1、?植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)?教案主講：陳發(fā)菊李曉玲易飛一、本課程的性質(zhì)、地位和作用植物組織培養(yǎng)是以植物細(xì)胞、組織、器官為研究對(duì)象，運(yùn)用工程學(xué)原理，利用人工培養(yǎng) 基按照預(yù)定目標(biāo)，對(duì)植物的器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，改變生物性狀，生產(chǎn)生 物產(chǎn)品，為人類生產(chǎn)和生活效勞的一門綜合性技術(shù)科學(xué)， 也是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)之一。 在植物的優(yōu)良品種快速繁殖、 脫毒苗木生產(chǎn)、 縮短育種進(jìn)程、 種質(zhì)資源保存等方面具有其它 技術(shù)無(wú)法比較的優(yōu)勢(shì)。它的主要研究?jī)?nèi)容是研究在無(wú)菌及離體條件下，細(xì)胞、組織、器官所需營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境 條件；細(xì)胞、組織、器官的形態(tài)發(fā)育規(guī)律，植物材料的快速大量繁殖方法；原生質(zhì)體融合方 法與機(jī)理；

2、 再生個(gè)體的遺傳變異； 種質(zhì)資源的離體保存機(jī)理與方法； 通過(guò)植物細(xì)胞工程實(shí)現(xiàn) 對(duì)動(dòng)植物的遺傳改造 , 創(chuàng)造新的生物種質(zhì) , 為人類造福。二、教學(xué)目的及要求 了解植物組織培養(yǎng)的開(kāi)展概況、開(kāi)展現(xiàn)狀、未來(lái)開(kāi)展趨勢(shì)及在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。 理解植物組織培養(yǎng)的根本原理。 了解植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室或商業(yè)性種苗生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。熟悉培養(yǎng)室常用儀 器、設(shè)備及用具，并掌握其使用方法，熟知組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用藥品，并掌握其性質(zhì)、用途 及配制方法。 了解植物組織培養(yǎng)中如洗滌、 滅菌、培養(yǎng)基配制、 無(wú)菌操作等技術(shù)環(huán)節(jié)，并掌握其操 作規(guī)程，會(huì)熟練操作。 了解影響植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件。 掌握植物器官、愈傷組織、胚胎、花藥與

3、花粉、細(xì)胞、原生質(zhì)體培養(yǎng)及種質(zhì)資源保存 的根底技術(shù)。 掌握植物組培快繁及脫毒苗培育技術(shù)。熟知外植體初代培養(yǎng)、誘導(dǎo)增殖、壯苗與生根及瓶苗馴化等各技術(shù)環(huán)節(jié)，并了解組織培養(yǎng)中污染、褐變及超度含水態(tài)苗發(fā)生的原因及控制 措施。 了解重要植物的組培快繁與脫毒技術(shù)及組培苗工廠化生產(chǎn)與經(jīng)營(yíng)管理。三、內(nèi)容與課時(shí)安排24學(xué)時(shí)章節(jié)目錄課堂講授內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配表章節(jié)內(nèi)容學(xué)時(shí)第1章概述2第2章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)4第3章愈傷組織培養(yǎng)2第4章胚狀體發(fā)生2第5章器官培養(yǎng)2第6章花藥和花粉培養(yǎng)2第7章細(xì)胞培養(yǎng)2第8章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交2第9章植物脫毒技術(shù)3第10章組培苗工廠化生產(chǎn)的經(jīng)營(yíng)與管理11第11章種質(zhì)

4、保存2-第1章概 述2學(xué)時(shí)-一一植物組織培養(yǎng)的概念二植物組織培養(yǎng)的開(kāi)展三植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用本章小結(jié)目的要求：1掌握組織培養(yǎng)的概念和類型;2掌握組織培養(yǎng)的特點(diǎn)；3了解組織培養(yǎng)開(kāi)展史；(4) 初步掌握組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)實(shí)踐上的應(yīng)用。一、植物組織培養(yǎng)的概念(一) 植物組織培養(yǎng)的概念高等植物的組織培養(yǎng)(tissue culture)技術(shù)是指別離一個(gè)或數(shù)個(gè)體細(xì)胞或植物體的一部 分在無(wú)菌條件下培養(yǎng)的技術(shù)。 通常我們所說(shuō)的廣義的組織培養(yǎng)， 是指通過(guò)無(wú)菌操作別離植物 體的一局部(即外植體explant)，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生成完 整的植株。(二) 植物組織培養(yǎng)的生理依據(jù)細(xì)胞全能性 (c

5、ell totipotency) ：植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組，并 具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)于植物細(xì)胞組織的分化和決定具有關(guān)鍵性作用。 它包括：生長(zhǎng)素類、 細(xì)胞分裂素類、赤霉素、脫落酸、乙烯等生長(zhǎng)素類主要用于愈傷組織的形成， 體細(xì)胞胚的產(chǎn)生及試管苗的生根。 常用的有 2,4-D 、 NAA、 IBA、IAA 等。其作用強(qiáng)弱為 2,4-D>NAA>IBA>IAA。細(xì)胞分裂素類那么有促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化， 延遲組織的衰老，促進(jìn)芽的產(chǎn)生等作用。 常 用的有Zip、KT、6-BA、ZT等作用強(qiáng)弱順序?yàn)椤ip>KT>6-BA>

6、;ZT。赤霉素那么有促進(jìn)已分化的芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，打破種子休眠的作用。常用的為GA3。(三) 植物組織培養(yǎng)的類型組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對(duì)象可分為組織或愈傷培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、植株培養(yǎng)、細(xì)胞和原生質(zhì)體培 養(yǎng)等。1組織或愈傷組織培養(yǎng)(tissue, callus culture)為狹義的組織培養(yǎng)，是對(duì)植物體的各部 分組織進(jìn)行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁 組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)， 二者均通過(guò)再分化誘導(dǎo)形成植株。2. 器官培養(yǎng)(organ culture)即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同，可以包括 別離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣

7、、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實(shí) 等外植體的培養(yǎng)3. 植株培養(yǎng)(plant culture )是對(duì)完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株的培養(yǎng)。4 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture )是對(duì)由愈傷組織等進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分 散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。5.原生質(zhì)體培養(yǎng) ( protoplast culture )是用酶及物理方法除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)是本世紀(jì)開(kāi)展起來(lái)的一門新技術(shù)， 由于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步， 尤其是外源激素的應(yīng) 用，使組織培養(yǎng)不僅從理論上為相關(guān)學(xué)科提出了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且一躍成為一種大規(guī)模、批量工廠化生產(chǎn)種苗的新方法，并在生產(chǎn)上

8、越來(lái)越得到廣泛的應(yīng)用。植物組織培養(yǎng)之所以開(kāi)展如此之快， 應(yīng)用的范圍如此之廣泛， 是由于具備以下幾個(gè)特點(diǎn)： 培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、 晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響， 且條件均一， 對(duì)植物生長(zhǎng)極 為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。 生長(zhǎng)周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件， 根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同 的培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)較快。另外，植株也比較小，往往 20-30d 為一個(gè)周期。所以，雖然 植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗， 但由于植物材料能按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)， 故總

9、體來(lái) 說(shuō)本錢低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制 植物組織培養(yǎng)是在一定的場(chǎng)所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營(yíng)養(yǎng)、激 素等條件， 極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)， 也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。 它是未來(lái)農(nóng)業(yè) 工廠化育苗的開(kāi)展方向。 它與盆栽、 田間栽培等相比省去了中耕除草、 澆水施肥、 防治病蟲(chóng) 害等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。二 、植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的開(kāi)展 植物組織培養(yǎng)的研究可以追溯到 20 世紀(jì)初期，根據(jù)其開(kāi)展情況，大體可以分為三個(gè)時(shí) 期。1萌芽階段組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃開(kāi)展只是近 50年的事，但它的

10、整個(gè)歷史可以追溯至 19 世紀(jì)末和上 世紀(jì)初。20世紀(jì)初，在Schleiden和Schwann所開(kāi)展起來(lái)的細(xì)胞學(xué)說(shuō)的推動(dòng)下， 1902年德 國(guó)植物學(xué)家 Haberlandt 提出了高等植物的器官和組織為許多細(xì)胞組成的觀點(diǎn)， 以及植物細(xì)胞 全能性的理論， 即植物的體細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛在能力。他首次發(fā)表了植物離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的報(bào)告。1912年，Habefiandt的學(xué)生Kotte和美國(guó)的 Robins 在根尖培養(yǎng)中獲得了組織培養(yǎng)的成功。 Kotte 采用了無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、蛋白 胨、天冬酰胺，及添加各種氨基酸的培養(yǎng)基。 Robins 用含無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖或果糖

11、的瓊脂培 養(yǎng)基，培養(yǎng)了長(zhǎng)度為1.453.75cm的豌豆、玉米和棉花的莖尖， 形成了一些缺綠的莖和根。2奠基階段自 Haberlandt 的實(shí)驗(yàn)之后，直到 1934年美國(guó)的 White 由番茄根建立了第一個(gè)活潑生長(zhǎng) 的無(wú)性繁殖系， 并反復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)， 使根的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了真正的成 功，并在以后 28 年間培養(yǎng)了 1600 代。這之后， White 又以小麥根尖為材料，研究了光、溫 度、通氣、 pH 值、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對(duì)生長(zhǎng)的影響，并于 1937 年建立了第一個(gè)組 織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，其成分均為化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來(lái)被定名為W

12、hite培養(yǎng)基。與此同時(shí)，Gautherer (1934)在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，提出了 B 族維生素和生長(zhǎng)素對(duì)組織培養(yǎng)的重要意義， 并于 1939 年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White 由煙草種間雜種的瘤組織， Nobecourt 由胡蘿卜均建立了與上述類似的連續(xù)生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)物。因此，Gautherer，White 和 Nobecourt 一起被譽(yù)為組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。 我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基， 根本上都是由這三位科學(xué)家建立的。后來(lái)， White 于 1943年發(fā)表了?植物組織培養(yǎng)手冊(cè)? 專著，使植物組織培養(yǎng)開(kāi)始成為一門新興的學(xué)科。3快速開(kāi)展

13、和應(yīng)用階段40 年代 Skoog 和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺 苷可以解除培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素( IAA )對(duì)芽形成的抑制作用，而能誘導(dǎo)形成芽，從而明確了腺 嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即這一比例高時(shí)， 產(chǎn)生芽； 這一比例低時(shí)，那么形成根；相等那么不分化。 在尋找促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)過(guò)程中， Miller 等人于 1956 年發(fā)現(xiàn)了沖動(dòng)素。 不久即知道沖動(dòng)素可以代替腺嘌呤促進(jìn)發(fā)芽， 并且效果可增加 3萬(wàn)倍。 結(jié) 果上述控制器官分化的激素模式變?yōu)闆_動(dòng)素與生長(zhǎng)素的比例關(guān)系。這方面的成功發(fā)現(xiàn)， 有力地推動(dòng)了植物組織培養(yǎng)的開(kāi)展。1952年； Morel

14、和 Martin 通過(guò)莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中 首次獲得無(wú)病毒植株。19351945年Muir把單細(xì)胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培 養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂，即實(shí)施了看護(hù)接種技術(shù)，使單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶別離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株， 這不僅在理論上證明了無(wú)壁的原生質(zhì)體同樣具 有全能性，而且在實(shí)踐上為外源基因的導(dǎo)入提供了理想的受體材料。80年代中期以來(lái)，對(duì)禾谷類作物的原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼告捷，在這方面中國(guó)學(xué)者做出了重要奉獻(xiàn)。1962 年印度Guha 等人成功地在毛葉

15、曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株，從而促進(jìn)了花藥 和花粉培養(yǎng)的研究。以后相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、辣椒、草莓、蘋果等多種植物培養(yǎng)中獲得 成功， 其數(shù)目到達(dá) 160多種， 其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養(yǎng)在中國(guó)取得了引入注 目的成就。1960年， Morel 提出了一個(gè)離體無(wú)性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。由于這一方法 有很大的應(yīng)用價(jià)值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。1973年Carlson等通過(guò)兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種，Cocking 等倡導(dǎo)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交， 研究得到了迅速開(kāi)展， 已經(jīng)能使矮牽牛和煙草屬的雜種細(xì)胞增

16、殖分化生 成雜種植株。在整個(gè)植物組織培養(yǎng)開(kāi)展的歷史中， 我國(guó)學(xué)者做出多方面的奉獻(xiàn)， 除了前述的崔徵的研 究成效以外，還有 1993 年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的研究工作，以及羅士韋 關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚的研究培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚的研究培養(yǎng)工作。三、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用 植物組織培養(yǎng)成為生物科學(xué)的一個(gè)廣闊領(lǐng)域， 除了在根底理論的研究上占有重要地位以 外，還在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。(一) 植物組織培養(yǎng)的快速繁殖用植物組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖 (rapidpropagation) 是生產(chǎn)上最有潛力的應(yīng)用，包括 花卉欣賞植物、蔬菜、果樹(shù)、大田作物及其他經(jīng)濟(jì)作物。

17、快繁技術(shù)不受季節(jié)等條件的限制， 生長(zhǎng)周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進(jìn)行增殖?？焖俜敝晨捎靡韵率侄芜M(jìn)行：通過(guò)莖尖、莖段、鱗莖盤等產(chǎn)生大量腋芽；通過(guò)根、葉等 器官直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽； 通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。 試管快速繁殖應(yīng)用在以下生 產(chǎn)或研究中： (1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。 (2)繁殖脫毒培養(yǎng)得到的少量無(wú)病毒苗。 (3)繁殖生產(chǎn)上急需的或種源較少的種苗。由于組織培養(yǎng)周 期短， 增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點(diǎn)， 加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化， 這就可使有限的空 間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。組織培養(yǎng)突出的優(yōu)點(diǎn)是“快，通過(guò)這 一方法在較

18、短時(shí)期內(nèi)迅速擴(kuò)大植物的數(shù)量， 以一個(gè)莖尖或一小塊葉片為基數(shù)， 經(jīng)組織培養(yǎng)一 年內(nèi)可增殖到 10 000100 000株。(二) 脫毒植物在生長(zhǎng)過(guò)程中幾乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的種類甚至同時(shí)受到數(shù)種病毒病的危害， 尤其是很多園藝植物靠無(wú)性方法來(lái)增殖， 假設(shè)蒙受病毒病，代代相傳，越染越 重，甚至?xí)斐蓸O嚴(yán)重的后果。自從 Morell952 年發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)方法可得到無(wú)病毒苗 (virus free) 后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。假設(shè)再與熱處理相結(jié)合， 那么可提高脫毒培養(yǎng)的效果。 對(duì)于木本植物， 莖尖培養(yǎng)得到的植株難以發(fā)根生長(zhǎng)， 那么可采用莖 尖微體嫁接的方法來(lái)

19、培育無(wú)病毒苗。組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)上得到應(yīng)用， 如馬鈴薯， 甘薯，草莓， 蘋果， 香石竹， 菊花等。而且已有不少地區(qū)建立了無(wú)病毒苗的生產(chǎn)中心， 這對(duì)于無(wú)病毒苗的 培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)程序，從而到達(dá)了保持園藝 植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟(jì)性狀的目的。三體細(xì)胞無(wú)性系變異和新品種培育 breeding 植物組織培養(yǎng)過(guò)程中往往存在大量的變異， 這種變異稱為體細(xì)胞無(wú)性系變異。 具有如下 特點(diǎn)：1變異的無(wú)方向性：既有有利的變異，也有有害的變異既有形態(tài)變異，也有生理變異。2變異的普遍性：變異在組織培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生，出現(xiàn)在組織培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期。既有數(shù) 量性狀變異

20、，又有質(zhì)量性狀變異。既有農(nóng)藝性狀變異，又有經(jīng)濟(jì)性狀變異；既有表型變異， 又有生理變異。 與自然變異與輻身誘變相比， 體細(xì)胞無(wú)性系變異廣泛而普遍。 且易于獲得純 合個(gè)體。3植物體細(xì)胞無(wú)性系變異的類型：一類為可遺傳變異，主要是由于遺傳物質(zhì)的變化引 起的尤以基因突變?yōu)橹?。另一類是不可遺傳的變異，為生理型變異。往往是由于培養(yǎng)過(guò) 程中外加的激素及其它化學(xué)物質(zhì)的刺激引起。如葉形、育性等。4弓|起植物體細(xì)胞無(wú)性系變異的原因：激素的刺激為主要原因。高濃度的GA和IAA ,會(huì)造成畸形胚的高頻發(fā)生， TDZ可使植株產(chǎn)生白化苗或玻璃化植株。 2，4-D那么使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā) 生染色體數(shù)量變化。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，染色體變異

21、頻率升高，變異的性狀和范圍手?jǐn)U大。5植物體細(xì)胞無(wú)性系變異的利用價(jià)值及途徑：它是一種重要的遺傳變異來(lái)源，是一種 重要的遺傳資源。對(duì)于育種有重要的應(yīng)用價(jià)值。四單倍體育種花藥、花粉的培養(yǎng)在蘋果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍(lán)、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。 在常規(guī)育種中為得到純系材料要經(jīng)過(guò)多代自交， 而單倍體育 種，經(jīng)染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限。五種質(zhì)保存 用植物組織培養(yǎng)技術(shù)保存種質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1在較小的空間內(nèi)可以保存大量的種質(zhì)資源。2具有較高的繁殖系數(shù)。3防止外界不利氣候及其他栽培因素的影響，可常年進(jìn)行保存。4不愛(ài)昆蟲(chóng)、病毒和其他病原體的影

22、響。 5有利于國(guó)際間的種質(zhì)交換與交流。六遺傳轉(zhuǎn)化 大多數(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法需要通過(guò)植物組織培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行。本章小結(jié) ：1植物組織培養(yǎng)是指別離單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或植物體的一局部，在人工配制的培養(yǎng)基 上進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)成一株完整植物體的過(guò)程。2按照外植體的不同，組織培養(yǎng)可分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng) 和原生質(zhì)體培養(yǎng) 5 種類型。 3組織培養(yǎng)具有：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長(zhǎng)周期短，繁殖率高；管理方便，利 于工廠化生產(chǎn)的突出特點(diǎn)，因而開(kāi)展迅速。4組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要表達(dá)于以下幾個(gè)方面：快速繁殖優(yōu)良苗木； 獲得脫毒苗；育種上應(yīng)用；工廠化育苗。第2章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)(

23、4學(xué)時(shí))第節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備第二節(jié)1培養(yǎng)基及其配制第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)第四節(jié)試管苗的馴化與移載本章小結(jié)目的要求：(1) 掌握組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)；(2) 掌握組織培養(yǎng)常用的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及其使用方法；(3) 掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。掌握滅菌和消毒的區(qū)別；(5) 掌握滅菌的不同方法和具體操作過(guò)程；(6) 掌握無(wú)菌接種的步驟；(7) 掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟；(8) 一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法；(9) 掌握試管苗馴化的根本程序；在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對(duì)工作中需要哪些最根本的設(shè)備條件有個(gè)全面的 了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改

24、建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，那么會(huì)限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)組織 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)設(shè)計(jì)，防止某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組 織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行的。要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具， 同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第一節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備一、設(shè)計(jì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)包括：洗滌室、配置室、無(wú)菌室、培養(yǎng)室、觀察室等。 在實(shí)際中可結(jié)合可行條件，合并一局部。(一) 洗滌室(cleaning room)洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、枯燥和貯存。室內(nèi)應(yīng)

25、配備大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐，用于運(yùn)輸培養(yǎng) 器皿。備有枯燥架，用于放置枯燥涮凈的培養(yǎng)器皿。(二) 準(zhǔn)備室(repairing room)準(zhǔn)備室要求明亮、 通風(fēng)。 在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、 清洗與整理工 作。如果房間較多， 可將準(zhǔn)備室分為洗滌室和配置室兩局部。 洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與 培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室那么負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。三緩沖室 進(jìn)入無(wú)菌室前要在緩沖室里換上經(jīng)過(guò)滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。 應(yīng)當(dāng)在此室內(nèi)安 裝滅菌用的紫外燈。控制無(wú)菌室及培養(yǎng)室的配電板等。四無(wú)菌操作室 tra

26、nsfering room 接種室是進(jìn)行植物材料的別離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。 其無(wú)菌條件的好壞 對(duì)組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。在工作方便的前提下，接種室宜小不宜大，一般78m2，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門，以減少開(kāi)關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。接種室要求干爽安靜， 清潔明亮。 在適當(dāng)位置吊裝 1-2 盞紫外線滅菌燈， 用以照射滅菌。 最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。五 培養(yǎng)室 culturing room 培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、 數(shù)目、 及其他附屬設(shè)備而定。 其設(shè)計(jì)

27、以充分利用空間和節(jié)省能源為原那么。 高度比培養(yǎng)架略高 為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè) 5 層，最低一層離地高約 l0cm ，其他每層間隔 30cm 左右，培養(yǎng)架即高 1. 7m 左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度都是根據(jù)日光燈的 長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用 40W日光燈，那么長(zhǎng)1.3m, 30W的長(zhǎng)Im ,寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在2027 C左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。 由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度, 最好不同種類有不同的 培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定,相對(duì)濕度以保持在70 80為好,可安裝加濕器。

28、控制日光照時(shí)間可安裝定時(shí)開(kāi)關(guān)鐘，一般需要每天光照1016h也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件,長(zhǎng)日照 植物需要長(zhǎng)日照條件?，F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采 用天然太陽(yáng)光照作為主要能源,這樣不但可以節(jié)省能源,而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好, 馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。六馴化室馴化室要求清潔無(wú)菌, 配有空調(diào)機(jī)、 加濕器、 恒溫恒濕控制儀、 噴霧器、 光照調(diào)節(jié)裝置、 通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。七溫室 應(yīng)配有空調(diào)機(jī)、通風(fēng)口、加濕器、恒溫恒濕控制裝置、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置以及必要的殺菌殺蟲(chóng)裝置及相應(yīng)藥劑。二、儀器設(shè)備和器皿用具一儀器設(shè)備見(jiàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)1超凈臺(tái),優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如,比較舒適,工作

29、效率高,準(zhǔn)備時(shí)間短。開(kāi)機(jī)10分鐘即可操作, 可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間使用。 在工廠化生產(chǎn)中, 接種工作量很大, 需要經(jīng)常長(zhǎng)久地工作時(shí), 超凈臺(tái)是很理想的設(shè)備。超凈臺(tái)功率在145260W左右，它裝有小型鼓風(fēng)機(jī)，使空氣穿過(guò)一個(gè)前置過(guò)濾器, 在這里把大局部空氣塵埃先過(guò)濾掉, 然后再使空氣穿過(guò)一個(gè)細(xì)致的高效過(guò) 濾器,它除去了大于 0. 3um 的塵埃、細(xì)菌和真菌孢子等,最后以較潔凈的氣流吹到工作臺(tái) 面。超凈空氣的流速為每分鐘 2430m,這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染， 這樣的 流速也不會(huì)阻礙采用酒精燈對(duì)器械等的灼燒消毒。 在這樣的無(wú)菌條件下操作， 就可以保證無(wú) 菌材料在轉(zhuǎn)移接種過(guò)程中不受污染。超凈臺(tái)分水平

30、式和垂直式二種型號(hào)。2無(wú)菌箱,在投資少的情況下,可以用接種箱來(lái)代替超凈臺(tái)。接種箱依靠密閉、藥劑 熏蒸和紫外燈照射來(lái)保證內(nèi)部空間無(wú)菌。但操作活動(dòng)受限制,準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng),工作效率低。3空調(diào)機(jī)，保證室內(nèi)溫度，一般為25 ± 2 C,應(yīng)安置在室內(nèi)較高的位置。以便于排熱散涼。4 .除濕機(jī)，培養(yǎng)室的濕度應(yīng)為7080%濕度過(guò)高易長(zhǎng)雜菌，濕度過(guò)低培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)基會(huì)失水變干，影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。5恒溫箱，用于植物材料的培養(yǎng)，可以控制溫度、濕度及光照等。6烘箱，用于枯燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測(cè)定干物重。用于枯燥需保 持80100C；進(jìn)行干熱滅菌需保持 150 C,達(dá)13h;假設(shè)測(cè)定干物重，那么溫

31、度應(yīng)控制在 80 C 烘干至完全枯燥為止。7高壓滅菌鍋，用于進(jìn)行培養(yǎng)基和器械用具的滅菌。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式 高壓滅菌鍋。 如果是連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn), 應(yīng)選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋。 通常以電 作能源。&冰箱，主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。9 電子分析天平和托盤天平，電子分析天平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、 激素等微量藥品精確度為 0.0001g；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，其精確度為 0. 1g。天平應(yīng)放置在枯燥、不受震動(dòng)的天平操作臺(tái)上。10顯微鏡及解剖鏡，種類較多，用于別離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。雙筒解剖鏡 在別離

32、莖尖等較小組織時(shí),便于觀察、操作,通常放大 5-80 倍。放大 40 倍以上操作需要有 相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。 為進(jìn)行操作, 要有照明裝置。 解剖鏡上帶有照相裝置, 根據(jù) 需要隨時(shí)對(duì)所需材料進(jìn)行攝影記錄。11. 水浴鍋，用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條12. 搖床與轉(zhuǎn)床、用于改善液體培養(yǎng)材料的通氣狀況及促進(jìn)酶解原生質(zhì)體的解離。一般在液體培養(yǎng)中轉(zhuǎn)速為每分鐘 100次左右,在解離原生質(zhì)體時(shí)為每分鐘80左右。13磁力攪拌器，磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等。 磁力攪拌器還可加熱,使之更利于溶解。14電蒸餾水器，電蒸餾水器，采用硬質(zhì)玻璃或金屬制成。蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)

33、基,配制培養(yǎng)基可用自來(lái)水來(lái)代替,假設(shè)實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的話,那么須用蒸餾水。15酸度計(jì)，組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pH值的準(zhǔn)確度是十分重要的，應(yīng)當(dāng)使用酸度計(jì)，假設(shè)無(wú)酸度計(jì),也可使用 pH 試紙進(jìn)行粗測(cè)。首次使用酸度計(jì)前,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位,然后固定。測(cè)量 pH 值時(shí),待測(cè)液必須充分 攪拌均勻。 如果培養(yǎng)基溫度過(guò)高, 測(cè)量時(shí)要調(diào)整 pH 值計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。 注意保護(hù)好玻璃電極,用后電極應(yīng)用蒸餾水沖洗凈,蓋上電極帽。16、離心機(jī)，用于收集原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)速要求較低。一般為10004000rpm即可。二各類器皿1. 培養(yǎng)器皿：在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶 解度小的硬質(zhì)

34、玻璃制成, 以保證長(zhǎng)期貯存藥品及培養(yǎng)的效果； 培養(yǎng)用的還要求透光度好, 能 耐高壓高溫， 能方便放人培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿， 根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求， 可以采用不同 種類、規(guī)格的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。最常使用的是三角瓶，規(guī)格有l(wèi)00ml ，250ml ， 500ml 等，一般使用 l00ml 三角瓶，無(wú)論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大，利于組織生長(zhǎng)，受光也比試管好。由于瓶口較小， 亦不易污染。培養(yǎng)皿常用 9、 12cm 直徑等規(guī)格，要求上、下能密切吻合。這在游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、 花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無(wú)菌種子的發(fā)芽、植物材料的別離等都需采用。試管常用 18mm

35、Xl80mm 或 20mmX200mm 規(guī)格。可用于培養(yǎng)較高的試管苗，另外也不 易污染。培養(yǎng)器皿還可就地取材， 采用一些代用品。 工廠化生產(chǎn)可采用廣口的 200ml 罐頭瓶， 加 蓋半透明的塑料蓋， 由于瓶口大，所以大量繁殖時(shí)操作方便、 工作效率高， 也減少了培養(yǎng)材 料的損傷。但缺點(diǎn)是易引起污染。目前， 培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。 塑料容器具有質(zhì) 輕、透明、不易破碎、本錢低等優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)容器多為平底方盒形，可提高培養(yǎng)空間利用率 的植株數(shù)， 并能一層層地疊摞起來(lái)， 從而節(jié)約空間。 這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成， 能耐高溫， 可進(jìn)行高壓滅菌。有些產(chǎn)品為一次性消耗

36、品， 不但可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí) 間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無(wú)須另外配蓋，使用時(shí)比較方便。瓶口封塞可用多種方法， 要具有一定的通氣性和密閉性， 以防止培養(yǎng)基枯燥和雜菌污染。 以前封口常用棉塞。 但這種封口方法夏季極易污染， 且不易保持培養(yǎng)基的濕度。 現(xiàn)在多采用 聚丙烯塑料薄膜作為封口， 以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。 為了增加通氣性， 可在里面襯一層硫 酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便，且通氣好。也可采用專用的封口膜。2分注器，小型操作時(shí)可采用燒杯直接分裝。大型實(shí)驗(yàn)室可采用醫(yī)用“下口杯作為 分裝工具，在“下口杯的下口管上套一段軟膠管，加一彈簧止水夾，使用時(shí)非常適宜。更 大規(guī)模或要

37、求更高效率時(shí)，可考慮采用液體自動(dòng)定量灌注設(shè)備。3離心管，用于離心收集原生質(zhì)體，一般用5ml、 10ml 規(guī)格。4. 刻度移液管，常用的有 0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml。用于配制培養(yǎng)基 時(shí)吸取不同種類的母液。應(yīng)多準(zhǔn)備幾支，分開(kāi)使用。5細(xì)菌過(guò)濾器，用于除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細(xì)菌。一般采用0.22um微孔濾膜進(jìn)行抽濾滅菌。包括濾頭，注射器或采用抽濾裝置：真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等。6.實(shí)驗(yàn)器皿，在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括 100ml、250ml、500ml、1000ml 燒杯；10ml、l00ml、10

38、00ml 量筒；100ml、 1000ml 試劑瓶 (棕色 )等等。(三) 器械用具1 .鑷子類( forceps )常應(yīng)用醫(yī)療上的鑷子。根據(jù)操作需要有各種類型，假設(shè)用 l00ml 的三角瓶作為培養(yǎng)瓶，可 用 20em 長(zhǎng)的鑷子。 鑷子過(guò)短. 容易使手接觸瓶口， 造成污染。 鑷子太長(zhǎng)， 使用起來(lái)不靈活。 如在別離莖尖幼葉時(shí)，那么用鐘表鑷子。2. 剪刀類( scissors) 可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由 于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。3. 解剖刀切割較小材料和別離莖尖分生組織時(shí)， 可用解剖刀。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀 態(tài)，否那么切

39、割時(shí)會(huì)造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。4解剖針解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。 也可用于別離微莖尖的幼葉， 可以自 制。5接種工具包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成6鉆孔器 用于取肉質(zhì)莖、塊莖、肉質(zhì)根內(nèi)部的組織時(shí)采用。一般為 T 字型?？趶接懈鞣N規(guī)格。 7其它包括酒精燈，電爐，試管架，搪瓷盤等多種。第二節(jié) 培養(yǎng)基及其配制 目的要求：(1) 一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)；(2) 掌握根本培養(yǎng)基的配方；(3) 一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；(4) 掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟；(5) 熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；(6) 一般掌握培養(yǎng)基的篩

40、選方法。培養(yǎng)基( culture medium )是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植 物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求， 甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同， 只 有滿足了它們各自的特殊要求， 它們才能很好地生長(zhǎng)。 因此， 沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切 類型的植物組織或器官， 在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)， 首先必須找到一適宜的培養(yǎng)基， 培養(yǎng) 才有可能成功。 在植物組織培養(yǎng)歷史進(jìn)程中， 事實(shí)上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。 對(duì)植 物的營(yíng)養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識(shí)， 對(duì)已有培養(yǎng)基的改進(jìn)， 或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、 新的有益成分 應(yīng)用于培養(yǎng)基之中，都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速開(kāi)展，取得

41、越來(lái)越多的成功。 一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大 類。1水水是植物原生質(zhì)體的組成成分， 也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。 它是生命活動(dòng)過(guò)程中 不可缺少的物質(zhì)。 配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水， 以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性， 防止 貯藏過(guò)程發(fā)霉變質(zhì) '大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的 變化引起不良效果。2無(wú)機(jī)元素 (inorganicelement)大量元素，指濃度大于 05mmolL 的元素，有 N，P，K，Ca，Mg，S 等。其作用是：(1) N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿

42、等的組成成分，是生命不 可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以 N03-N 和 NH4-N 兩種形式供給。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有NO， -N 又含 NH4-N 。 NH4-N 對(duì)植物生長(zhǎng)較為有利。供給的物質(zhì)有KN03 、 NH4NO3 等。有時(shí)，也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。(2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成局部。磷也是ATP、ADP 等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能 量，而且也促進(jìn)對(duì) N 的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有 KH2P04 或 NaH2P04 等。(3) K 對(duì)碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。

43、K 增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成 增加，維管束、纖維組織興旺，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過(guò)大，一般為 1-3mg L 為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以 KCl 、 KNO ，等鹽類提供。(4) Mg、S和Ca、Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以 MgS04 7H20提供。用量為13mg/ L較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì) 胞壁的一種成分，Ca對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2 2H20提供。(5) 微量元素 指小于0.5mmol /L的元素，F(xiàn)e, B, Mn , Cu, Mo , Co等。鐵是一些氧 化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成

44、分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。 培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、 芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。 在制做培養(yǎng)基時(shí)不用 Fe2(S04)3 和FeCl3(因其在pH值5. 2以上，易形成Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用FeS047H20和 Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B, Mn , Zn, Cu, Mo , Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可 缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)，發(fā)育異常現(xiàn)象?？傊参锉匦锠I(yíng)養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以 及作為酶的活化劑，參與活潑的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平 衡等電化學(xué)方面起著重要作用。 當(dāng)某些營(yíng)養(yǎng)元

45、素供給缺乏時(shí)， 愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥 狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫， 表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，那么影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。3有機(jī)化合物 (organic compound)培養(yǎng)基中假設(shè)只含有大量元素與微量元素， 常稱為根本培養(yǎng)基。 為不同的培養(yǎng)目的往往要 參加一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。常參加的有機(jī)成分主要有以下幾類：(1) 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組 織很好的生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%,即配制1L培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5

46、%，但在胚培養(yǎng)時(shí)采 用 4 15的高濃度，因蔗糖對(duì)胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對(duì)生長(zhǎng)的影響不同。 從各種糖對(duì)水稻根培養(yǎng)的影響來(lái)看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相當(dāng),麥芽糖差一些。 不同植物不同組織的糖類需要量也不同,實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取,不能任意取量。 高壓滅菌時(shí)一局部糖發(fā)生分解、 制定配方時(shí)要給予考慮。 在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí), 可用食用的綿白 糖代替。(2) 維生素 (vitamin) 這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝 活動(dòng), 對(duì)生長(zhǎng)、 分化等有很好的促進(jìn)作用。 雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需 的維生素,但在數(shù)量上還明顯缺乏,通常需參加一至數(shù)種維生素

47、,以便獲得最良好的生長(zhǎng)。 主要有Vsl(鹽酸硫胺素卜VD6(鹽酸吡哆醇卜Vpp(煙酸卜VC(抗壞血酸)、有時(shí)還使用生物 素、葉酸、VB2等。一般用量為0. 11.0mg/L。有時(shí)用量較高。Vm對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和 生活力有重要作用, VB6 能促進(jìn)根的生長(zhǎng), Vpp 與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。 Vc 有 防止組織變褐的作用。(3) 肌醇 (myo-inosit0l) 又叫環(huán)己六醇， 在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。 通?？捎闪姿?葡萄糖轉(zhuǎn)化而成， 還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)， 用于構(gòu)建細(xì)胞壁。 肌醇與 6 分子磷酸殘基相結(jié) 合形成植酸，植酸與鈣、 鎂等陽(yáng)離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，

48、參與細(xì)胞膜 的構(gòu)建。使用濃度一般為lOOmg / L,適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。(4) 氨基酸 (aminoacide) 是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用 的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白， 它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物， 是含有約 20種氨基酸的混合物，用量在 101000mg/L之間。由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。 如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。(5) 天然復(fù)合物 其成分比較復(fù)雜，大多

49、含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì) 細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用， 但對(duì)器官的分化作用不明顯。 它的成分大多不 清楚，所以一般應(yīng)盡量防止使用。1) 椰乳 是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在 1020，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn) 作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小假設(shè)超過(guò)1mm時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。2) 香蕉 用量為150200ml/l。用黃熟的小香蕉，參加培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?duì)pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。3) 馬鈴薯(pota

50、to)去掉皮和芽后，加水煮 30min，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。用量為 150200g/ L。對(duì)pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。4) 水解酪蛋白 為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為 100200mgL。 受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。5) 其他 酵母提取液 (YE)(0 . 01 0. 05) ，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0.01%-0.5% )、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。4植物激素 (hormone)是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物， 它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、 分裂、

51、 發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多 的生理生化活動(dòng)， 在培養(yǎng)基的各成分中， 植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)， 對(duì)植物組織培養(yǎng)起 著決定性作用。(1) 生長(zhǎng)素類 (auxin) 在組織培養(yǎng)中， 生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成， 誘導(dǎo)根的分 化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、 伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在促進(jìn)生長(zhǎng)方面， 根對(duì)生長(zhǎng)素最敏感。 在極低的濃度下， (10-5 10-8mg / L)就可促進(jìn)生長(zhǎng)，其次是莖和芽。天然的生長(zhǎng)素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件 易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長(zhǎng)素類物質(zhì)。IAA (indoaceticacid ，吲

52、哚乙酸 ) 是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力較低，是 生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的 IAA 分解酶降解，受光也易分解。IBA (indolebutyric acid ，吲哚丁酸 )是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。NAA naphthaleneaceticacid，萘乙酸在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比 IAA高出34倍， 且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA 和 IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。2， 4-D 2， 4-二氯苯氧乙酸 起動(dòng)能力比 IAA 高 10 倍，特別在促進(jìn)愈

53、傷組織的形成上 活力最高， 但它強(qiáng)烈抑制芽的形成， 影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過(guò)量常有毒 效應(yīng)。生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量 95 %酒精助溶。2, 4-D可用0. 1mol / L的NaOH或KOH助 溶。生長(zhǎng)素常配成 1mgdml 的溶液貯于冰箱中備用。2GA gibberellicacid ，赤霉素 有 20 多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株； 赤霉素和生長(zhǎng)素協(xié)同作用， 對(duì)形成層的分化有影響， 當(dāng)生長(zhǎng)素赤霉素比值高時(shí)有利 于木質(zhì)局部化，比值低時(shí)有利于韌皮局部化；此外，赤霉素還用于打破休眠，

54、促進(jìn)種子、塊 莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。赤霉素溶于酒精，配制時(shí)可用少量 95%酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有 70% 100%失效，應(yīng)當(dāng)采用過(guò)濾滅菌法參加。3細(xì)胞分裂素類 cytokinin 這類激素是腺嘌呤的衍生物， 包括 6-BA6- 芐基氨基嘌呤 、 Ktkinetin 沖動(dòng)素 、 Zt zeatin 玉米素 等。其中 Zt 活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是 6-BA。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用： 誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)， 細(xì)胞分裂 素與生長(zhǎng)素相互作用， 當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素的比值高時(shí)， 誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化 出不

55、定芽。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽 的分化、莖、苗的增殖，而防止在生根培養(yǎng)時(shí)使用。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向， 是愈傷組織、是長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。 如為了 促進(jìn)芽器官的分化， 應(yīng)除去或降低生長(zhǎng)素的濃度， 或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的 比例。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mgL 表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0. 055mg/L,細(xì)胞分裂素 0.0510mg/L。5培養(yǎng)材料的支持物1瓊脂 agar 在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。 瓊脂是一種由海藻中提取的高

56、分子 碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40C即凝固為固體狀凝膠。通常所說(shuō)的 煮化"培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90C以上的熱水。瓊脂的用量在610g/ L之間，假設(shè)濃度太高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的 組織中去。 假設(shè)濃度過(guò)低， 凝固性不好。新買來(lái)的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以 顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還 與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、 pH 值等因素有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過(guò)酸過(guò) 堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解， 喪失凝固能力。時(shí)間過(guò)久，瓊脂變褐， 也會(huì)逐漸喪失凝

57、固能 力。參加瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，通氣問(wèn)題易于解決， 便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸即吸收 面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢， 影響?zhàn)B分的充分利用， 同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物， 聚集在吸收表 面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是 Ca、 Mg 及其他微量元 素。因此在研究植物組織或細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題時(shí)， 那么應(yīng)防止使用瓊脂。 可在液體培養(yǎng)基外表安 放一個(gè)無(wú)菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。(2) 其他 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料沒(méi)有 影響或影響較小。6抗生物質(zhì) (antibiotic)抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等