1、自發性高血壓大鼠視網膜微血管稀少與細胞凋亡                     作者：黃曉燕，陳碧新，高瞻，張明英，王賽斌，楊德業【摘要】  目的?：研究自發性高血壓大鼠(SHR)視網膜毛細血管細胞凋亡的發生情況，探討細胞凋亡與高血壓視網膜微血管病變之間的關系，為研究高血壓視網膜病變發病機制提供形態學依據。方法：10只雄性自發性高血壓大鼠(SHR組)和10只雄性正常血壓(WKY)大鼠

2、(WKY組)分別在13周齡和18周齡取眼球做視網膜消化鋪片，采用核苷酸末端轉移酶介導dUTP缺口翻譯法(TUNEL法)檢測視網膜微血管細胞凋亡變化情況，HE染色及圖像分析，動態觀察視網膜微血管形態的改變及測定視網膜毛細血管面積及密度的改變。結果：TUNEL法標記顯示SHR各周齡大鼠視網膜微血管均出現陽性反應細胞，且18周齡大鼠陽性細胞與13周齡大鼠比較明顯增多;WKY組大鼠視網膜微血管未見TUNEL陽性細胞。血管鋪片HE染色顯示SHR組部分毛細血管閉塞，內皮細胞和周細胞丟失，出現無細胞毛細血管，毛細血管密度較WKY組顯著降低。結論：在高血壓發展過程中，視網膜毛細血管內皮細胞和周細胞均可發生凋亡

3、，同時伴有微血管稀疏，細胞凋亡可能在高血壓視網膜病變的過程中扮演重要的角色。 【關鍵詞】  高血壓視網膜病;細胞凋亡;微血管稀少Abstract: ? Objective: To observe the apoptosis of retinal capillary cells in spontaneously hypertensive rats and study the relationship between apoptosis and hypertensive retinopathy， in order to provide morphological evidence of

4、hypertensive retinopathy. Methods: Experiments were performed on retinas from 13-week-old，18-week-old male SHR?(n?=10)?as experimental group(SHR13 W，SHR18 W)and sex-and age-matched Wistar-Kyoto rats?(WKY)(n?=10)?as control group. Specimens were obtained using terminal deoxynucleotidyl transferase-me

5、diated dUTP nick end labeling?(TUNEL)?methods to detect the apoptosis of retinal capillary cells， using hematoxylin and eosin?(HE)?staining to observe the changes of retinal microvascular in morphology and determinate the retinal capillary area density. Results: Apoptotic cells labelled by TUNEL wer

6、e emerged in SHR groups，including 13-week-old and 18-week-old. Apoptotic cells in 18-week-old SHR were significantly more than in 13-week-old SHR. No cell apoptosis was noted in each of WKY group. The level of apoptosis gradually increased as the weeks of age increasing in SHR， HE showed that some o

7、f capillary was occlusion， endothelial cells and pericytes lost，a large area of cell-free capillary was emerged. Compared with control group，the retinal capillaries area density of SHR was significantly lower than that of the WKY groups. Conclusion: Apoptssis of the endothelial cells and pericytes o

8、f the retinal capillary all can occur in the development process of hypertension，at the same time microvascular rarefaction can accompany. Apoptosis may play an important role in the development of hypertensive retinopathy.Key words: ? hypertensive retinopathy;apoptosis;capillary;microvascular raref

9、action在我國高血壓病人群中，高血壓性視網膜病變的陽性率為70%左右，其所致眼底血管的改變基本上與高血壓3個時期的變化相一致，在一定程度上能反映體內動脈的情況，對判斷高血壓病的嚴重程度和預后有一定的價值1。有關高血壓性視網膜病變的發病機制尚未明了，其微血管結構改變大多是通過檢眼鏡或眼底熒光素血管造影觀察到的，如江時森等2通過墨汁灌注法觀察到自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)視網膜微動脈存在微血管稀少現象，但在這一病理過程中，視網膜微血管病變是否與細胞凋亡有關鮮見報道。近年來，隨著視網膜微血管消化鋪片技術的應用，使直接觀察視網膜微血管的

10、形態學變化成為了可能。本研究應用視網膜消化鋪片，HE染色直接觀察視網膜微血管的形態學特征，并對微血管進行定量分析，同時采用TUNEL法特異性標記來觀察13周齡和18周齡SHR視網膜毛細血管細胞凋亡情況，旨在探討細胞凋亡與高血壓視網膜微血管病變的關系。1?材料和方法1.1?動物模型和試劑?雄性SHR和正常血壓大鼠(Wistar-Kyoto，WKY)各10只(其中13，18周齡各5只)，由上海中科院實驗動物中心提供。大鼠飼養在溫州醫學院動物中心的標準化飼養房，飲自來水，標準飼料喂養，生活在晝夜節律為12 h、保持一定溫度和濕度的空間。原位細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Roche公司。顯色劑為DAB，購

11、于福州邁新生物技術有限公司。1.2?血壓測定及眼底拍照?用0.35%戊巴比妥麻醉大鼠后，在安靜狀態下用計算機化多導生理記錄儀間接測定鼠尾動脈收縮壓，同時在裂隙燈下觀察各組大鼠眼底動脈情況，拍照。1.3?視網膜血管消化鋪片的制備?過量麻醉處死大鼠，用新鮮配制的4%多聚甲醛心臟灌流固定后摘除眼球，將眼球置于4%多聚甲醛中4 24 h。在顯微鏡下自角膜緣后0.5 mm處剪開眼球，去除眼前節和玻璃體，剝離視網膜，將其放入3%胰蛋白酶溶液內，37 孵育23 h，消化神經組織，然后在蒸餾水中輕輕吹打，僅留一薄層透明的視網膜血管網，將其貼于潔凈的載玻片上，自然干燥，待染色。1.4?視網膜血管形態學改變觀察?

12、將制備好的消化鋪片進行HE染色，光鏡下觀察視網膜血管形態學改變，各組大鼠選5張切片，每張切片計數5個高倍視野(×400)，應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，測定視網膜毛細血管面積密度，毛細血管面積密度(%)=毛細血管總面積/視網膜總面積。1.5?TUNEL標記法?將視網膜消化鋪片按照ROCHE公司提供的TUNEL試劑盒說明書進行原位缺口末端標記檢測。樣本先用0.01 mol PBS緩沖液浸洗2次各5 min后再按照試劑盒說明書進行。陰性對照：用50L指示液代替TUNEL反應液;陽性對照：實驗前用Dnase-1消化組織(室溫30 min)以打斷所有細胞DNA鏈，余步

13、驟同前;各步驟后均用0.01 mmol PBS緩沖液浸洗樣本5 min×3次。普通光鏡下觀察細胞凋亡，陽性染色隨凋亡程度的不同呈淺棕至深棕褐色，定位于胞核，根據下列標準3確定著色陽性細胞為凋亡細胞：單個散在分布;具有凋亡的核形態(核固縮或染色質濃聚附邊或核碎裂);周圍無炎癥反應。對于缺乏凋亡核形態的陽性細胞，除非染色強度與背景有鮮明對比，且呈單個分布，否則不認為是凋亡細胞4。非凋亡細胞呈紫藍色，為陰性。1.5?統計學處理方法?兩組間比較采用t檢驗。2 結果2.1?各組大鼠鼠尾動脈收縮壓變化?13周齡與18周齡SHR收縮壓分別為(148.8±9.9)mmHg、(154.4&#

14、177;17.9)mmHg，WKY分別為(75.9±3.2)mmHg、(75.7±5.9)mmHg，相同周齡SHR組血壓與WKY組比較差異均有顯著性 (P?<0.01)，兩組組內不同周齡比較，差異均無顯著性(P?>0.05)。2.2?眼底檢查?可見眼底動靜脈由視乳頭分出后呈放射狀，與人眼底不同，無動靜脈交叉，無黃斑結構。對照組眼底未見異常(見圖1)，SHR組13周齡和18周齡均可見視網膜動脈變細，管徑不規則，管壁反光增強，靜脈迂曲擴張，視網膜水腫，反光增強，未見到片狀出血點(見圖2)。根據Reith- Wagener的4級分類法，相當于高血壓眼底第I、第II級的

15、改變。2.3?視網膜血管形態學改變?光鏡下，WKY組毛細血管網管徑粗細均勻一致，內皮細胞和周細胞均勻分布，內皮細胞核呈橢圓形，位于毛細血管中央或稍偏位，較周細胞略大，與血管平行;周細胞核呈短橢圓形、圓形或三角形，位于毛細血管壁的側面，稍突出于血管壁(見圖3)。SHR組血管管徑粗細不均，周細胞和內皮細胞分布不均勻，部分毛細血管結構已破壞，13周齡 SHR部分毛細血管閉塞呈細線狀(見圖4)，18周齡SHR除了部分毛細血管表現為血管管腔閉塞外，其間無內皮細胞及周細胞影，血管腔完全閉鎖，即無細胞毛細血管形成(見圖5)。13周齡與18周齡SHR毛細血管面積密度分別為(0.3720±0.0239)、(0.2840±0.0336)，WKY分別為(0.5240±0.0422)、(0.4940±0.0207)，SHR組毛細血管面積密度顯著低于