1、醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南 <2018 版）無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產品生產控制過程中的一項重要內容。其檢 驗方法、檢驗結果判定及檢驗人員業(yè)務能力等因素直接影響產品的質量和 安全。作為無菌醫(yī)療器械生產企業(yè)，其無菌檢驗工作應由本企業(yè)獨立完 成。本指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械生產監(jiān)管人員增強對無菌檢驗相關知 識的認識，指導和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產監(jiān)管人員對醫(yī)療器械生產企業(yè)無 菌檢驗過程控制水平的監(jiān)督檢查工作，同時，為醫(yī)療器械生產企業(yè)<以下簡稱生產企業(yè)）在無菌檢驗的過程管理要求提供參考和依據。當國家相關法規(guī)、標準、檢查要求發(fā)生變化時，應重新修訂本指南。一、適用范圍本指南適用于北京市藥品監(jiān)督管

2、理局組織、實施的醫(yī)療器械生產企 業(yè)許可證核發(fā)、變更、換證等現場檢查、醫(yī)療器械質量管理體系考核、 醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范檢查、醫(yī)療器械生產日常監(jiān)督等各項涉無菌檢 驗的檢查。二、檢查內容 檢查人員應在充分了解生產企業(yè)無菌檢驗活動的情況下，對其無菌檢 驗過程的控制水平進行客觀的檢查和評價。一般情況下，檢查人員可按照以下順序開展檢查工作，并適時做好相 關記錄：1、了解產品特性及生產企業(yè)選擇的無菌檢驗方法。常見的產品無菌 檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。當建立產品的無菌檢查方法時，生 產企業(yè)應進行方法的驗證，以證明所采用的方法能夠給出正確的結果。若 該產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新

3、驗證。驗證時， 應按供試品無菌檢查的規(guī)定及有關要求進行操作。對藥典規(guī)定的每一實驗菌應逐一進行驗證。驗證實驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。2、了解檢驗人員的專業(yè)背景、培訓情況及工作經歷?？赏ㄟ^查看學 歷證書、培訓證書或當面詢問檢驗人員的方式，檢查無菌檢驗人員是否具 備微生物專業(yè)知識，并經過無菌技術的培訓。3、現場察看無菌實驗室。無菌檢查應在環(huán)境潔凈度 10000 級下的局 部潔凈度 100 級的單向流空氣區(qū)域內 如在萬級潔凈間內配置超凈工作臺 等）中進行，其全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。單向流 空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期監(jiān)測。4、現場察看無菌實驗所需的設備和器具。其中， 主要設

4、備包括：恒溫培養(yǎng)箱 真菌、細菌）、恒溫水浴箱、壓力蒸汽 滅菌器、電熱干燥箱、電子天平、光學顯微鏡、集菌儀、過濾裝置無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）等；從實驗安全性考慮，建議陽性對照實驗使用生物安全柜）主要器具有：試管及試管架、酒精燈、 75乙醇棉、滅菌刻度吸管（1ml、滅菌平皿v9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。生產企業(yè)應采用可靠方法對與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓 力蒸汽滅菌器內121 C 30分鐘，或置電熱干燥箱內160C 2小時。器具滅 菌后必須做好標識，標明滅菌的時間和使用有效期。器皿在滅菌后，最多 1 周即用完。檢查時還應注意清點培養(yǎng)皿的個數，與實驗記

5、錄中反映的培 養(yǎng)基個數是否一致。5、對照生產企業(yè)有關無菌實驗的管理制度、操作規(guī)程等相關技術文 件，要求檢驗人員當場操作或口述無菌檢驗的過程。1 ）培養(yǎng)基制備 生產企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產的符 合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在2C 25C、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在 3 周內使用；若保存于密閉容器中，一般可在 1 年內使用。無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng) 基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與 供試品的無菌檢查同時進行。2）供試品的無菌檢查 無菌檢查法包

6、括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應 采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證 的方法相同。無菌實驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等 試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。無菌操作時，對供試品容器表面應用適宜的消毒液進行徹底消毒，如 果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。3）培養(yǎng)及觀察含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄 是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現渾濁， 培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長

7、，可取該培養(yǎng)液適量轉種 至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng) 2天、真菌培養(yǎng) 3天，觀察接種的同種新鮮 培養(yǎng)基是否再出現渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。在觀察實驗結果的過程中，還應考慮假陰性的影響。其中影響假陰性 發(fā)生的因素有：培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長促生長實驗）；在無菌實驗中，產品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質消除抑菌物質）；從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時間間隔 確定滅菌后產品的儲存條件及儲存時 間）。4）結果判斷生產企業(yè)應按照如下標準進行判斷：若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合 規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合 規(guī)定，除非能充

8、分證明實驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。陽 性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則實驗無效。當符合下列至少一個條件時，方可判實驗結果無效：無菌檢查實驗 所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求；回顧無 菌實驗過程，發(fā)現有可能引起微生物污染的因素；供試品管中生長的微 生物經鑒定后，確證是因無菌實驗中所使用的物品和 <或）無菌操作技術 不當引起的。實驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法重 試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī) 定。6、查閱實驗記錄。完整的實驗記錄應明確包含下列幾類信息： <1）樣品記錄，至少應包

9、括：取樣日期、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品 批號、取樣地點、取樣方式、取樣人、原始實驗記錄序號。<2）滅菌物品制作記錄 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基批號、培養(yǎng)基用量 <g）、蒸餾水用量 vml）、培養(yǎng)基分裝數量、滅菌日期、滅菌的實際溫度和壓力、滅菌時 間、制作人、培養(yǎng)基存放地點和有效期等。 器具：器具名稱、器具數量、滅菌日期、滅菌的實際溫度和壓力、 滅菌時間、制作人、器具存放地點、有效期等。<3）原始實驗記錄，至少應包括：記錄名稱、記錄序號、樣品名稱、 樣品唯一性標識 <例如：樣品號）、樣品規(guī)格、樣品批號、滅菌批號、樣 品數量、取樣日期、檢驗日期、檢驗依據、主要實驗設備及器具

10、、實驗方法、實驗環(huán)境條件、實驗結果 每日觀察的結果）、實驗結論、檢測人、 復核人等。4）廢棄物處理記錄，至少應包括：廢棄物形態(tài) 固體、液體）、廢 棄物數量、滅菌時間和壓力、經辦人、處理日期等。三、其它應注意的問題1、生產企業(yè)應確保樣品具有代表性：實驗樣品應從常規(guī)產品中能夠 代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機的。實驗樣品的選擇和 處理技術應明確，以免對樣品上所含的微生物的數量和種類造成污染和改 變。實驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產品，它們應該代表這個生產 批的加項目序和條件。用于實驗的不合格產品應不會影響無菌測試的有效 性。2、生產企業(yè)對于供試品的選取、轉移過程要采取防止污染措施，

11、確 保實驗結果的可靠性。選取制作供試品的實驗樣品時，樣品包裝須完好無 損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。3、無菌檢驗中接觸供試品的實驗用具溫度不能過高以防可能存在的 菌被燙死。對不同種類和不同批次的產品，在拆包裝及夾取樣品時，應更 換實驗用具 如：剪刀、鑷子）。4、進入無菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應采用適用的 方法進行消毒處理 如：紫外燈照射不少于 30 分鐘），以避免將外包裝污 染的微生物帶入無菌檢驗室。出具實驗結果后，所有培養(yǎng)物須經121 C高壓滅菌 30 分鐘的處理。5、因為無菌檢驗時

12、間跨度較長，因此過程的記錄應能夠完整體現實 驗的全過程，對于在實驗過程中出現的各種情況，均應在記錄中客觀反映。參考資料一：常見的名詞解釋1、滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國 際上規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6 及以下。2、微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實體，包括細菌、真菌、原 生動物和病毒。3、無菌技術：是指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的 污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施，其中包括無菌環(huán)境設施、無 菌實驗器材以及無菌操作。4、無菌操作：是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進 行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾

13、的一種常規(guī)操作方法。5、培養(yǎng)條件：用于促進微生物發(fā)育、生長和繁殖的生長培養(yǎng)基和培 養(yǎng)方式的組合。6、需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。7、厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才能生存的微生物。8、抑細菌 / 抑霉菌實驗：用選定的微生物來演示某些物質的存在能夠 抑制這些微生物的繁殖。9、促生長實驗：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物生長的技術操 作。10、假陰性：實際陽性的無菌實驗結果被變成了陰性。11、假陽性：實際陰性的無菌實驗結果被變成了陽性。12、生物指示物：對特定滅菌工藝有確定的抗力，可供使用的微生物 檢驗器材。13、化學指示物：根據暴露于某種滅菌工藝所產生的化學或物理變化，在一個

14、或多個預定工藝參數上顯示變化的指示器材。14、無菌保證水平 <SAL): 滅菌后產品上存在單個活微生物的概率參考資料二：無菌室空氣中菌落數的檢查無菌室在消毒處理完畢后，應檢查空氣中的菌落數。方法如下：取直 徑約90mm培養(yǎng)皿，無菌操作注入融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL在30C35C培養(yǎng)48小時證明無菌后，取3只培養(yǎng)皿在無菌室操作臺或超 凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露 30分鐘后蓋好，置30C35C培養(yǎng)48 小時后取出檢查，3只雙碟上生長的菌落數平均不得超過 1個。無菌實驗 過程中應檢查空氣中的菌落數，方法同上。在實驗開始進行時打開平皿 蓋，至實驗結束蓋好照上法培養(yǎng)，應符合上述要求。參考資

15、料三：供試品數量的選擇檢驗數量是指一次實驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規(guī)定 外，出廠產品按藥典附錄X皿 B中表1規(guī)定；上市產品監(jiān)督檢驗按表2、表 3規(guī)定。表1、表2、表3中最少檢驗數量不包括陽性對照實驗的供試品用 量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1支 或瓶）作陽性對照用。執(zhí)行GB/T14233.2的供試品數量應滿足同一批號311個單 位供試品。檢驗量是指一次實驗所用的供試品總量 g或ml）。除另有規(guī)定外，每 份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支 瓶）供試品的裝量按 規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則

16、應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬 丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的總接種量， 只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。表1批出廠產品最少量檢驗數量供試品批產量N（個母種培養(yǎng)基最少檢驗數量注射劑< 10010%或4個（取較多者大體積注射劑（ 100ml100 v N< 500> 50010個2%或20個（取較少者2%或 10個（取較少者眼用及其他非注射產品< 200> 2005%或2個（取較多者10個桶裝固體原料< 44v N< 50> 50每個容器20%或4個容器（取較多者2%或 10個容器（取較多者醫(yī)療器

17、具10< 100100 v N< 500> 50010%或 4件 取較多者）10件2%或 20件 取較少者）注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗數量應加倍表2上市抽驗樣品（液體制劑的最少檢驗量供試品量V每支樣品接入每管培最少檢驗數量(ml>養(yǎng)基的最少樣品量（瓶或支< 1全量201v Vv 5半量105< Vv 202ml1020< Vv 505ml1050< Vv 10010ml1050< Vv 100(靜脈給藥>半量10100< V< 500半量6V> 500500ml6每種培養(yǎng)基各接種10支供

18、試品.表3上市抽驗樣品（固體制劑的最少檢驗量供試品裝量M母支樣品接入母呂培養(yǎng)最少檢驗數量（瓶或支基的最少樣品量（瓶或支Mk 50mg全量2050mgc Mk 300mg半量10300mgC Mk 5g150mg10M> 5g500mg10一次性使用含藥產品整個產品10 每種培養(yǎng)基各接種10支供試品 桶裝固體原料的最少檢驗數量為 4個包裝參考資料四：培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)應注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3035C 14天；改良馬丁培養(yǎng)基2328C 14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產品的性質、 制造方法、潛在的微生物污染來源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽 流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進行分

19、裝、火菌。1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酪胨（胰酶水解 15.0g、酵母浸出粉5.0g、葡萄糖5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液1.0 ml、硫乙醇酸鈉 0.5g（或硫乙醇酸0.3ml、瓊脂0.75g、水1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節(jié)pH值使滅菌后為7.1 士 0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符 合培養(yǎng)結束后培養(yǎng)基氧化層 粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5 ，否則，須經100 C

20、水浴加熱至粉紅色消失 不超過20分鐘），迅速冷卻， 只限加熱一次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置 30 C35C培養(yǎng)。2、改良馬丁培養(yǎng)基胨5.0g、磷酸氫二鉀1.0g、酵母浸出粉2.0g、硫酸鎂0.5g、葡萄 糖 20.0g、水 1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調節(jié)pH值約為6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調節(jié)pH值使滅菌后為6.4 士 0.2 ,分裝，滅菌。改良馬丁培養(yǎng)基置23 C28C培養(yǎng)。3、選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培 養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗 證實驗。4、營養(yǎng)肉湯

21、培養(yǎng)基胨 10.0g 、氯化鈉 5.0g 、牛肉浸出粉 3.0g 、水 1000 ml 取上述成分混合，微溫溶解，調節(jié) pH 為弱堿性，煮沸，濾清，調節(jié) pH值使滅菌后為7.2 士 0.2，分裝，滅菌。5、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 按上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g 瓊脂，調節(jié) pH 值使滅菌后為 7.2 士 0.2 ，分裝，滅菌。6、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g 瓊脂，調節(jié) pH 值使滅 菌 后 為 6.4 士 0.2， 分 裝 ， 滅 菌 。參考資料五：培養(yǎng)基的適用性檢查1、無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機取不少于 5支 <瓶)，培養(yǎng) 14天，應

22、無菌生長。2、靈敏度檢查菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代 <從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0代)，實驗用菌種應采用適宜的菌種保 存技術進行保存，以保證實驗菌株的生物學特性。金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus> CMCC(B> 26 003 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa> CMCC(B> 10 104 枯草芽孢桿菌 <Bacillus subtilis) CMCC<)B63 501生孢梭菌 (Clostridium sporogenes> CMCC(B> 6

23、4 941 白色念珠菌 (Candida albicans> CMCC(F> 98 001 黑曲霉 (Aspergillus niger> CMCC(F> 98 0033、菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫 乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30C35C培養(yǎng)18小時24小時；接種白色念珠 菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328 C培養(yǎng)2448小時，上述培養(yǎng)物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數小 于100cfu<菌落形成單位)的菌懸液。接

24、種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328 C培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05 % <v/v )聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶 液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含 0.05 % vv/v )聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu 的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在28C可在24小時 內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28C,在驗證過的貯存期內使用。4、培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭

25、菌各 2 支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁 培養(yǎng)基5支,分別接種小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各 2支，另1支不 接種作為空白對照，培養(yǎng) 5天。逐日觀察結果。5、結果判定 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈 敏度檢查符合規(guī)定。參考資料六：方法驗證實驗1 、菌種及菌液制備除大腸埃希菌 <Escherichia coli )CMCC(B> 4 4102外，金黃色葡 萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度 檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。2、薄膜過濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的

26、供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的實驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙 醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或將培養(yǎng)基加至濾筒內。另取一 裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量實驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng) 3 5天，各實驗菌同法操作。3、直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢 梭菌各 2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各 2管。其中 1管接入每支培養(yǎng)基 規(guī)定量的供試品量，另1管作為對

27、照，按置規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。4、結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的實驗菌均生長良好，則說明供 試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計， 照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器 中的實驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗 條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑 或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方 法驗證實驗。參考資料七：供試品處理及接種培養(yǎng)基 直接接種法：每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培 養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用 量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。薄膜過濾法：將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐 劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數不得少于三次。沖洗后，如用 封閉式薄膜過濾器，分別將 100ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng) 基加入相應的濾筒內。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含 50ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器 中，其中一份做陽性對照用。薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使