1、基因診斷在遺傳病監測中的應用 目前發現人類遺傳性疾病有3 000多種，如果僅依靠以往的染色體分析技術或對基因產物與代謝物的測定，我們只能對其中為數極少的一部分疾病在發病前或產前進行診斷。因為許多基因的表達有時相性和組織特異性（如有些基因在胎兒早期并不表達、苯丙氨酸羥化酶只在肝組織中表達）。用常規的方法采集的胎兒標本或其他人體材料，常常不能測出這些基因的產物或代謝產物。然而，作為構成機體基本單位的細胞，無論其來自何種器官或組織，它們的基因組成卻是完全一致的；雖然在某些特異化的組織細胞中某些基因并不表達，但那些基因的突變卻存在于一切細胞之中。如果采用基因分析的方法進行監測，在個體發育的任何階段，以

2、任何一種有核細胞為檢材，基因的缺陷都能被監測出來。這就是近十幾年來飛速發展的重組DNA技術給遺傳病的早期（癥狀前和出生前）診斷帶來的福音。重組DNA技術不僅極大地豐富了我們對人類遺傳病分子病理學的知識，而且同時也提供了從DNA水平對遺傳病進行基因診斷的手段。自從1978年發現第一個限制酶切位點多態性并應用于遺傳病（鐮形細胞貧血）的基因診斷以后，能夠進行基因診斷的病種不斷增加，方法和途徑越來越多。 一、基因突變的類型造成基因突變的原因很多，有自發的也有外界理化因素的影響。從DNA序列改變的角度來看，不外乎單核苷酸的取代和DNA片段的插入或缺失兩大類型。所產生的后果取決于突變發生的位置和性質，只要

3、影響了基因表達過程中的任何一個環節，都會導致遺傳性疾病。歸納起來如表1所示表1 基因突變及效應一覽表 DNA序列的改變突變發生的部位mRNA水平的表現基因產物的改變 舉 例1.大片段缺失或插入 整個基因缺如缺如地中海盆血 基因片段異常功能缺陷DMD、BMD2.少數核苷酸的缺失或插入 外顯子與內含子接界拼接異常缺如 3的整數倍外顯子縮短或延長異常（氨基酸缺失或插入）Hb Leiden非3的整數倍外顯子縮短或延長異常（移碼突變）地中海盆血3.單核苷酸取代 啟動子減少減少地中海盆血 剪接信號剪接異常缺如地中海盆血 PolyA信號不穩定減少地中海盆血 密碼子中性突變正常 密碼子錯義突變氨基酸取代異常血

4、紅蛋白 密碼子或內含子剪接異常缺如或移碼突變地中海盆血 密碼子無義突變肽鏈提前終止地中海盆血 終止密碼 肽鏈延長，量減少Hb Canstant spring起始密碼地中海盆血缺如地中海盆血二、遺傳病基因診斷的途徑在了解了基因突變的各種類型之后，對應用何種方法來診斷它們便很容易理解了。例如某種遺傳病是由于基因缺失造成的，可通過監測受檢者是否缺失該基因來直接判斷其基因型。如果某遺傳病是核苷酸取代造成的點突變，便可以通過監測該突變的方法（ASO探針或酶切位點監測）來進行診斷。如果致病突變或病因還不清楚，但有相關的基因探針或已知其與某位點的RFLP緊密連鎖，便可進行家系分析，通過該位點狀態的連鎖分析進

5、行監測。下面根據不同的情況，舉例說明基因診斷中常用的方法。1.直接監測 （1）應用基因探針或PCR進行缺失型基因監測 部分地中海貧血和三分之二以上的杜氏及貝氏進行性肌營養不良（DMD及BMD）是整個基因或基因片段的缺失造成的。應用基因探針（基因組DNA或cDNA探針）進行Southern印跡雜交，如果某些雜交片段消失或片段長度改變（不是由于限制酶識別位點的改變造成的RFLP），即可判定受檢者有基因缺失。應用近年來發展起來的PCR技術，也可進行缺失基因的監測。根據缺失發生區域的DNA序列，合成一對引物進行基因擴增（反應體系中必須包含有另一無關DNA片段的擴增引物，作為反應是否成功的內對照），通過

6、凝膠電泳檢查，如果沒有擴增片段，便說明該基因或該DNA片段缺失，對地中海盆血中的Hb Bart水腫胎兒的產前診斷和DMD/BMD的產前基因診斷都是應用此法進行。（2）造成特異限制酶切位點改變的突變基因的監測 有時，某些“點”突變（一般為單個核苷酸的取代或少數幾個核苷酸的缺失或插入）正好影響了某種限制酶的識別位點（丟失或增加），對這些與基因突變相關的酶切位點的改變，可用來進行突變基因的直接監測。例如珠蛋白基因密碼子6處有一Mst的識別位點（CCTGAGG），而在HbS病人的珠蛋白基因，因其密碼子6由GAG（谷氨酸）突變為GTG（纈氨酸），破壞了Mst的識別序列。使得正常的兩個雜交片段（1.15k

7、b,0.2kb）消失，而出現一個異常的1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。許多實驗室應用-S基因的這個特異標志，直接用Mst酶解珠蛋白基因相應區域的PCR產物進行HbS病的產前基因診斷。（3）突變位點特異性監測ASO探針斑點雜交 絕大多數“點”突變不改變酶的識別位點，但經DNA序列分析明確基因的突變的細節之后，可人工合成針對突變位點的特異寡核苷酸（allele specific oligonucleotide,ASO）探針，進行突變基因的直接監測。ASO探針的長度一般為19個堿基，分別與被測定的突變所在區域的正常和異常DNA序列互補。在一定的雜交和洗脫條件下，只要有一個堿基不匹配，

8、就不能形成穩定的雜交鏈，正常探針只能與正常基因序列雜交而不能與突變基因的序列雜交，反之亦然。1983年Conner等首先應用ASO探針進行鐮形細胞貧血的基因監測，現在已廣泛應用于地中海貧血及其他遺傳性疾病的基因診斷。PCR技術的發明使ASO探針的使用更加快速簡便。用PCR產物進行斑點雜交，不僅降低了同源序列的背景干擾，而且降低了對探針放射強度的要求?？梢杂梅欠派湫晕镔|進行探針標記，操作安全，并且不受同位素半衰期的限制。目前對地中海貧血、經典型PKU等基因的診斷，都是應用此途徑。2.間接分析監測致病基因RFLPs連鎖分析 進行限制酶切片段長度多態性（RFLP）連鎖分析，目前還是施行基因診斷的主要

9、手段。對于遺傳性疾病，目前了解其病因的只是其中的一小部分。即使對那些已經知道了結構基因的遺傳病，由于其致病突變的細節（即核苷酸序列的改變）一時還不了解，還不能合成相應的寡核苷酸探針進行PCR/ASO監測。更不用說那些目前連其遺傳缺陷的生化機理尚不明確的遺傳性疾病了。對于這一類基因缺陷的監測，只能通過間接的途徑，即應用RFLP連鎖分析進行基因診斷。一般說來RFLP分析所監測到的DNA多態性通常是中性突變，與基因的致病突變之間不存在連鎖不平衡性，因此一個多態位點存在與否并不說明基因是否異常。只有在特定的家系中才具有一一對應的關系。多態性位點在基因連鎖分析中的應用價值，除了它與致病突變之間連鎖的緊密

10、程度以外，還與它的雜合頻率有關。連鎖越緊密所得結果越可靠；雜合頻率越高應用價值越大。我們用多態性信息量（polymorphism information contents,PIC）來衡量，PIC是指某一家系可以利用RFLP作為遺傳標志進行基因連鎖分析的概率；就整個群體而言，它是指在群體中利用這些RFLP進行基因診斷的診斷率。有時單單分析一個多態性位點，還不能將某一家系中的致病基因所在染色體與正常染色體區分開來，必須分析多個位點的狀態，綜合起來才能獲足夠的信息。我們將一條染色體上兩個或兩個以上與致病基因密切連鎖的多態性位點狀態的組合叫作染色體單倍體型（haplotype）。無論是何種遺傳性疾病，

11、只要有與之密切連鎖的RFLP位點（基因本身或鄰近的DNA序列），便可應用核心家系成員（先證者及父母）的DNA進行RFLP分析，確立致病基因所在染色體與RFLP位點狀態的連鎖關系。但只有在那些連鎖關系明確、正常與異常染色體能夠區別的家系中，才能對家系成員進行癥狀前或產前基因診斷。（1）應用基因探針進行RFLPs分析 應用基因探針（基因組DNA或cDNA探針）所監測到的RFLP位點在基因的內部或基因附近，它與基因突變位點之間連鎖非常緊密，通常情況下很少發生重組（除非基因本身非常龐大，如抗肌萎縮蛋白基因，2300kb），因此非?？煽俊NA序列已經明確的基因內或旁側序列中的酶切位點的多態性狀況還可以

12、用PCR方法來監測。PCR擴增后用相應的限制酶來酶解擴增產物，通過瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段是否被酶解成小片段；或者將PCR擴增產物進行ASO斑點雜交判斷基因座的狀態。用基因探針直接和間接分析法可診斷的遺傳病見表2和表3。表2 用RFLPs直接分析法可診斷的遺傳病（不完全統計） 遺傳病基因探針軟骨發育不全型膠原蛋白腎上腺皮質增生癥類固醇21羥化酶淀粉樣多發神經病變前白蛋白抗凝血酶缺乏癥抗凝血酶Ehlers-Danlos綜合征1(1)膠原蛋白 第10因子缺乏癥第10因子A型血友病第8因子及合成寡核苷酸B型血友病第9因子高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體HPRT缺乏癥HPRT免疫球蛋白k鏈缺乏癥免疫球

13、蛋白CkLesch-Nyhan綜合征HPRTMarfan綜合征微纖維元基因FN1型成骨不全原1（1）膠原蛋白地中海貧血珠蛋白 珠蛋白合成寡核苷酸抗胰蛋白酶缺乏癥合成寡核苷酸DMD、BMD抗肌萎縮蛋白基因表3 用RELPs間接分析法可診斷的遺傳病(不完全統計) 遺傳病基因探針淀粉樣變性前白蛋白1抗胰蛋白酶缺乏癥1抗胰蛋白酶載脂蛋白C缺乏癥載脂蛋白C動脈粥樣化載脂蛋白A型生長激素缺乏癥生長激素A型血友病第8因子B型血友病第9因子甲狀腺機能低下甲狀腺球蛋白高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體基因高脂血癥載脂蛋白A高甘油三酯血癥載脂蛋白ALesch-Nyhan綜合征HPRT苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶地中海貧血珠

14、蛋白血栓形成抗凝血酶DMD、BMDPERT87-8 P20（2）應用染色體DNA片段作探針進行RFLPs分析 除了基因探針之外，還有一些探針是基因組DNA片段。這些從基因組文庫中分離獲得的DNA片段，在確定了其能監測出某些限制酶的RFLP后，便可用作探針的候選者。經過染色體定位，大致判定其是否與目前已知的遺傳性疾病有連鎖關系，然后再通過對此遺傳性疾病家系的RFLP連鎖分析和優勢對數計分（Lod score），確定是否密切連鎖。如是，便可用作基因分析以至基因診斷的探針，如-3HVR序列用于APKD的基因分析（表4）。表4 用DNA片段為探針監測的遺傳?。ú煌耆y計） 遺傳病 基因探針腎上腺白質營

15、養不良（adrenoleukodystrophy）Stl4成人型多囊腎珠蛋白遺傳性腎炎DXS3 DSS1纖維囊性變LAM4-917脆X綜合征第9因子5q-綜合征C-fmsBechwith-Wiedmann綜合征第11號染色體DNA片段貓叫綜合征第5號染色體DNA片段成視網膜細胞瘤綜合征第13號染色體DNA片段Wilms瘤第11號染色體DNA片段Wolf-Hirschhorn綜合征第4號染色體DNA片段Huntington舞蹈病G8通過RFLP連鎖分析，還可進行反向遺傳學的研究，即尋找那些目前尚未獲得的致病基因的DNA序列及其基因產物。某些遺傳病的致病基因（進而正?；颍┚褪峭ㄟ^這個途徑被揭示出

16、來的，如DMD/BMD、囊性纖維變。PCR/ASO分析方法與RFLP連鎖分析比較，它具有直接、簡化、快速、不需家系分析、用材少等優點，更適用于產前基因診斷。但要對一種遺傳病的診斷達到如此的地步，要經過一段漫長而曲折的路。對于遺傳病的基因分析，總是先從臨床家系分析入手，了解它的遺傳規律，通過與其他遺傳標志的連鎖關系或伴隨發生的染色體缺陷，進行基因的染色體定位，再從染色體基因圖上尋找合適的連鎖的RFLP探針，進行染色體步行（chromosome walking）或染色體跳躍（chromosome jumping），獲得新的連鎖更緊密的RFLP探針，最后獲得基因DNA片段本身。隨后再進行DNA或相應

17、的cDNA序列分析，明確基因的細微結構及突變基因的致病突變細節，到此才有可能合成相應的PCR引物和ASO探針（或者監測基因內或近旁的RFLP位點用的PCR引物及探針）。才有可能簡化基因分析的程序。三、血友病的產前基因診斷舉例血友病是遺傳性凝血疾患中最為常見的一種，是由凝血因子的缺陷引起的。為X-連鎖隱性遺傳。根據因子缺陷的類型不同，血友病主要有甲、乙兩型。甲型血友病系由血漿中凝血因子（F）活性缺陷所致，約占全部遺傳性凝血疾病的75%。乙型血友病是因凝血因子（F）缺陷所致，發病率約為甲型的20%。也有F、F同時缺陷的，但不常見，稱為甲乙混合型血友病。1.血友病甲的臨床表現 血友病甲又稱經典型血友

18、病，發病率約為1/10 000男性。女性患者極為少見。血友病患者多有家族史，新生突變者大約占20%30%。甲型血友病臨床表現為凝血困難及自發性出血傾向，如頻發的關節及軟組織出血，以大關節、下肢關節及其附帶肌群出血為常見。患者發病早，自兒童期即有表現，出血頻度及嚴重程度與血漿中F活性水平相平行，50%患者血漿F活性水平僅為正常人的1%5%，臨床表現較嚴重。其余患者的F活性浮動于正常值的5%20%之間，表現較輕。有些患者，其F水平可達正常的25%50%，幾乎沒有臨床癥狀，只是在外傷或手術時才發現有凝血障礙。這種異質性可能與基因的缺陷類型不同有關。對于血友病的治療主要靠輸血療法。長期反復的輸入全血或

19、凝血因子，經濟上是一筆可觀的負擔；同時輸血反應也是不可忽視的副作用，如免疫反應、特別是目前引人注目的血源性病毒感染如AIDS、乙肝等疾病。此外邊遠地區有限的醫療條件或突發無援的創傷所造成的對生命的威脅，亦使人們去尋找新的有效途徑來施行產前基因診斷，配合選擇性人工流產以控制患兒出生。曾經采用血液學和免疫生物學指標進行患者診斷、攜帶者的檢出，及應用胎兒鏡采集胎兒血進行F的分析進行產前診斷。但這些方法或是準確性差或是取血風險大，已經被淘汰。1984年，國際上首次報告了應用DNA RFLPs分析方法進行甲型血友病的基因診斷。此法除可進行胎兒的產前基因診斷外還可進行基因攜帶者的監測，風險小、準確率高，因

20、此迅速被人們廣泛采用。2.凝血因子的基因缺陷 F基因位于Xq28，在Deuteran色盲基因和G6PD基因附近。F基因全長約186kb,由26個外顯子和25個內含子組成。其外顯子長度從69bp到310bp不等，內含子長度變化于207bp32.4kb之間。F mRNA約長9kb,cDNA長9 009bp,5非翻譯區長150bp，3非翻譯區長1 806bp。產物由2 351個氨基酸組成，N端19個氨基酸為信號肽。成熟的F含2 332個氨基酸，分子量為264 763。分子可分成三個不同的結構域（A，B，C）：A1-A2-B-A3-Cl-C2。因子活化時，B結構被水解。通過DNA序列分析，發現了不同類

21、型的點突變（表5），這些突變基因的產物可能是不完整的、無活性的或不穩定的F肽鏈，因而臨床表現為輕重不一。表5 F基因的點突變類型 mRNA加工信號突變IVS-2CT,TCIVS-25AG無義突變1 941 ArgTermCGAUGA2 209 ArgTermGGAUGA2 166 ArgTermUGA2 307 ArgTermUGA錯義突變291 GluGlyGAAGGA2 228 ArgGlnCGACAA此外還有些致病基因是基因片段缺失的結果但是大部分甲型血友病基因的突變細節仍不清楚，對這些基因的產前診斷只能靠RFLPs連鎖分析。3.甲型血友病的產前基因診斷 應用印跡雜交技術進行RFLPs連

22、鎖分析 在F基因內及其旁側有多組RFLPs位點可供產前診斷（表6）。國內沈巖等人應用一系列探針（表7）對中國人F基因進行了RFLPs分析（表8），發現了一組新的Stl4/Bct多態性位點，并成功地進行了甲型血友病的產前基因診斷。表6 F基因內及其旁側的RFLPs 限制酶位點探針片段長度（kb）及頻率Bcle18P114.120.88(0.71)/1.77(0.29)Bgle26P1.85(0.74)/20(0.26)HindIVS-19 2.6(0.30)/2.7(0.70)Mspe26下游 7.5(0.68)/4.3+3.2(0.32)XbaIVS-19P482.64.8(0.59)/9.6

23、(0.41)BglDXS15DX132.8(0.5)/5.8(0.5)TaqDXS52St14-16.6(0.005)/5.4,5.2(0.045) 4.8(0.12)/4.5(0.36)/4.1,4.0(0.205) 3.9(1.105)/3.6(0.005)/3.4(0.155)表7 進行甲型血友病基因分析所用的探針 質粒名稱抗性宿主菌載體插入位點插入片段（kb）探針片段長度（kb）p114.12AmpJM 101pUC12Stu/Sac0.65BamH/Sac 0.65p482.6AmpHB 101pUC8EcoR9.6EcoR/Sac 1.1St14-1Amp,TetHB 101pBR

24、322EcoR3.0EcoR 3.0DX13AmpHB 101pSP64EcoR2.2EcoR 2.214-E18AmpJM 101pUC18Sma/Hinc0.65/0.8EcoR/Hind 1.45pY3.4Amp,TetHB 101pBR322EcoR3.4EcoR 3.4表8 中國人F基因內及其旁側RFLPs 位點 探針限制酶 RFLPs(kb)PIC外顯子18p114.12Bcl1.2(0.25)/0.9(0.75)0.38內含子22p482.6Xba9.6(0.44)/4.8(0.56)049DXS52St14-1Bcl4.0(0.09)/3.3(0.12)/3.0(0.44)/2

25、.3(0.35)0.66 Taq6.6(0.01)/5.3(0.12) 4.8(0.17)/4.5(0.06)/4.1,4.0(0.02) 3.9(0.15)/3.3(0.31) 3.0(0.44)/2.3(0.35)0.81DXS15DX13Bgl5.8(0.19)/2.8(0.8)0.31在中國人中，F基因內部的RFLPs與國外的報道基本一致，而基因外RFLPs則有很大差異如白種人中DX13位點Bgl的頻率為0.5，而中國人高達0.81；歐美人群的St14/Taq片段4.5kb和4.1kb出現頻率較高，而3.6kb較低，在中國人中正好相反。說明結構基因內多態性位點具有較高的保守性，而基因外DNA序列變異較大，存在著群體差異。因此在應用RFLPs進行連鎖分析時，應注意本民族本地區人群的RFLPs特點。此外，在進行RFLPs連鎖分析診斷血友病時，應該遵循以下三點：其一，首先確定攜帶者的基因型，尋找雜合的RFLPs位點。優先