1、禽流感疫苗研究進展白寧七孫尚芬2,姜振國21.75安市長安區杜曲街道蓄牧爵醫站，陜西西安710104；2.西安市長安區動物疾病族防控制中心，陜西西安710000摘要蹤述了目苛世界上的主妥禽流感疫苗，會病毒滅活疫苗、減在活疫苗、總因工程亞單位疫苗、DNA疫苗、RNA復制于疫苗、重組璃毒活栽體疫苗、反向遣傳苗、具有交義保護枚的通用流感疫苗、細胞苗和件裁因植物疫苗的研究進展，為研制出工藝簡單、成本低廉、保護力強的禽流感疫苗提供了參考。作者簡介白寧(1980-),男，陜西長安人，助理尊成坤，從事動物疫病防拉工作,E-n»ail：bainingvetc收稿日期2012-02-11關鍵詞禽流感病

2、毒;戎苗；研究進展中圖分類號S834文獻標識碼A禽流感(AvianInfluenza,AI)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的一種禽類烈性傳染性疾病，可導致家禽、各種野鳥、特別是遷徙水禽的感染，被世界動物衛生組織(0IE)確立為A類傳染病。1878年.Per-roncito首次報道禽流感病毒(AIV)在意大利雞群中暴發，隨后在世界各地均有AI暴發和流行的報道，給養禽業帶來了巨大的經濟損失自1959年以來，全世界共暴發了20多次高致病性禽流感(HPAI)。尤其是1997年發生在我國香港的禽流感感染人事件及2005年青海湖大量遷徙水鳥感染H5N1死亡事件，更加引起人們對該病的關注OA型流感

3、病毒具有典型的宿主特異性，通常感染禽類并使其致病的多為H5、H7和H9亞型，但由于流感病毒抗原經常發生變異，旦不具有交叉保護性，給禽流感的防治帶來極大的困難。而目前禽流感的危害引起了世界各國的高度重視，嘗試采取不同的措施來預防和控制禽流感。在眾多的防控方法中，疫苗免疫占重要地位。然而由于A型流感病毒的高度變異性，各亞型的復雜性決定了目前傳統疫苗的文章編號2095-3305(2012)02-062-04保護力無法達到期望效果。為此，筆者將目前世界上主要禽流感疫苗的研究進展綜述如下，旨在為研制出工藝簡單、成本低廉、保護力強的疫苗提供參考。1全病毒滅活疫苗全病毒滅活疫苗一般是用甲醛滅活的禽流感病毒雞

4、胚尿饕液，輔以佐劑制成的油乳劑疫苗。該疫苗安全性好，具有良好的免疫保護作用，可制備多價疫苗，且各亞型之間不產生免疫干擾。試驗證明,滅活全病毒疫苗不會出現毒力返強和變異現象，能夠經受同種亞型AIV的攻擊，能為雞群提供良好的免疫保護。目前，我國H5、H7亞型禽流感滅活疫苗已研制成功，并取得了良好的免疫保護效果。但與此同時，全病毒滅活疫苗也存在一定的問題，如疫苗免疫效果是由滅活疫苗的注射劑骨和疫苗中的抗原量決定的，因此滅活苗注射的病毒量要比活疫苗高出許多倍。且制備滅活苗還必須添加佐劑，其生產還需要大量的雞胚，成本非常高，這在禽流感大流行的情況下，雞胚的供應將會成為疫苗生產的一個限制因素。此外，由Re

5、searchProgressofAvianInfluenzaVaccineBAI>6ngetal(AnimalHusbandryandVeterinaryStationofDuquStreetinXi'an,Xi'an.Shaanxi710014)AbstractResearchprogressofmainavianinfluenzavaccineintheworldtoday,includinginactivatedvirusvaccine,liveattenuatedvaccine,geneticengineeringsubunitvaccine,DNAvaccine

6、,RNAreplicon-basedvaccine,recombinantvirusliving-carriervaccine,reversegeneticsvaccine,crossprotectivevaccine,cellvaccineandtransgenicplantvaccinewasreviewed.Thestudyprovidesreferenceforthepreparationofa-vianinfluenzavaccinewiththeadvantagesofsimpleprocedure,lowcostandstrongprotectiveefficacy.Keywor

7、dsAvianinfluenzavirus;Vaccine;Researchprogress于接種滅活苗的機體也會產生針對病毒內部結構蛋白，如NP的特異性抗體，而這類抗體是在進行流行病學調杳時的主要判定指標，因此滅活苗的應用將導致無法區分自然感染雞和疫苗接種雞，從而干擾AIV疫情的也測和流行病學的調查。2減毒活疫苗減毒活疫苗是指將野毒株感染雞胚，并在2526氣下連續傳代得到減毒毒株，即冷適應株，該病毒只能在25弋左右復制，不能在37%T傳代，之后使用該弱毒株免疫使機體產生特異性免疫。多項人體和動物研究證實，冷適應毒株生物學性質有很好的穩定性。弱毒流感疫苗與滅活疫苗的免疫后抗體陽轉率都存50%7

8、0%,能夠有效控制流感的流行；對群體免疫的意義更加重大，對表面抗原發生轉移的流行株病毒有一定的保護作用逆。但冷適應減毒活疫苗與其他流感病毒可能發生基因重配得到毒力恢復的重配株病毒，此外，冷適應減毒活疫苗在免疫缺陷患者中使用有致病的風險。3基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗是指利用DNA重組技術，將編碼病原微生物保護性抗原基因導入受休菌(如大腸桿菌)或細胞，使其在受體中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈，提取保護性肽段加入佐劑后免疫動物進而引起機體特異性免疫反應。血凝素(Hemagglutinin,HA)是構成愈流感病毒囊膜纖突的主要成分之一，在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用，可刺激機體產生中和抗休

9、，為禽流感病毒中最為重要的保護性抗原。隨著分子克隆技術的發展，可將HA基因連接到載體質粒上，然后導入表達系統中進行擴增和表達。試驗證明，采用H5重組HA佐劑疫苗免疫的痛類在攻毒后不排毒。劉明構建了桿狀病毒轉移載體，分別表達了禽流感病毒H5N1的HA基因和NA基因，用這些表達產物免疫SPF雞，結果表明，用相同亞型強毒攻擊后,rBacH5免疫組、rBacNl免疫組的保護率分別為90%、50%,rBacH5和rBacNl聯合免疫組的保護率為90%；HA+NA聯合免疫組只需免疫1次就能取得HA單獨免疫2次的效果。利用真核表達系統表達相應的禽流感病毒表面蛋白，如HA、NA和M2,表達產物純化后作為疫苗。

10、這種亞單位疫苗是病毒粒子的一部分，但不含核酸，具有很好的安全佐，也能刺激機體產生足夠的免疫力。但亞單位疫苗免疫原性低、持續時間短，需要與佐劑合用，成為該疫苗發展的限制因素。4DNA疫苗DNA疫苗又琮核酸疫苗,是利用重組DNA技術將保護性抗原蛋白的基因克隆到真核表達載體卜，在被直接導入到動物體內后，保護性抗原蛋白基因表達的抗原蛋白經過內源性呈給免疫系統，誘導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。流感病毒是最早用于基因免疫研究的模型。與傳統疫苗相比,DNA疫苗具有許多優點。首先,DNA疫苗可誘導長期或終生免疫；其次，其抗原合成和遞呈過程與病原體的自然感染很相似，抗原蛋白經內源性合成后轉運到紹胞表

11、面，再通過MHC-I和MHC-II類分子直接遞呈給免疫系統，特別是特異性CD8+T淋巴細胞CTL的免疫反應，這些是一般疫苗不可相比擬的；再次，其可同時引起特異性體液免疫和細胞免疫應答，增強機體保護力；另外，其對不同亞型的病原體具有交叉抵抗作用，且DNA疫苗基本沒有毒性逆轉的可能，不存在減毒疫苗那樣可能在體內毒力回升后致病的危險；同時，該疫苗易于實現聯合免疫，且其免疫原性較單一，只有編碼所需抗原的血凝素基因導入細胞后得以表達，而質粒載體沒有免疫原性，可反復使用，無散毒和疾原毒力返強的威脅；最后，其質雖易于控制和評價，。NA序列可知，純化工藝簡便，生產迅速、成本低廉，穩定性好，便于運輸和保存，不需

12、要冷藏。但DNA疫苗的研制和開發才剛剛起步.還有很多關鍵問題亟待解決。首先,所用載體多具有抗生素抗忤，導致被免疫的機體可能會對相應的抗生素產生抗體，給一些常見的細菌性疾病的防治帶來了困難。第二，目前所研制的DNA疫苗體內免疫保護力還不是很強，這可能與DNA疫苗在機體內的生存和表達有關，很有可能是大部分質粒被機體當作異物降解，或載體在動物體內表達效率不高而降低了DNA疫苗的免疫效果。DNA疫苗正在給免疫預防治療領域帶來一場根本性的變革，但在DNA疫苗應用于人體之前，還有許多問題未完全解決，如疫苗的質量標準、制劑、效用、生產工藝和安全性等。另外,外源核酸是否會被整合到染色體中引起機體的癌變及自身免

13、疫反應等問題，還沒有確切的結論，同時疫苗誘發的免疫反應強度較弱，因此，還需要大量及長期的考察。5RNA復制子疫苗RNA復制子疫苗利用源自病毒的能夠自主復制的RNA,其結構蠶白基因由外源抗原基因取代，保留了非結構蛋白(RNA復制酶)基因。RNA復制酶可使RNA載體在細胞質中高水平復制，并實現外源抗原基因的高水平表達，可同時誘導細胞免疫和體液免疫應答。大量雙鏈RNA可誘導被感染細胞凋亡，宿主細胞的凋亡有利于免疫系統識別外源抗原。RNA復制子疫苗克服了傳統疫苗和普通DNA疫苗存在的缺點，具有抗原表達效率高、安全忤好、應用范圍廣等優點，因而被視為一種具有良好發展前景的疫苗形式。6重組病毒活載體疫苗活載

14、體疫苗是指將病原體的抗原保護性基因和基因缺失的病毒載體相連接，將制備的含有目的基因的活病毒直接免疫動物引起機體特異性免疫反應的疫苗。目前常用的病毒載體有痘病毒、腺病毒、皰疹病毒和逆轉錄病毒等，而研究酸多的是利用痘病毒進行禽流感活載體疫苗的構建表達HA的重組病毒,該病毒可在體內復制，表達HA蛋白，從而誘導機體產生針對AIV的免疫保護力。國內進行禽流感活載體疫苗的研究集中在哈爾濱獸醫研究所，2003年0拓。等構建了能同時表達H5N1亞型HA基因和NA基因的重組禽痘病毒(Fowlpoxvirus,FPV)重組疫苗，攻毒結果顯示該疫苗具有良好的免疫保護性。2004年，喬傳玲等將表達H5亞型禽流感病毒H

15、A和NA基因的rFPV以不同劑量分別經翅下刺珅、肌肉注射、皮下注射、點眼及滴鼻途徑接種于4周齡SPF雞，結果表明，該疫苗經翅下刺種、肌肉注射、皮下注射途徑接種的SPF雞，能夠誘導其產生HI抗體；用100LD«的HPAIV/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)毒株攻擊后，免疫雞無發病和死亡。重組病毒所表達的外源基因在機體內隨載體病毒的復制而表達，因此具有不影響疫情監測、安全性高、生產成本低等優點。然而,Swaye等研究表明，表達H5亞型禽流感病毒HA的重組雞痘病毒對未經雞痘免疫的肉種雞和白來航雞可提供很好的免疫保護作用，而先用雞痘免疫，再用重組雞痘病毒免疫，則會大大降低

16、免疫保護作用甚至導致免疫失敗。因此，禽流感重組痘病毒疫苗應避免用于經痘病毒疫苗免疫的或自然感染野毒痘病毒的或母源抗體較高的雞群，否則將不能誘導對禽流感的良好免疫應答。7反向遺傳苗反向遺傳苗是指運用反向遺傳學方法從CDNA水平上獲得缺失的病毒粒子，該病毒粒子感染細胞時，能在細胞內表達病毒蛋白但不能形成有感染力的病毒粒子，進而使機體產生針對流感病毒的免疫。利用該技術獲得的減毒AIV,不僅能產生保護性抗體，且能誘導很強的細胞免疫，在組織培養物中生長良好，是一種很有發展前途的活疫苗。盧建紅等設計帶有BsmBkBsal或Aarl酶切位點的引物，用RT-PCR擴增了H9N2亞型禽流感病毒的8個基因全長片段

17、，克隆入雙向轉錄/表達載體PHW2000,并在PB2.PB1和NA基因中共引入了3個沉默突變標簽，將其2個表面基因(HA和NA基因)加上任意1個內部基因，其他5個內部基因來自A/WSW33,進行了6種3+5組合形式的基因重排，將相應組合的轉錄/表達質粒共轉染COS-1細胞，均產生了預期組合、有感染性的H9N2亞型流感病毒，表明親緣關系遙遠的流感病毒可互相獲取基因片段產生重蛆病毒，提示表面結構基因和單個內部基因不足以限制H9N2亞型麗流感病毒在哺乳動物細胞上的宿主范圍，同時也驗證了構建的8個轉錄/表達載體均能有效工作，為進一步研究H9N2亞型禽流感病毒基因的結構與功能、窿流感病毒與宿主之間的關系

18、打下了基礎。8具有交叉保護性的通用流感疫苗-種理想的禽流感疫苗應是無論在禽流感大流行期間，還是過渡階段，對各種亞型的流感病毒都有效。A型流感病毒蛋白中較為保守的蛋白為NP和M,是誘導具有交叉保護性CTL反應的特定多肽，因此從理論上講，研究交叉保護性疫苗有2條途徑。Neirynck等嘗試將保守M2蛋白的膜外區域(M2e)融合到B型肝炎病毒的核心蛋白上，在大腸桿菌中表達來構建一種通用疫苗，結果發現，腹腔內或肌肉注射純化的M2HBC蛋白到小鼠體內能提供90%、100%的保護，其產生的中和抗體具有廣譜性，對抗A型流感病毒感染的持續時間長等特點。但如此小的表面抗原是否能對機體對流感病毒的感染提供足夠的保

19、護，還有待進一步和更大規模的驗證問。Park等用田醛滅活的流感全病毒疫南經鼻腔免疫小鼠發現，該疫苗能抵御8種不同亞型流感病毒的攻擊，表現出免疫效力的廣譜性；研究培果還顯示,交叉保護是由于NP基因刺激產生的CTL反應引起的*李永清等用研制的M2基因重組馬立克氏病病毒(MDV1)免疫1日齡SPF雞后,從第14天起免疫雞開始產生抗體.到第21天時,83%的雞已產生了抗體.為禽流感交叉保護型疫苗的研究提供了依據峰9細胞苗目前，市場上滅活流感疫苗是用雞胚生產的，所以必須及時充足的供應高質it雞胚才能保證生產。而用細胞替代雞胚具有很大的優勢，因為細胞生產的過程將更快，更易進行質堂控制和更大規模的生產。將病

20、毒在無血清甚至無蛋白的培養基培養，將明顯減少微生物的感染以及對雞胚卵清蛋白的過敏通過哺乳動物細胞培養的流感病毒制備的滅活疫苗，比雞胚制備的能誘導更多的血清抗體，從而提供更強的保護"氣目前用于制備流感疫苗的哺乳動物細胞主要是MDCK細胞和Vero細胞。10轉基因植物疫苗轉基因植物疫苗是借助植物遺傳鑄化載體將抗原基因導入植物.使其在植物中表達.生產出能使機體獲得特異抗病能力的疫苗。植物遺傳轉化的受體系統、載體系統和遺傳轉化方法，是轉基因植物基因工程疫苗生產技術的關鍵。轉基因植物疫苗具有以下優勢:表達產物具有較好的免疫原性及生物活性；口服植物疫苗能誘導黏膜免疫反應；植物細胞的細胞壁可起到生

21、物膠囊的作用，更好地刺激機體產生特異性免疫反應；生產簡便、成本低廉，不需要冷藏和低溫運輸;安全性好,無外源性病原污染等。宋長征等利用轉基因馬鈴薯表達AIV的HA蛋白，結果顯示，用轉基因馬鈴薯生產口服AIV疫苗具有較好前景網。11抗獨特型抗體疫苗抗獨特型抗體疫苗是根據JerneNK的免疫網絡學說研制的眼。一些抗獨特型抗體能夠和抗體的補位結合并在空間結構上模擬抗原表位，這類抗體可替代抗原作為診斷抗原檢測機體的抗體水平，還可作為疫苗免疫動物，使動物產生免疫應答.，抵抗相應病原體的侵襲。李寶全等首次用純化的雞抗H9亞型AIV免疫球筮白(IgG)作為抗原免疫家兔，制備兔源的多克隆抗獨特型抗體(Pab2)

22、,同時免疫小鼠，制備分泌抗AIV獨特型單克隆抗(Mab2),試驗顯示，所制備的2種獨特型抗體均能競爭性抑制雞抗AIVIgG與AIV的結合，并能誘發SPF雞產生血凝抑制抗體。該試驗表明，單克隆和多克隆抗獨特型抗體均能對免疫雞產生保護作用E】。,考文獻DJALEXANDER.Anoverviewoftheepidemiologyofavianinfluenza(J).Vaccine,2007,25(30):5637-5644.1 MKOBAYASHI,TTOYODA,A1SHI-HAMA.InfluenzavirusPB1proteinistheminimalandessentialsubunit

23、ofRNApolymeraseQ).ArchVirol,1996,141(3-4):525-539.(3 HBGREENBERG,PAPIEDRA.Immunizationagainstviralrespiratorydisease:areviewJ.PediatricInfectiousDiseawJournal.2004.23(11):254-261.(4 劉明.H5和H7亞型禽流感分子防制技術的研究D.北京:中國農業科學院,2000.5鄲洪生，王演坤，鄭世民.重組斑痘病豐栽體及其在禽流,疫苗中的應用皿黑龍江官牧善醫，2006(5):22-24.(6JQIAOChuanling,YUKan

24、gzhen,JJANGYongping,etal.ProtectionofchickensagainsthighlylethalH5N1andH7N1avianinfluenzaviruseswitharecombinantfowlpoxvimsco-expressingH5haemag-giutininandN1neuraminidasegenesJJ.12新型禽流感疫苗與展望目前，新型的禽流感疫苗包括冷適應流感弱毒疫苗、基因工程活流感病毒疫苗、復制缺陷型流感病毒疫苗、RNA復制子疫苗、表位疫苗、轉基因植物疫苗、沙門氏菌DNA口服疫苗等間。隨著分子生物學、細胞生物學和免疫學手段的不斷更新，更

25、多、更有效的疫AvianPathology,2003,32(1):25-31.7胡建和，王青，就柏林.禽流感病毒新型疫苗的研充進展J.生物技術通報，2010(8):35-39.(8|DESWAYNE,JRBECK,NKINNY.FailureofarecombinantfowlpoxvirusvaccinecontaininganavianinfluenzahemagglutiningenetoprovideconsistentprotectionagainstinfluenzainchickenspreimmunizedwithafowlpoxvaccineJ.AvianDiseases,2000,44(1):132-137.9盧建紅，部衛星，龍進學，等.H9N2禽流感病毒反向遺傳系統轉錄/表達我體的構建和臉位/中國滿毒學.2005(4):388-392.|10沈志強.禽液.感疫苗的研究進展J今日富牧善醫.2009：40-41.(11)CHPARK,H