1、金銀花中總黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化1 引言金銀花為忍冬科多年生半常綠纏繞植物忍冬（LonicerajaponicaThumb.）、紅腺忍冬（L.hypoglaucamiq）、山銀花（L.con-fusaDC）或毛花柱忍冬（L.dasystylaRehd）的干燥花蕾或帶初開的花1，2。金銀花為臨床常用中藥，具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱之功效，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)勢等35。而黃酮類化合物是金銀花的主要成分6。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有降低心肌耗氧量，使冠脈、腦血管流量增加、抗心律失常、軟化血管、降血糖、血脂等作用7，8。本文采用超聲波提取法對金銀花中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)

2、行提取，通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，研究金銀花中總黃酮的最佳提取工藝，為金銀花中有效成分的提取提供理論基礎(chǔ)。2 材料與方法2.1 主要儀器和設(shè)備UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；FA1104N型電子天平（上海菁海）；FW-135型中草藥粉碎機(jī)（上海超億）；TG20-W例離心機(jī)（鄭州宏朗）；HN-1000D型超聲波萃取儀（上海汗諾）；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特）；60目的篩子。2.2 主要材料和試劑金銀花（四川達(dá)州產(chǎn)）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海試劑二廠）；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。2.3 試驗(yàn)方法2.3.1 對照品溶液的制備準(zhǔn)

3、確稱取經(jīng)干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg,用適量體積分?jǐn)?shù)為30%勺乙醇充分溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇定容至刻度，搖勻做對照品儲備試液。此試液中蘆丁的濃度為0.2mg/mL。2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精確移取蘆丁對照品溶液0、10、20、40、60、80、100mL于7個25mL容量瓶中，分別向其中首先加入30濃醇溶液至約125mL再加入5%勺NaNO冰溶液07mL搖勻，放置6min,力口入10%勺Al（NO33水溶液07mL搖勻，放置6min,后加入1mol-L-1的NaOHtK溶液5mL混勻，最后用30%勺乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min。以第1瓶作空白

4、對照，在最大吸收波長510nm處測定吸光度，用最小二乘法得線性回歸方程911。233樣品中總黃酮的提取及測定將金銀花于40下恒溫干燥24h后，冷卻至室溫，然后用粉碎機(jī)粉碎（過60目篩）。準(zhǔn)確稱取05g金銀花粉末，加入適量的30%乙醇進(jìn)行超聲提取，將提取液離心，取上層清液于25mL容量瓶中，重復(fù)多次，用30%乙醇定容至刻度，再精確移取其溶液5mL于25mL容量瓶中，按232章節(jié)中所述方法處理并測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液濃度，再按下式計(jì)算總黃酮提取率12。黃酮提取率（%=CXV0XV1V2IW100其中：C表示標(biāo)準(zhǔn)曲線線形方程得提取液樣品的總黃酮的濃度（g/L1）;V0表示提取液定容后的

5、體積（L）;V1表示量取提取液樣品測定定容的體積（L）；V2表示量取提取液樣品測定的體積（L）；I表示所稱取的金銀花的質(zhì)量（g）。2.3.4 金銀花總黃酮提取單因素試驗(yàn)精確稱取金銀花粉末05g,利用超聲波法進(jìn)行提取，離心分離后，測定其吸光度，得到金銀花中總黃酮的提取率。試驗(yàn)中通過調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間、料液比和超聲頻率等因素來分析不同因素對總黃酮提取效率的影響1316o2.3.5 金銀花總黃酮提取正交試驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用超聲功率900W固定的情況下，對其余4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，L9（34）即三水平四因素模式。其中4個因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）

6、和超聲時間（D）。以總黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平見表1。2.3.6工藝驗(yàn)證試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取0.5g金銀花粉末，依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果的最佳工藝條件，按本文的研究方法，提取金銀花中的總黃酮，平行實(shí)驗(yàn)次，測定其吸光度，求得金銀花中總黃酮的提取率。3結(jié)果與討論3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制由圖1可知，用最小二乘法得線性回歸方程，吸光度與金銀花質(zhì)量濃度之間的關(guān)系為：Y=12307X+00035，r=09999。3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響精確稱取金銀花粉末5份各0.5g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為20、40、60、80、100%的乙醇溶液10mL，在40和超聲功率為

7、1000W的情況下超聲浸提2.0h。從而得到總黃酮提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%-60荻間，總黃酮的提取率隨乙醇濃度增大而增大，并在60%時達(dá)到最大值7.4%，之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率反而減少。這可能是由于乙醇濃度增大，醇溶性物質(zhì)競爭溶解，限制了某些黃酮類物質(zhì)的溶出。3.2.2超聲溫度對總黃酮提取率的影響精確稱取金銀花粉末6份各0.5g,分別加入10mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，分別在25、35、45、55、65、75的條件下，在1000W的超聲功率下超聲2.0ho從而得到總黃酮提取率與超聲溫度的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示?？傸S酮的提取率在55時達(dá)到最大值為7

8、.6%，溫度過低不利于總黃酮的浸出，提取率較低，較高的超聲溫度能促進(jìn)分子的熱運(yùn)動，使溶劑和提取物之間的交換速度加快，這樣更有利于增加總黃酮的浸出。但是溫度過高黃酮不穩(wěn)定，會使黃酮部分分解而被破壞，導(dǎo)致提取率降低。3.2.3超聲時間對總黃酮提取率的影響精確稱取金銀花粉末6份各0.5g,分別加入10mL體積分?jǐn)?shù)為60%勺乙醇，并在55c和1000W勺超聲功率下分別超聲0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。超聲時間對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖4。隨著超聲時間的增加，提取率不斷增加，在2.0h時總黃酮提取率達(dá)到最大值7.5%，之后再增加超聲時間并沒有得到較高的提取率。提取時間短總黃酮不能有

9、效溶出，時間過長，其他組分可能大量溶出，同時黃酮長期置于55下，穩(wěn)定性較低的黃酮類物質(zhì)會被部分氧化或分解，反而影響提取效率。3.2.4料液比對總黃酮提取率的影響精確稱取金銀花粉末6份各05g,選取料液比1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%超聲溫度55c和1000Wg聲功率下分別超聲20ho從而得到總黃酮提取率與料液比的關(guān)系。結(jié)果如圖5所示。在用溶劑提取時，適當(dāng)加大料液比，可將更多的被提取物質(zhì)提取出來。料液比較小時，總黃酮提取不充分，隨著料液比的不斷增大，總黃酮有效成分的提取率不斷增加，但當(dāng)料液比超過1：20g/mL時，黃酮的提取率基本趨于穩(wěn)定，

10、提取率最大值為7.8%3.2.5超聲功率對總黃酮提取率的影響精確稱取金銀花粉末6份各0.5g，選取300、500、700、900、1100W的超聲功率進(jìn)行操作。料液比1：20g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%和超聲溫度55下分別超聲2.0h。超聲功率對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖6。隨著超聲功率的增加，其總黃酮的提取率不斷增加，但當(dāng)超聲功率達(dá)到900W處后提取量趨于穩(wěn)定。再增加功率對總黃酮的提取量影響不大。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮其最佳的提取功率取900W為宜，其提取率最大值為7.7%。3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析利用超聲波法提取金銀花中總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。當(dāng)以總黃酮的提取率為評價(jià)指標(biāo)時，從上表分析可知：各因素影響總黃酮提取率的主次順序?yàn)镃>B>A>D即料液比、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次是超聲時間，所以料液比是影響金銀花中總黃酮提取量的主要因素。最佳提取工藝為A3B1C3D2即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%超聲溫度為50C,料液比為1：25(g/mL),超聲時間為2.0h，在此條件下，總黃酮的提取率為8.52%。3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析按試驗(yàn)確定的最佳提取工藝分別提取，其結(jié)果見表3。由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，在最佳試驗(yàn)工藝條件下，用超聲波提取法，提取金銀花中的總黃酮，平行試驗(yàn)3 次，可得總黃酮