1、第十二章核素示蹤原理及實驗設計第一節核素示蹤的根本知識一、核素示蹤原理所謂示蹤法就是給被研究對象加上一個記號，以便在實驗體系中或機體內追蹤其行徑與動向，了解被研究對象運轉與變化規律。核素示蹤法就是利用核素作示蹤劑而建立起來的一種微量研究方法。目前絕大多數示蹤實驗都采用核素或其標記物作示蹤劑。所以，通常所說的示蹤實驗往往是指核素示蹤實驗，以下便簡稱示蹤實驗。一示蹤實驗tracer experiment 的原理示蹤實驗的根底包括以下兩點：其一是放射性核素和穩定核素及其標記化合物，雖與自然界中存在的相對應的同位素和化合物的物理性質不同，卻具有相同的化學性質和生物特 性。進入機體內后，在體內所發生的化

2、學變化或生物學過程與被示蹤的物質完全相同，這一性質在醫學研究中非常重要。其二是放射性核素能自發地發生核衰變，同時發射出射線，利用高靈敏度的儀器， 可對標記物進行精確的定性、定量或定位研究，而穩定核素由于質量不同于相應的同位素， 可借助質量分析儀進行定量測量。上述兩點結合起來， 便成為建立示蹤技術tracer technique的理論根底。二應用及意義1935年Hevesy等研究放射性磷在小鼠體內的分布代謝過程時，便創立了人工放射性核素的示蹤方法，它是一種具有實際意義的重要研究手段。尤其近10多年來在示蹤法的根底上，又建立和開展了放射自顯影、核素稀釋法、活化分析技術、體外放射免疫分析等技術， 并

3、廣泛地應用于免疫學、病理生理學、生物化學、藥理學、藥物代謝動力學、法醫學、方案 生育、遺傳學、分子生物學等醫學生物學的根底研究中。已揭示出的生物體內和細胞內的精細而又復雜的理化過程，對深入細致地研究正常或異常個體內物質代謝的各種問題包括代謝轉變的化學途徑、 速度；代謝產物在體內的分布、位置及激素和維生素等重要物質的代 謝起著推動作用。已說明的蛋白質合成、 核酸的結構等一些生物學中的最根本問題，為生命科學的研究開辟了新領域。 此外，在當代新藥研究中示蹤技術也起著十分重要的作用。所以，示蹤技術不僅是實驗核醫學研究不可缺少的方法，臨床功能檢查、臟器顯像等技術的根底， 同時也是醫學生物學研究中的重要手

4、段。二、示蹤方法的特點核素示蹤包括放射性核素示蹤和穩定核素示蹤，它們有各自的優點和缺乏。一放射性示蹤方法的優點：1 靈敏度高目前最精確的化學分析水平為101冷，而放射性示蹤法的分析水平可一 1418達10一10- g,這對于研究體內或體外實驗系統中微量的生物活性物質具有特殊價值。2 測量方法簡便放射性核素衰變不受其他理化因素溫度和pH值的影響，也不受樣品中其他非放射性雜質的干擾，因此可省去別離提純待測物的程序。尤其是用丫射線輻射體作示蹤劑時，可直接從體表測量。這樣，不僅可簡化實驗過程，又可減少實驗誤差。同時也是無創傷性的。3 符合生理條件 示蹤方法是在示蹤物質用量接近生理劑量的條件下，研究其在

5、整 體內的變化。這樣少的物質不會干擾或破壞體內生理過程的平衡狀態。這類的實驗是符合客 觀實際的。4能定位 示蹤法不僅能準確地定量測量和進行動態研究，還可利用自顯影方法確定標記物在機體器官組織內的分布和積聚。結合顯微鏡或電鏡，可進行細胞水平或亞細胞水平分析，使結構與功能研究結合起來。二穩定核素示蹤方法的優點1無輻射危害 適用于體內示蹤，特別是孕婦和兒童使用時不需要防護設施。2 穩定核素標記物不會發生輻射自分解，核素也不會衰變，因而無使用時間的限制， 適用于實驗周期長的示蹤實驗。3穩定核素一般無化學毒性。4穩定核素示蹤方法不僅靈敏度、準確度高，尚能對標記原子的位置及標記化合物 的分子結構進行分析。

6、盡管示蹤實驗具有上述優點， 在進行示蹤研究中還應注意以下幾點：操作人員的特殊訓練；電子儀器和平安防護條件的配備及由同位素效應導致的錯誤結果。三、示蹤劑示蹤劑tracer是一些有特殊標記、很容易被測定并易與其他核素和化合物區分的核素及其標記化合物。 放射性核素和穩定核素都可作示蹤劑。前者由于核素發射出的射線，能比擬容易地被放射性探測器定量地測定出來。而穩定核素由于質量不同于相應的元素，可借助質量分析儀，如質譜儀、氣相層析儀、氣-質聯用儀、液-質聯用儀和核磁共振儀等定量測定出來。四、示蹤研究的根本類型根據示蹤實驗研究的性質，可將示蹤研究分為兩大類。一物理示蹤此類示蹤研究中所用的放射性標記物不是作為

7、體內某一特定物質的示蹤物，而是用作追蹤物，研究其重量或物理變化，示蹤物不參與化學過程或代謝過程。如利用放射性惰性氣體從血流向肺內彌散的速度來判斷肺組織的病理變化等，便屬此類示蹤研究的范疇。二化學示蹤主要用于追蹤某種物質在體內或培養體系內的復雜的生物化學行為，實驗中標記化合物作為體內被測物質的示蹤劑， 要求其結構應與該特定物完全一樣或十分近似，以保證兩者生物特性相同或非常相似，以具有代表性。第二節示蹤實驗設計的根本過程、示蹤實驗的根本程序由于示蹤實驗的特殊性，除了遵循一般實驗要求外，要根據實驗目的和示蹤實驗的類型， 考慮和解決示蹤劑的選擇、觀察方法及數據處理等問題。所以，示蹤實驗必須按照一定的基

8、 本程序進行。一根本程序1 實驗準備階段實驗準備階段是示蹤實驗過程中的重要階段。主要對使用的示蹤劑、 研究對象、探測儀器、實驗用具和試劑等實驗條件進行準備。并通過預實驗檢查和完善這些條件。不僅如此， 通過模擬實驗冷試驗可掌握操作技術和熟悉實驗過程。此階段可在小范圍內進行活性實驗，了解探測儀器的性能及確定示蹤劑選擇是否適宜，防護條件和廢物處理措施能否符合要求等。不僅如此，在實驗設計和預實驗中，除設正常實驗對照外，還應設放射性工作液的空白對照組分，以利于實驗數據的糾正。總之，該階段的最終目的是根據預實驗得到的數據， 調整與修改實驗設計， 完善實驗方法，以保證正式實驗的順利完成， 并強調實驗過程的最

9、優 化和最簡略化。2 正式實驗階段它是實驗研究方案和設計實施與完成的階段。應在已確定的條件下，按具體的實驗方案進行工作。尤其是示蹤劑的使用、樣品的收集與制備以及放射性測量都要求按方案進行。假設必須修改實驗方案時，應注意實驗的連續性和可比性。在此階段中，與預實驗一樣，必須認 真作好詳細的實驗記錄，包括實驗步驟、測量結果。意外現象也應詳細記錄。3 實驗總結階段該階段的任務是按照研究設計的要求，認真檢查與歸納原始資料，使之系統化、條理化。盡量地減少或消除整理引起的誤差。并根據指標進行數據計算，找出事物的內在聯系， 得出最后的結論。對于大量放射性測量數據的計算、整理與比擬，可利用計算機的專用程序來完成

10、。但應指出，示蹤實驗中，有時需要進行放射性計數校正和特殊數據計算，或因實驗數據 缺乏，需作補充試驗和進一步的數據分析，以獲得正確的實驗結論。4實驗的善后處理階段示蹤實驗不同于一般實驗， 尤其是放射性示蹤實驗， 實驗中產生各種放射性廢物必須妥 善處理，要根據使用核素的核性質、半衰期和化學性質等，并根據國家的相關法規和政策選 擇適當的方式方法。所以，實驗結束后的處理工作，仍是整個實驗的一局部。并且，放射性 廢物的處理及放射性污染與防護，應當在整個實驗過程種都予以高度重視。二示蹤實驗設計的根本要求1 放射性示蹤實驗設計的根本要求1放射性核素的選擇放射性核素的選擇在示蹤實驗中是非常重要的。這種選擇不僅

11、在取決于實驗的要求， 還取決于核素的放射化學性質。所以，實際上應綜合兩方面的要求，去確定放射性核素選擇的根本原那么。 輻射類型：在示蹤實驗中，由于發射粒子的核素，半衰期極長，測量困難，生物示蹤實驗中很少應用。一般多項選擇用發射3 -粒子和 射線的核素，3 -射線因能量不同，分為低能的軟3 -射線3H、14C、35S、45Ca和高能量的硬3 -射線32P,離體實驗和各種代謝 研究多項選擇用發射3 -粒子的核素。體內診斷性示蹤實驗體外測量，主要選用發射丫射線的核素作示蹤核素。 半衰期：也是放射性核素選擇的標準之一。要挑選具有最適宜的半衰期的核素，它應足夠長，以滿足實驗周期的要求；同時又要足夠短，便

12、于放射性廢物的處理。整體實驗時除考慮放射性核素的物理半衰期Tp夕卜，還需考慮它的生物半衰期 Tb。根據公式12. 1,111=+ 一Te Tb Tp12. 1假設Tp與Tb相差20倍以上時，其有效半衰期Te根本等于其中那個短的半衰期。例 如，14C標記物Tp=5,730 a, Tb=10 d所以能夠作為示蹤劑被平安地使用于體內和臨床就 是這個緣故。2 放射性核素標記的位置當研究物質轉運規律時，追蹤觀察的是原示蹤物的去向，而不是追蹤其代謝產物， 故只要求標記原子牢固便可。又如研究氨基酸脫羧基反響，應將示蹤原子牢固地定位標記在羧基上，否那么在實驗過程中會脫離化合物，失去實驗意義。有些實驗不要求特殊

13、定位標記的化合物，可采用均勻標記。可是在使用均勻標記物時，要盡量除去化合物中不穩定位置上的標記原子，以免造成實驗誤差。3示蹤劑要有足夠的放射性核素純度、放射化學純度放化純度和比活度為避免不同放射性核素的干擾，減少對實驗對象的不必要的照射，要求放射性示蹤劑的放射性核素純度應到達規定的標準，即98%以上。在使用其標記化合物時，也應滿足規定的純度，即放化純度為95 %以上。此外，放射性示蹤劑應有相當高的比活度， 這是因為示蹤劑引入研究體系或機體后立即 被稀釋。如示蹤劑比活度太低，為滿足測量的要求，引入的化學量必定會大大超過生理劑量， 使實驗結果失去真實性。 另外，有些示蹤實驗中，要求使用無載體的示蹤

14、劑，尤其當所研究 的物質含量甚微時，載體的有無或其量的多寡，都能影響原有物質在體內的平衡。4 示蹤劑劑量的選擇主要依據標記化合物的放射性比活度、放射性核素的半衰期；標記化合物在研究系統中或機體內被稀釋的程度、利用率及在機體內的分布和排泄特點；實驗周期、測量儀器的探測效率和示蹤劑平安使用范圍等因素。一般要求在整個實驗中示蹤劑被稀釋后，樣品脈沖計數率應5倍于本底計數即可滿足要求見第一章。在實際工作中常用下式估算示蹤劑的劑量：ACE B 12. 2 DA為示蹤劑的比活度，B為本底計數，C為原示蹤劑的用量，D為稀釋倍數，E為探測效率。一般來說，小動物實驗的用量在7.418. 5 kBq 0.20. 5

15、卩Ci范圍內，更多的是在370 kBq 10卩Ci以下。離體實驗如細胞培養、切片保溫、酶反響等示蹤實驗，用量 可小于37 kBq (1卩Ci )。(5) 示蹤劑的給予途徑整體動物實驗的給藥途徑，和其他非放射性實驗一樣，不外 乎經口、靜脈、腹腔、皮下或肌肉注射。一般給藥量小，要求體積準確。應防止損傷或漏出 造成的污染。離體實驗要根據研究目的，嚴格控制引入示蹤劑的時間。(6) 樣品的采集與制備樣品的采集要有代表性；臟器采樣應固定解剖部位，同時要防止與其它他臟器和血液接觸造成污染。進行代謝研究時，動物要飼養在代謝籠內， 尤其是注射揮發性的放射性核素時，應有專門的氣體收集裝置。此外，還要注意的是樣品的

16、采集與 制備須在相同的條件下進行，以免帶來人為的誤差。(7) 放射性測量方法的選擇不同能量的射線應采用不同的測量方法，如丫射線的測量，主要選用碘化鈉晶體閃爍計數器。32P的測量可用G-M計數管，而目前多用液體閃爍計數器；而低能核素3H、14C那么用液體閃爍計數器或薄窗 G-M計數管進行測量；a射線可用 帶有硫化鋅晶體的閃爍計數器、電離室和核乳膠測量，也可用液體閃爍計數器測量。2 穩定核素示蹤實驗設計的根本要求(1) 核素的選擇可供示蹤實驗用的穩定核素有：2h、13c、15n、18 0。但由于合成方便和費用低，氘成為最常選用的核素。(2) 示蹤劑量與放射性實驗相比，穩定核素標記物的使用劑量較大。

17、有時采用化學 劑量，這在一些示蹤動力學實驗中應慎重考慮。(3) 豐度 示蹤實驗中不僅要求使用高純度的標記物，同時也要求使用高豐度的穩定 核素。豐度愈高，用量就愈小，可以防止過大劑量示蹤劑對機體生理狀態的影響。另外，豐 度高也能經得起最大限度的稀釋，并能提高實驗的準確性。此外，穩定核素示蹤實驗和放射性核素示蹤實驗一樣。要求盡量縮短從取樣到分析的時間，可防止同位素的“污染。再者，還應注意實驗中標記原子的喪失，特別在物質轉化研 究中更應給予充分的重視。二、示蹤實驗的根本方法示蹤實驗按照不同的實驗目的和實驗方式可分為兩大類：離體示蹤實驗和整體示蹤實 驗。(一)離體示蹤實驗(in vitro )它是指用

18、由整體中別離出來的簡單系統進行的實驗，如長期培養的細胞株、無細胞酶系統、短期孵育的細胞懸液或組織切片及灌流器官。 此類實驗主要用于揭示物質(包括大分子) 的轉化、精細的結構及神經遞質的釋放與攝取的關系。 所以在研究物質代謝、受體與配基相 互作用時，應首先考慮選用此類示蹤實驗。由于離體示蹤實驗的分析系統簡單、示蹤物和轉化物的濃度不會遇到運轉、排泄等因素的影響，所以，實驗結果準確性高， 分析方法也比擬簡單；同時離體實驗條件能夠人為地加 以控制，因此，它更適合于各種精細的分析研究。然而，離體實驗的條件明顯地不同于整體實驗，其實驗結論不一定能夠外推到整體情況。可見，對離體示蹤實驗的結果進行整體示蹤實驗

19、驗證是必要的。離休示蹤實驗根據示蹤劑的使用方法又分為兩種類型：1.恒量標記實驗多數離體示蹤實驗都是向實驗系統中參加過量的示蹤劑，實際消耗量極少，在整個過程中示蹤劑的濃度根本一致，分析結果時毋須考慮示蹤劑的濃度變化，故稱為恒量標記實驗。 此類方法常用于研究離子轉移規律和DNA合成速度等。2脈沖標記實驗這種示蹤實驗方法只允許被研究系統與示蹤劑接觸一個短暫時間，隨即將示蹤劑除去， 再繼續觀察。如細胞的增殖動力學研究和活性肽的代謝研究等。二整體示蹤實驗in vivo整體示蹤實驗是將標記物引入完整的機體內， 從體表或定期取樣研究標記物的運轉與分 布。這類實驗方法主要用于研究物質的吸收、 分布、轉運和排泄

20、等運動規律，或對某些生理 器官功能的研究。此類實驗方法雖不如離體示蹤實驗精細， 但卻能反映機體的實際生理情況。 因此，常用來對離體實驗結果進行驗證。整體示蹤實驗中，除吸收途徑研究外，通常采用靜脈注射引入示蹤劑小動物實驗常采 用腹腔注射。靜脈注射方式分一次性快速注射和恒速滴注兩種。示蹤劑的濃度在血液、組 織及代謝物中都呈現出時相變化圖12-1 ,圖12-2,這是機體內復雜代謝過程綜合影響的結果；血液中示蹤物的濃度不僅取決于它的吸收，也取決于它在體內的代謝轉化和排泄。甚至有的物質可能有體內反響如標記氨基酸進入蛋白質又分解出來。所以，在設計這類實驗時，必須同時考慮比照研究血液和組織中原示蹤劑與標記代

21、謝產物的放射性活度的變化。 在處理分析實驗數據時，還應作必要的復雜的數學運算。否那么難以得到正確的結果。tesis出時洞圖12-1靜脈一次性快速注射放射性示蹤劑在血液、組織、代謝圖12-2靜脈恒速滴注放射性示蹤劑在血液、組織、代謝物中的時相變化物中的時相變化三、示蹤實驗資料的整理與分析應指出由于示蹤示蹤實驗資料的整理和數據分析是整個實驗方案不可缺少的組成局部。 實驗的特點，必須在確保標記物起到真正的示蹤作用、 量具與探測儀精度高、嚴格控制各種 變異因素和測量數據可靠的前提下， 才能對示蹤實驗資料進行統計學分析處理。 具體的統計 分析處理方法見第一章，這里只強調了三個須注意的問題。一兩個計數率的

22、顯著性檢驗在放射性測量工作中， 經常比擬兩個計數率的差異，如比擬兩個樣品的凈計數率，或同一樣品兩次測量的計數率等。假設兩個計數率有差異時，首先應確定兩個計數率的差異不是由 放射性衰變所致，才能作出兩個計數率有差異的結論。工作中常用U檢驗方法進行判斷見統計學。二可疑值的舍棄在分析測量結果時，可能發現有的數據與均數的相差甚大，疑心是否能從泊松分布中獲得如此結果，便可用 十檢驗法或Chauvenet判斷標準等方法驗證。三誤差傳遞在放射性計數處理過程中，有的結果不是直接測量得到的，而是間接地由一些計數結果經加、減、乘、除等運算得到的。其中，每個計數結果都存在統計誤差，各原始測量數據的 誤差又會傳遞到最

23、終結果上。所以，在進行數據運算時應嚴格控制計算誤差。否那么，會影響最后的實驗結論。第三節雙標記示蹤實驗、雙標記示蹤實驗的原理與用途一雙抗記實驗雙標記示蹤是指用一種或兩種不同的核素標記不同種類的化合物、或同種化合物進行的示蹤實驗，這類實驗稱為雙標記實驗。二雙標記實驗的原理雙標記示蹤實驗的根本原理可概括如下：作為示蹤劑的兩種化合物分子，或一種分子的兩種形態如一種藥物的兩種劑型，或是一種分子的兩個基團，分別帶有標記原子，這兩種原子的放射性活度或質量的差異能被有效地分別測量出來，經統計分析找出它們轉化前后比值的變化，以說明被觀察的對象變化規律的異同。三雙標記實驗的用途雙標記實驗的用途廣泛，尤其是在物質

24、的代謝研究中，是單標記實驗無法取代的。此類實驗常被用來研究某一化合物分子上不同的原子或基團的各自代謝情況，觀察兩種相關化合物的吸收、分布、排泄等方面的異同；還可用來研究兩種代謝產物在代謝過程中的相互轉化。 此外，在藥物研究中，常需用雙標記實驗進行回收校正。由此可見，雙標記實驗是根底醫學研究中不可缺少的手段。二、雙標記示蹤實驗的設計和其他示蹤實驗一樣， 應根據實驗目的與要求進行實驗設計。因為實驗中涉及兩種不同的示蹤物。所以在實驗設計中應注意以下問題：一標記化合物大多數實驗不需要分子內雙標記示蹤物，而是用相互混合的兩種單標記物作雙標記實驗的示蹤劑。適合雙標記用的、成對的放射性核素有3H與14C、3

25、H或14C與32P、32P與45Ca、32P與125I、24Na與36Cl、55Fe與59Fe、125l與131l等。上述放射性核素不僅可發射出能量明顯不同 的3射線與電子e-,其半衰期也有較大的差異。近來，由于穩定核素分析技術的開展， 還可以采用放射性核素與穩定核素的雙標記物或兩種不同的穩定核素的雙標記物。二示蹤劑劑量的配比由于大多數實驗中采用兩種單標記化合物混合物，如何分配兩種標記物用量是實驗的關鍵。實驗中能有效地分別測量，首先取決于兩種標記原子放射出的射線的能量。有資料證明，液體閃爍計數器能同時測量能量相差4倍以上的兩種3 射線。然而高能核素標記的化合物，由于比活度太高也會影響低能核素測

26、量的精確度。因此，常在保持最小測量誤差的條件下，可按照兩種放射性核素各自的探測效率和在體內消失的速度去估算所需的用量，并應通過驗證確定兩者最適宜的劑量比例。三雙標記測量液閃探測技術是放射性核素雙標記示蹤實驗的重要測量手段，是利用液體閃爍計數器分辨能量的本領進行雙標記測量的。除此之外，也可利用雙標記核素半衰期的不同，或發射的射線類型不同，采用相應的儀器進行測量。對穩定核素的測量，常借助有機質譜儀來完成。第四節同位素效應問題一、同位素效應的概念在示蹤實驗中，由于使用的同位素質量的不同而引起物質轉化反響速度的變化，稱為同位素效應isotope effect。如在研究物質轉化時，由于被研究的物質分子中某一原子由它的同位素所取代，便可引起反響速度的變化，所以在示蹤動力學的更新速率研究中，同位素效應不可忽略。否那么會影響最終結果。氫的同位素效應研究較多，局部原因是因為氕H氘D和氚T的質量差異大，比擬容易觀察到較大的效應；另一方面是因為質子轉移反響在化學和生物學中普遍存在而且 具有十分重要的意義。 此外，氫又是