1、薄荷油致小鼠肝毒性時-量關系及其機理研究                  作者：劉紅杰，金若敏，張文斌，齊雙巖，龐惠芳，周志蘭【摘要】  目的研究薄荷油致小鼠肝毒性的量效、時效關系及自由基損傷機制。方法小鼠口服不同劑量薄荷油，測定其LD50。另取小鼠按不同劑量或不同時間點分組，檢查血清ALT等肝功能指標和肝組織形態變化，測定肝組織SOD，MDA。結果小鼠口服薄荷油的LD50為3.0 ml/kg。ALT等肝功能指標在

2、給藥后2448 h達到高峰，72 h可恢復近正常值。與正常組相比，薄荷油中、高劑量組對肝組織損傷顯著，隨著劑量增大，ALT等肝功能指標升高顯著(P<0.05或P<0.01)。薄荷油組與正常組比較，小鼠肝組織中SOD降低而MDA升高(P<0.05)，與四氯化碳相似。結論小鼠一次性口服大劑量薄荷油可造成急性肝損傷甚至死亡，并顯示有毒性時效、量效關系；自由基損傷可能是其肝毒性機制之一。 【關鍵詞】  薄荷油 小鼠 肝毒性 時間劑量毒效 機理Abstract:ObjectiveTo study the time-dose effects and free radical m

3、echanism of peppermint oil on liver damnification in mice. MethodsThe medial lethal dose(LD50) of mice was determined when they took a different dose of peppermint oil orally. After other mice were divided into different groups according to different dose or time, hepatic functional parameters in se

4、rum were examined for example alanine aminotransferase(ALT) and so on. The morphologic change of hepatic tissues were observed, and superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) of hepatic tissues were detected .ResultsThe orally LD50 of peppermint oil was 3.0 ml/kg. Hepatic functional paramete

5、rs in serum reached to the max at 2448 hours after being intervened, which recovered close to normal values at 72 hours. Compared with that of the control group, hepatic tissues of the high and medium dose groups were damaged significantly, and hepatic functional parameters in serum advanced signifi

6、cantly (P<0.05 or P<0.01). SOD of hepatic tissues of mice taking peppermint oil was low and MDA of that was high compared with that of the control group, which was similar to that of carbon tetrachloride.ConclusionAcute toxicity even death may occur when mice take a large dose of peppermint oi

7、l once orally. Timedosetoxicity effects would be indicated. Free radical damnification might be one of the liver injury mechanism of peppermint oil.Key words:Peppermint oil;  Mouse;   Liver damnification;  Timedosetoxicity effects;   Mechanism薄荷油peppermint oil系從唇形科植物薄荷(

8、Mentha hap loca lyx Briq.)中提取的揮發油，在食品、藥品、護膚、洗發等領域被國內外廣泛應用。國內外曾報道服用大劑量薄荷油可致中毒13 ，本實驗對薄荷油致小鼠肝毒性的時效、量效關系進行了研究，并對其可能存在的自由基損傷機理進行了初步探討。現報道如下。1  器材1.1  動物KM小鼠，清潔級，雌雄各半，（20±2）g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK(滬)20030003。1.2  藥物花生油，山東魯花集團有限公司生產，批號20041231。100%薄荷油，上海香料總廠購買，批號20041207，按照藥典2000版標準

9、生產，相對密度0.8880.908，含酯量按醋酸薄荷酯(C12H22O2)為2.0%6.5%(g/g)，含總醇量按薄荷腦(C10H20O)計算不少于50%(g/g)。四氯化碳，分析純，北京化工廠生產，批號20010925。實驗前以花生油將薄荷油與四氯化碳配制成所需濃度(V/V)。1.3   試劑總膽紅素（TB）試劑1，批號 KF908；TB試劑2，批號 KF914，均由和光純藥株式會社 (WAKO)生產。堿性磷酸酶（ALP）試劑，批號ZG5002；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑，批號ZG5001；天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑，批號ZG3004，均由濟南希森美康醫用有限公

10、司(sysmex)生產。SOD檢測試劑盒，批號20060629；MDA檢測試劑盒，批號20060530，均由南京建成生物工程研究所提供。1.4  儀器奧豪斯電子天平SR6010，奧豪斯國際貿易上海有限公司生產；全自動生化分析儀HITACHI7020，日本HITACHI公司生產；系統顯微鏡BX51/BX52，日本奧林巴斯光學株式會社生產；全能型脫水機，徠卡公司生產。722型可見分光光度計，上海精密儀器有限公司生產。2  方法2.1  口服半數致死量(LD50)測定取小鼠70只，雌雄各半，隨機分為7組，每組10只。6個給藥組在3.72.2  ml/kg之間按

11、照等比級數(0.9)確定6個給藥劑量。各給藥組按0.1 ml/10 g灌胃1次，正常組同時灌服等容量花生油。連續觀察14 d。觀察并記錄給藥后的一般狀況和死亡情況，死亡小鼠肝臟剖解后肉眼觀察。2.2   口服“時間毒效”關系研究取小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，按處理時間點依次為0 ，6 ，12 ，24，48 ，72 h組。按0.1 ml/10 g灌胃1次，0 h組小鼠灌服花生油，其余各組灌服23%薄荷油。于相應時間點稱量小鼠體重，摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，以全自動生化分析儀測定血清TB，ALP，ALT，AST。摘取小鼠肝臟，稱重并計算

12、肝臟指數4。2.3  口服“劑量毒效”關系研究取小鼠48只，雌雄各半，隨機分為4組，即正常組和薄荷油低、中、高劑量組。按0.1 ml/10 g灌胃1次，正常組灌服花生油，薄荷油各劑量組分別灌服9%，15%，23%的薄荷油。48 h后，按“2.2”方法測定血清TB，ALP，ALT，AST，計算肝臟指數。另取一部分肝組織，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察其組織形態學變化。對肝組織形態進行病理分級、積分5：肝組織結構正常，無明顯變性、壞死及炎癥細胞浸潤(0)，0分；肝小葉結構尚正常，可見明顯的混濁腫脹、氣球樣變或脂肪變性，散在點狀壞死()，1分；肝小葉結構不清，可見明顯的灶狀壞死，伴有炎癥細

13、胞浸潤()，2分；肝小葉結構不清、可見明顯的片狀壞死,伴有炎癥細胞浸潤(+)，3分；壞死細胞彌漫性存在于肝小葉中央，層次較多，伴有炎癥細胞浸潤(+)，4分。2.4   肝毒性的自由基損傷機理研究取小鼠40只，雌雄各半，隨機分為正常組、薄荷油24 h組、薄荷油36 h組、四氯化碳組。按0.1 ml/10 g灌胃1次，正常組灌服花生油，薄荷油組灌服23%薄荷油，四氯化碳組灌服5%四氯化碳。給藥24 h后，摘取正常組、薄荷油24h組、四氯化碳組小鼠肝臟；給藥36 h后，摘取薄荷油36 h組小鼠肝臟。按試劑盒說明書操作，分光光度計于550 nm波長處測定樣品吸光度，計算SOD活力；

14、于532 nm波長處測定樣品吸光度，計算MDA含量。2.5   統計方法Bliss法計算LD50，LD10和LD1。Radit法對肝組織病理積分的數據進行統計分析。計量資料采用±s表示，使用SPSS13.0軟件進行統計處理，兩組間比較采用t檢驗法，多組間比較采用單因素方差分析法。P<0.05為差異有顯著性。1         3  結果3.1  口服LD503.3  口服“劑量毒效”關系3.4   肝毒性的自由基損傷機理小鼠1次口

15、服2.3 ml/kg薄荷油24 ，36 h后，肝組織SOD降低而MDA升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.05)，其變化與四氯化碳組相似。結果見表4。表4  小鼠1次口服薄荷油對肝組織SOD、MDA的影響（略）4  討論薄荷油應用非常廣泛，但對其毒性研究并不多。Ilene B. Anderson等1報道了4例服用薄荷油中毒的病例，并回顧了既往中18例服用薄荷油中毒的病例，這些病例的中毒主要表現在中樞神經系統、肝和腎方面。陳光亮等2在小鼠薄荷油急性毒性實驗中，觀察到中樞神經系統毒性，其腹腔注射LD50為（1144.9±78.5）mg/kg(根據薄荷油相對密

16、度折算為1.3 ml/kg左右)。Vo LT等3在離體實驗中發現，0.5 microL/mL薄荷油可以導致離體培養的人肝臟細胞死亡。由于薄荷油多用于口服，因此為了更安全使用薄荷油，了解其口服毒性特點及其機理，對其進行毒性研究是非常必要的。    本實驗對小鼠薄荷油LD50研究顯示：小鼠口服大劑量薄荷油后可出現步履蹣跚，行走易向一側摔倒等神經系統的毒性反應，還能對肝臟造成一定損傷；本實驗小鼠口服薄荷油的LD50為3.0 ml/kg左右，與陳光亮等的報道有較大差異，這可能是由于給藥途徑不同造成的，而口服給藥是臨床最常用的給藥途徑，藥典規定，成人口服薄荷油一日不超過0.

17、6 ml6，即小鼠的口服LD50，LD1大約分別相當于成人常用量的300倍，170倍左右。本實驗對薄荷油致小鼠肝毒性時-效關系的研究顯示：小鼠口服2.3 ml/kg的薄荷油后，血清TB，ALP， ALT，AST等肝功能指標隨時間推移逐漸增高，在2448 h達到高峰，然后逐漸下降，72 h時可恢復近正常；肝臟指數也呈現同樣的變化趨勢。量效關系的研究顯示：小鼠一次口服中劑量的薄荷油，即可出現血清ALP升高、肝細胞水腫等變化；一次口服高劑量的薄荷油，不僅血清ALP，ALT，AST和肝臟指數等指標全面升高，而且肝細胞還可出現嚴重水腫、脂肪變性、灶性壞死、片狀壞死等改變；而小鼠口服低劑量的薄荷油，則未見

18、對肝臟有明顯影響。這表明，服用薄荷油超過一定量后，可導致急性肝損傷，損傷可表現為肝功能甚至肝組織病的改變，并呈現明顯的量效關系，損傷高峰出現在服藥后2448 h。本實驗還對薄荷油肝毒性機制在自由基損傷方面作了初步研究。如果大量的自由基在肝細胞內產生，即可攻擊脂質、蛋白質及核酸的雙鍵結構，激發脂質過氧化物，導致質膜損傷。當細胞質膜受損時，膜通透性發生改變，存在于胞漿或線粒體內的ALT，AST釋放到血液中，使血中ALT，AST活性升高。如果受損質膜完全失去完整性，細胞內容物傾出，可導致細胞死亡。測定肝組織SOD和MDA的含量可間接反映其脂質過氧化反應的程度及細胞損傷程度。在小鼠口服薄荷油的毒性高峰期，SOD顯著降低而MDA明顯增高，光鏡下可見肝細胞水腫、變性、壞死等改變，由此推測：在薄荷油導致的肝細胞病理變化中，過氧化損傷可能是其機制之一，在這方面與四氯化碳的肝毒性機理極為相似。薄荷油在日常生活及臨床上應用較多，一般認為是無毒的。但本文研究結果表明，本品一次服用大劑量本品可產生明顯的急性毒性，