培養基；與上皮細胞相鄰

3、的成纖維細胞常與上皮細胞與上皮細胞相鄰的成纖維細胞常與上皮細胞同時混雜生長，并常壓過上皮細胞。同時混雜生長，并常壓過上皮細胞。v純化和延長上皮細胞生存期純化和延長上皮細胞生存期是上皮細胞培養是上皮細胞培養的關鍵之一。的關鍵之一。第五頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(一一)表皮細胞培養表皮細胞培養1特點特點：v在有膠原的底物上易生長在有膠原的底物上易生長；v把人或小鼠表皮細胞培養在以把人或小鼠表皮細胞培養在以3T3 細胞為飼養細胞為飼養(syng)層層(用射線照射后用射線照射后)上上時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。v降低降低pH、Ca2+的

4、含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。的含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。v向培養基中加氫化可的松向培養基中加氫化可的松(10 g/m1)、10-6M的異丙基腎上腺素的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和和10 ng/m1 促表皮生長因子促表皮生長因子(EGF) 能促表皮能促表皮細胞生長。細胞生長。第六頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v【飼細胞】【飼細胞】飼細胞飼細胞(Feeder Cells)也稱滋養細也稱滋養細胞，是一層經過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、胞，是一層經過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細胞附著底物的細胞層。用作克隆細胞附著底物的細胞層。v飼細胞作用：飼細胞作

5、用：v有同化有同化(tnghu)營養液的能力營養液的能力。v飼細胞能促克隆細胞的生長，利于克隆的形成飼細胞能促克隆細胞的生長，利于克隆的形成。克。克隆形成后飼細胞漸死亡，換液時清除。隆形成后飼細胞漸死亡，換液時清除。第七頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點飼細胞的制備：飼細胞的制備：(1)取原代培養的取原代培養的人或動物胚胎成纖維細胞人或動物胚胎成纖維細胞，90% 匯合時匯合時制成細胞懸液，再按制成細胞懸液，再按103 細胞細胞/毫升重新接種培養；毫升重新接種培養；(2)在細胞半匯合時，準備在細胞半匯合時，準備0.25g/ml 的絲裂霉素，按的絲裂霉素，按2ug/105 細胞的量加入到培養瓶中

6、過夜；或用射線單次照細胞的量加入到培養瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量射，劑量3050 戈瑞戈瑞(Gy)；(3)細胞經上述處理后，細胞經上述處理后，Hanks 液漂洗兩次、更換培養液、液漂洗兩次、更換培養液、再培養再培養24 小時小時(xiosh)，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按5104/ml接種入新培養基中；接種入新培養基中；(4)48 小時后，即可用于細胞克隆之用。小時后，即可用于細胞克隆之用。第八頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點2表皮細胞培養程序：表皮細胞培養程序：(1) 取材取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產：取外科植皮或手術殘余

7、皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(zochn)流產兒皮膚更好，切成流產兒皮膚更好，切成0.5 1cm2小塊；小塊；(2) EDTA 處理處理：先置入：先置入0.02 EDTA 中室溫置中室溫置5 分鐘。分鐘。(3) 冷消化冷消化：換入：換入0.25% 胰蛋白酶中，置胰蛋白酶中，置4過夜；過夜；(4) 分離：分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；第九頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(5) 溫消化：溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25胰蛋白酶中，胰蛋白酶中，37再

8、消化再消化30 60 分鐘；分鐘；(6)制細胞懸液：制細胞懸液：用吸管輕輕反復吹打，使成細胞懸液；用吸管輕輕反復吹打，使成細胞懸液；(7) 加培養液：加培養液：通過通過80 目不銹鋼紗網濾過后，低速離心目不銹鋼紗網濾過后，低速離心(lxn)，吸上，吸上清，直接加入清，直接加入Eagle 液和液和20小牛血清小牛血清.(8)培養：培養：接種入碟皿中，接種入碟皿中，CO2 溫箱培養。溫箱培養。第十頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v注意事項：注意事項：冷消化目的在于使表皮和真皮結合冷消化目的在于使表皮和真皮結合松散；松散；如冷消化后分離如冷消化后分離(fnl)下來的表皮膜自身也下來的表皮膜自身也

9、已松散，此時亦可直接置入已松散，此時亦可直接置入PBS 中用吸管吹中用吸管吹打制備細胞懸液；不再經過第二次消化。打制備細胞懸液；不再經過第二次消化。第十一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(二二) 胃上皮細胞培養胃上皮細胞培養(piyng)v適于胃上皮細胞生長的條件是：適于胃上皮細胞生長的條件是：膠原酶和透明質酸酶消化法并用消化細胞；膠原酶和透明質酸酶消化法并用消化細胞；應用膠原底物培養應用膠原底物培養(piyng)；制備含有特定成分的培養基；制備含有特定成分的培養基；第十二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v培養程序：培養程序：(1) 取材取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端：取胃潰瘍

10、或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區非病變區粘膜少許；粘膜少許；(2) 清洗清洗：用含慶大霉素：用含慶大霉素(400g/m1)和兩性霉素和兩性霉素(2g/m1 的的Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm大小；大??；(3) 消化消化：在：在I 型膠原酶型膠原酶和和透明質酸酶透明質酸酶中，于中，于37中消化中消化80 分鐘；分鐘；(4) 離心離心：收集細胞：收集細胞(xbo)懸液，懸液，800 轉轉/分離心后，分離心后，Hanks 液漂洗兩次；液漂洗兩次；第十三頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(5) 接種接種：末次離心后加入含有：末次離心后加入含有1 2

11、胎牛胎牛血清血清(xuqng)的完全培養基的完全培養基，接種入不同孔數的，接種入不同孔數的培養板中；接種量依不同實驗目的而定。培養板中；接種量依不同實驗目的而定。v細胞接種后一般在細胞接種后一般在16 小時內貼壁，細胞呈多小時內貼壁，細胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯接成角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯接成片。初代培養可維持片。初代培養可維持2 3 周，第一周末達周，第一周末達高峰，最后逐漸衰退剝落。高峰，最后逐漸衰退剝落。第十四頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(三三) 肝細胞培養肝細胞培養(piyng)v肝臟具有取材方便肝臟具有取材方便(fngbin)和易于生長的優點，和易于生

12、長的優點，能獲得典型上皮細胞培養。能獲得典型上皮細胞培養。1初代組織塊培養：初代組織塊培養：v肝組織做組織塊培養效果很好。取新鮮肝臟，肝組織做組織塊培養效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成把肝剪成1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養左右的小塊，采用貼壁培養法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日法。肝組織易于貼壁，生長力好，一般次日即可出現生長暈。即可出現生長暈。第十五頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點2初代消化法培養：初代消化法培養：(1) 把肝組織切成把肝組織切成2 4 立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的立方毫米的小塊，用不合鈣

13、鎂的BSS 液液洗兩次；洗兩次；(2) 移入移入1:1 的的0.1胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.1膠原酶膠原酶(都用無鈣鎂都用無鈣鎂BSS 配制配制) 中，中，4冷消化冷消化10 12 小時后，通過小時后，通過250 微米和微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過(用紗布濾過亦可用紗布濾過亦可)；(3) 收集細胞收集細胞(xbo)、BSS 液洗液洗1 2 次、計數、接種培養；次、計數、接種培養；第十六頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點3肝臟灌流法：肝臟灌流法：v需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。(1) 無菌解剖動物，取出肝臟，先用無菌

14、解剖動物，取出肝臟，先用BSS 洗除血污；洗除血污；(2) 取取5ml 注射器一支注射器一支(y zh)，吸取消化液后，把，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝注射器頭輕輕插入肝管中管中，用線繩結扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統，用線繩結扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統，并不時輕柔壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中；并不時輕柔壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中； 消化液在肝內停留消化液在肝內停留20 30 分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出；以使肝細胞脫落和消化液吸出；第十七頁，共七十頁。不同類型細胞的培

15、養特點(3) 待吸凈消化液后，注入待吸凈消化液后，注入(zh r)離心管中，低離心管中，低速離心分離，用速離心分離，用RPMI 1640 培養基培養培養基培養(較較其它培養基為好其它培養基為好)，能獲得較純的肝上皮細，能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。胞和獲較好的效果。第十八頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(四四) 內皮細胞培養內皮細胞培養(piyng)v應用材料：應用材料：人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，人臍帶臍靜脈、動物大動脈等，用灌流消化用灌流消化(xiohu)法獲取細胞最為簡便。法獲取細胞最為簡便。第十九頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(1)取產后的新鮮臍帶；如不立即培養取產后

16、的新鮮臍帶；如不立即培養(piyng)可可保存于保存于4中，但不宜超過中，但不宜超過12 小時；小時；無菌無菌剪取長剪取長10 15 厘米一段厘米一段。 其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養；于培養；(2) 先用三通注射器吸先用三通注射器吸溫溫PBS 液注入臍帶的臍液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線繩結；注入口處宜用線繩結扎，以防液體返流；扎，以防液體返流；第二十頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為徐徐注入最終濃度為0.1的

17、膠原酶的膠原酶，待末端，待末端出現液體后結扎之，令充滿血管，注入口亦應出現液體后結扎之，令充滿血管，注入口亦應結扎，以防液體返流，結扎，以防液體返流，消化消化3 10 分鐘分鐘；(4) 吸出含有內皮細胞的消化液，注入離心管中吸出含有內皮細胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細胞，可再注入溫為獲取更多細胞，可再注入溫PBS 沖洗沖洗2 3 次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中離心；離心；(5) 吸除上清，加吸除上清，加1640 培養培養(piyng)液，制成細胞液，制成細胞懸液，接種入瓶皿中培養懸液，接種入瓶皿中培養(piyng)，順利時，順利時2 3

18、 天內細胞即可長成單層。天內細胞即可長成單層。第二十一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第二十二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v人臍帶易于獲得，培養效果好；細胞生長后，人臍帶易于獲得，培養效果好；細胞生長后，一般傳一般傳6 7 代后即衰退，難以長期維持。用代后即衰退，難以長期維持。用兔血管內皮細胞培養較好，可傳兔血管內皮細胞培養較好，可傳10 30 代；代；v不同不同(b tn)部位血管內皮細胞生物學性狀不同部位血管內皮細胞生物學性狀不同(b tn)，對各種作用因素反應亦有很大差別。，對各種作用因素反應亦有很大差別。第二十三頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(五五) 毛細血管毛細血管

19、(mo x xu un)內皮細胞培養內皮細胞培養v毛細血管毛細血管(mo x xu un)細小，結構簡單，內皮細胞細小，結構簡單，內皮細胞外有較多的結締組織，進行分離培養有很大外有較多的結締組織，進行分離培養有很大困難。困難。v近年毛細血管培養已獲成功；近年毛細血管培養已獲成功；v利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織組織(如卵巢癌如卵巢癌) 等均可；等均可；第二十四頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點1材料材料(cilio)：v腫瘤條件培養基制備腫瘤條件培養基制備(1) 取取C3H 小鼠的小鼠的S-180 實體肉瘤組織實體肉瘤組織；(2) 胰蛋白酶消

20、化胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良改良Eagle 氏氏培養液培養液15m1 (含含10小牛血清小牛血清) 種到培養瓶種到培養瓶中培養；中培養；第二十五頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(3) 在細胞生長接近完全匯合時，收集培養液制成條件在細胞生長接近完全匯合時，收集培養液制成條件(tiojin)培養基；再培養基；再用含用含10小牛血清的新培養液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條小牛血清的新培養液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件件(tiojin)培養基；培養基；(4) 4000 轉分離心后，再通過轉分離心后，再通過0.22m 微孔濾膜濾過，微孔濾膜濾過，-20凍存備凍存備用用(臨用前融

21、解臨用前融解)。v凝膠底層制備凝膠底層制備(1) 取取60 mm Falcon 產培養皿，加產培養皿，加1% Difco 產明膠產明膠(用不合鈣和鎂的用不合鈣和鎂的Hanks 液配制液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2) 置置4過夜；用前再用少許培養液沖洗一次。過夜；用前再用少許培養液沖洗一次。第二十六頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點2初代培養初代培養(1) 取材取材：取新鮮牛腎上腺數個，先用：取新鮮牛腎上腺數個，先用Hanks 液液洗除血污；洗除血污；(2) 消化：消化：剝除被膜，分離出皮質剝除被膜，分離出皮質(pzh)，切成，切成l mm3 小塊，加小塊，加0.5膠

22、原酶室溫中消化膠原酶室溫中消化1 小時；小時；每隔每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；(3)過濾：過濾：通過不銹鋼紗網濾過，網眼要求只允通過不銹鋼紗網濾過，網眼要求只允許能通過小于許能通過小于110 微米長的毛細血管小段；微米長的毛細血管小段；(4)離心：離心：650 rpm，4，離心，離心7 分鐘后，棄掉分鐘后，棄掉上清膠原酶；上清膠原酶；第二十七頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(5)再離心：再離心：沉淀物用培養液重懸并離心，再重懸，再離心，沉淀物用培養液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；共兩次；(6) 制細胞懸液：制細胞懸液：末次沉淀物仍用含末次沉淀

23、物仍用含10小牛血清的小牛血清的Dulbecco 改良改良Eag1e 氏培養液重懸后，稍吹打；氏培養液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種：接種入鋪有明膠底層的培養皿中，接種入鋪有明膠底層的培養皿中，37培養；在培養；在培養頭培養頭1 3 小時中，毛細血管小段和內皮細胞最先貼附小時中，毛細血管小段和內皮細胞最先貼附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂?。桓?；(8)換液：換液：吸除培養液，再吸除培養液，再加入加入(jir)腫瘤條件培養液腫瘤條件培養液；每兩；每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自天換液一次。毛細血管小段一般成自1 4 個內

24、皮細胞，個內皮細胞，v以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島，能持續以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島，能持續2 5 天。天。第二十八頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點3毛細血管內皮細胞分離培養：毛細血管內皮細胞分離培養：(1) 初代培養初代培養2 3 天后，鏡下確認幾個毛細血天后，鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島，在培養皿背面，用不脫色筆劃管內皮細胞島，在培養皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；圈圈起；(2) 鏡下檢查，如圈內殘有非內皮細胞時，可用鏡下檢查，如圈內殘有非內皮細胞時，可用顯微顯微(xin wi)細針在倒置顯微細針在倒置顯微(xin wi)鏡下挑除；用鏡下挑除；用細胞解剖

25、器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打細胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養皿蓋進行，但時間不宜過長開培養皿蓋進行，但時間不宜過長(15 20 分分鐘鐘)；圈外非內皮細胞可用無菌膠刮刮除；圈外非內皮細胞可用無菌膠刮刮除；第二十九頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(3) 用培養液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；用培養液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；(4) 剩余內皮細胞島如小剩余內皮細胞島如小(5 20 個細胞個細胞) 而少時，生長增殖而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入常變得緩慢或完全不生長，此時需加入(jir)3T3等飼細胞；等飼細胞；飼細胞接種量為飼細胞接種量為4000 細胞細胞cm

26、2；(5) 當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基；心、加入腫瘤條件培養基；(6) 接種入明膠底物皿中繼續培養接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡被淘汰飼細胞死亡被淘汰)，細胞增，細胞增殖生長匯合后，按殖生長匯合后，按1:5 傳代。傳代。第三十頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第三十一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點二、結締組織二、結締組織(jid-zzh)類細胞培養類細胞培養(一一) 成纖維細胞培養成纖維細胞培養v包括人在內的各種成纖維細胞都很容易包括人在內的各種成纖維細胞都很容易(rngy)培養，也

27、是其它組織培養時的副產物，極易培養，也是其它組織培養時的副產物，極易獲得。獲得。v用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消去頭和內臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養；如為人胚，可取皮膚培養。幼兒化法培養；如為人胚，可取皮膚培養。幼兒包皮是培養成纖維細胞的很好對象。包皮是培養成纖維細胞的很好對象。第三十二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點小鼠成纖維細胞培養(piyng)條件v12.514.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；v最佳培養基為最佳培養基為DMEM添加添加15%小牛血清；小牛血清

28、；v第第3代細胞增殖最旺盛；代細胞增殖最旺盛；v室溫條件室溫條件(tiojin)下，下，0.125%胰蛋白酶消化時間胰蛋白酶消化時間以以810min為宜。為宜。v在培養在培養ES細胞時，應選擇第細胞時，應選擇第35代的小鼠成代的小鼠成纖維細胞作為飼養層細胞。纖維細胞作為飼養層細胞。第三十三頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點小鼠成纖維細胞小鼠成纖維細胞(xbo)；細胞細胞(xbo)來源：來源：swiss小鼠胚胎小鼠胚胎 第三十四頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第三十五頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(二二) 巨噬細胞培養巨噬細胞培養v巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、巨噬

29、細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。細胞免疫和分子免疫學的重要對象。v巨噬細胞容易獲得，便于巨噬細胞容易獲得，便于(biny)培養，并可進行純化。但屬培養，并可進行純化。但屬不繁殖型細胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活不繁殖型細胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活2 3周，因之多用作初代培養周，因之多用作初代培養。v巨噬細胞也能建成無限細胞系；大多來自小鼠，如巨噬細胞也能建成無限細胞系；大多來自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr. 1 等。等。第三十六頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點1培養技術培養技術(jsh)要點：要點：

30、v來源和取材來源和取材 巨噬細胞可來源于人胸水、腹巨噬細胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。水、血和透析液等材料。v實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用其中以從動物腹腔取材最常用。用40g 的的PHA 注入腹腔中，能產生注入腹腔中，能產生6 8106 個細個細胞，而且無刺激性，效果較好。胞，而且無刺激性，效果較好。第三十七頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點2培養方法：培養方法：v培養巨噬細胞可用各種方法和各種來源獲取細胞，其中以培養巨噬細胞可用各種方法和各種來源獲取細胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不

31、同外，培養小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養方法大同小異。方法大同小異。v程序程序(1) 實驗前三天，向每只小鼠腹腔內注入無菌硫基乙酸肉實驗前三天，向每只小鼠腹腔內注入無菌硫基乙酸肉湯湯1ml (勿注入腸內勿注入腸內)；(2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70酒精中酒精中3 5 秒；秒；(3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定置動物于解剖臺上，用針頭固定(gdng)四肢，雙手持鑷撕開皮四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4) 再用再用70酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸酒精擦洗腹膜壁后

32、，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動；在腹腔內充分流動；第三十八頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內；中液體集于針頭下吸取入針管內；(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4)離心離心10 分分鐘后，去上清，加鐘后，去上清，加10 ml Eagle 培養基；培養基；(7) 計數細胞，每只小鼠可產生計數細胞，每只小鼠可產生

33、20 30106 細胞，其細胞，其中中90為巨噬細胞；為巨噬細胞；(8) 為獲取為獲取3105 個貼附細胞平方厘米，需接種個貼附細胞平方厘米，需接種2.5106m1；(9) 為純化培養為純化培養(piyng)細胞，去除其它白細胞，接種數小細胞，去除其它白細胞，接種數小時后，去除培養時后，去除培養(piyng)液，用液，用Eagle 液沖洗液沖洗1 2 次后，次后，再加新再加新Eagle 培養培養(piyng)液置液置37 CO2 溫箱中培養。溫箱中培養。第三十九頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第四十頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點三、肌組織三、肌組織(zzh)細胞培養細胞培養v以心肌和

34、骨骼肌培養較為實用。以心肌和骨骼肌培養較為實用。(一一) 骨骼肌細胞培養骨骼肌細胞培養v動物胚或幼體的動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養材料大腿肌組織為最好的培養材料。取材常。取材常用生后用生后1 2 天的乳鼠天的乳鼠(Wistar 大鼠更好大鼠更好)。(1) 取材取材：殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3 0.5 厘米厘米小塊；小塊；(2)消化消化：用不含鈣鎂離子的用不含鈣鎂離子的Hanks 液配的液配的0.25胰蛋白胰蛋白酶酶(y dn bi mi)消化，無菌紗網或紗布濾過，合成培養基消化，無菌紗網或紗布濾過，合成培養基加加10小牛小牛(或馬或馬)血清培

35、養，血清培養，為促進分化可加為促進分化可加1 的胎汁；的胎汁；第四十一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(3)接種：接種：細胞接種量為細胞接種量為2106/皿；接種在膠原或明膠的底皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細胞分化。物上能促進細胞分化。v明膠制備比較簡單，常用明膠制備比較簡單，常用Hanks 液配的液配的0.01明膠。明膠。v生長特點：生長特點：細胞生長開始呈紡錘形，培養細胞生長開始呈紡錘形，培養50 52 小時后小時后將出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此將出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時能觀察時能觀察(gunch)到橫紋。一般在融合后二三天內能見到收

36、到橫紋。一般在融合后二三天內能見到收縮現象；因收縮運動有時可導致細胞從底物脫離?？s現象；因收縮運動有時可導致細胞從底物脫離。第四十二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(二) 心肌細胞培養(piyng)v最常用材料：最常用材料：v雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應用可應用。v心肌是比較容易培養和生長心肌是比較容易培養和生長(shngzhng)的組織，的組織，可應用多種方法進行培養，如可應用多種方法進行培養，如懸滴培養、組懸滴培養、組織塊培養和消化培養法織塊培養和消化培養法等，主要取等，主要取心室肌心室肌培培養，均能獲得良好的生長效果。養，均能獲得良

37、好的生長效果。第四十三頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v程序程序(1) 選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(f y)(溫箱中放有水槽，以維持溫箱中放有水槽，以維持箱內濕度箱內濕度)；每日翻動一次；每日翻動一次(180 度度)，孵育，孵育(f y)9 12 天；天；(2) 取雞胎；取雞胎；(3) 用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用用眼科剪剪開胸腔，剝出心臟，置入皿中用Hanks 液漂洗液漂洗1 2 次；次；(4) 小心剪除大的動靜脈，保留心室??；用小心剪除大的動靜脈，保留心室肌；用組織塊或消化培養法均可組織塊或消化培養法均可。初代培養的雞胚心肌呈紡錘形，初代培養的雞

38、胚心肌呈紡錘形，v純化及生長特點：純化及生長特點：常雜有成纖維細胞和內皮細胞；常雜有成纖維細胞和內皮細胞；心肌細胞亦較其它心肌細胞亦較其它成分貼壁慢，可反復貼壁法排除其它細胞成分。在培養成功時，相成分貼壁慢，可反復貼壁法排除其它細胞成分。在培養成功時，相差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現節律性收縮現象。差顯微鏡下可觀察到橫紋；一周后便可出現節律性收縮現象。第四十四頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點乳鼠心肌細胞原代培養乳鼠心肌細胞原代培養(piyng)第四十五頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第四十六頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點四、神經組織細胞培養四、神經組織細胞培養v神經組織主

39、要由兩種神經細胞神經組織主要由兩種神經細胞(xbo)(神經元和神經膠質神經元和神經膠質細胞細胞(xbo)）組成。）組成。v神經元為高度分化的細胞，在組織發生晚期已失掉增殖神經元為高度分化的細胞，在組織發生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經生長因子接種在膠原底層上，或在加入神經生長因子(NGF) 和膠質細胞因子時，才能生存，并可能出現一定和膠質細胞因子時，才能生存，并可能出現一定程度的分化現象，如長出突起等，但卻難使之增程度的分化現象，如長出突起等，但卻難使之增殖；殖；即使培養胚胎組織情況也是如此。

40、即使培養胚胎組織情況也是如此。第四十七頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v神經膠質細胞為較易培養成分，它分少突、星神經膠質細胞為較易培養成分，它分少突、星形和小膠質三種形和小膠質三種。神經膠質細胞與神經元有共神經膠質細胞與神經元有共存存(gngcn)關系。關系。第四十八頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點人腦膠質瘤細胞人腦膠質瘤細胞(xbo)第四十九頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點大鼠大鼠c6膠質細胞膠質細胞(xbo)第五十頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第五十一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點v(一一) 初代培養初代培養 神經元能發生一定分化現象，如生長突起，但神經元能發生一定

41、分化現象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經膠質尤因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經膠質尤以星形細胞能繼續以星形細胞能繼續(jx)生存和分裂增殖。生存和分裂增殖。v(二二) 傳代培養傳代培養 神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。不僅能獲得生長的膠質細胞并可形成能傳分。不僅能獲得生長的膠質細胞并可形成能傳代的二倍體細胞系。代的二倍體細胞系。第五十二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(三三) 培養方法培養方法v人腦組織可用于神經膠質細胞培養，培養組織來自手術人腦組織可用于神經膠質細胞培養，培養組織來自手術室無菌取腦髓灰質或白質均可用于

42、培養，室無菌取腦髓灰質或白質均可用于培養，1程序：程序：(1) 細胞懸液制備細胞懸液制備(zhbi)：獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入血管等纖維成分，置入Hanks 液中漂洗液中漂洗1 2 次后，置于次后，置于30 50倍的倍的Hanks 液中；腦組織比較柔軟，反復吹打即液中；腦組織比較柔軟，反復吹打即可制備成細胞懸液；可制備成細胞懸液；(2) 排除脂肪成分和其它碎塊排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在：把懸液注入離心管中，在室溫直立室溫直立5 10 分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液

43、表層，吸除上清，如此反復脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復二三次可獲較多的細胞成分；二三次可獲較多的細胞成分；第五十三頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點(3)濾過、計數、接種：濾過、計數、接種：向末次沉降物中加入適向末次沉降物中加入適量營養液，通過紗網或紗布濾過，計數細胞量營養液，通過紗網或紗布濾過，計數細胞并調整好細胞密度，接種入培養瓶或皿中，并調整好細胞密度，接種入培養瓶或皿中，置置5C02 溫箱中培養；溫箱中培養；(4)傳代：傳代：細胞生長匯合后，可用細胞生長匯合后，可用0.25胰蛋白胰蛋白酶消化酶消化(xiohu)法做傳代處理。法做傳代處理。第五十四頁，共七十頁。不同類型

44、細胞的培養特點2生長特點：生長特點：v接種后初期，細胞可能接種后初期，細胞可能(knng)出現飄浮不貼壁出現飄浮不貼壁現象，貼壁后在短期內也可能現象，貼壁后在短期內也可能(knng)不見細胞不見細胞分裂現象；細胞適應環境過程較長，然而一分裂現象；細胞適應環境過程較長，然而一旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態。旦生長后，即能進入較旺盛的增殖狀態。v生長開始常雜有巨噬細胞、成纖維細胞和上生長開始常雜有巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，皮細胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質細胞，一般形成連逐漸形成均一的星形膠質細胞，一般形成連接不甚緊密的單層細胞

45、接不甚緊密的單層細胞第五十五頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點第二節第二節 腫瘤腫瘤(zhngli)細胞培養細胞培養v腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置，首腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養的細胞，當前先癌細胞是比較容易培養的細胞，當前(dngqin)建立的細胞系中癌細胞系是最多的。建立的細胞系中癌細胞系是最多的。v腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。癌分子生物學極其重要的手段。第五十六頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點培養方法培養方法v腫瘤細胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、腫瘤細

46、胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜選用適宜(shy)的培養液和培養底物等幾個方面。的培養液和培養底物等幾個方面。v初代培養應用組織塊和消化培養法均可。初代培養應用組織塊和消化培養法均可。一、要點一、要點1取材：取材：v人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材時盡量避免人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材時盡量避免用退變組織，要用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。或胸腹水是好的培養材料。第五十七頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點2培養基：培養基：v腫瘤細胞對培養基的要求不如正常腫瘤細胞對培養基的要求不如

47、正常(zhngchng)細胞嚴格，細胞嚴格，一般常用的一般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Coy5A 等培養等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常比正常(zhngchng)細胞低，正常細胞低，正常(zhngchng)細胞培養不加血細胞培養不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大。腫瘤細胞對培養環境適應性較大。v培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。第五十八頁，共七十頁。不同

48、類型細胞的培養特點3成纖維細胞的排除：成纖維細胞的排除：v成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且難以純化腫瘤細胞。而且(r qi)成纖維細胞常成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。培養中的關鍵。第五十九頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點成纖維細胞排除法1機械刮除法：機械刮除法：v是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲絲)，

49、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用也可用特制電熱燒灼器刮除特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為：。刮除程序為：(1) 標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位部位(bwi)；(2) 刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；窺視下，刮除無標記空間；(3) 用用Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；(5) 注入培養液繼續培養，如發現

50、仍有成纖維細胞殘留，可重復刮注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。除至完全除掉為止。第六十頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點2反復貼壁法：反復貼壁法：v根據腫瘤細胞根據腫瘤細胞(xbo)比成纖維細胞比成纖維細胞(xbo)貼壁速度慢的特點，貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液，并結合使用不加血清的營養液， (1) 細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗沖洗2 次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；懸液；(2) 編號為編號為A、B、C

51、 三個培養瓶；首先把懸液接種入三個培養瓶；首先把懸液接種入A 培培養瓶中，置溫箱中靜止培養養瓶中，置溫箱中靜止培養520 分鐘后，輕輕傾斜培分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入入B 培養瓶中后；向培養瓶中后；向A 瓶中補充少許完全培養液置溫箱瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；中繼續培養；(3) B瓶中細胞瓶中細胞520 分鐘后，按處理分鐘后，按處理A 的方法，把培養液注的方法，把培養液注入入C 培養瓶中；再向培養瓶中；再向B 瓶中補加完全培養基。瓶中補加完全培養基。第六十一頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點

52、v當三個瓶內都含有培養當三個瓶內都含有培養(piyng)液后，均在溫箱液后，均在溫箱中繼續培養中繼續培養(piyng)。如操作成功，次日觀察可。如操作成功，次日觀察可見見A 瓶主要為成纖維細胞，瓶主要為成纖維細胞，B 瓶兩類細胞相瓶兩類細胞相雜，雜，C 瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。處理多次，直至癌細胞純化為止。第六十二頁，共七十頁。不同類型細胞的培養特點3消化排除法：消化排除法：(1) 先是用先是用0.5胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.02EDTA (1:1) 混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來后，不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來后，便立即停止消化；便立即停止消化；(2) 把消化液吸入離心管中