1、保健食品中核苷酸的測(cè)定Determination of nucleotide in health food1范圍本方法規(guī)定了以液相色譜法測(cè)定保健食品中的核苷酸。本方法適用于作為功效成分添加于嬰幼兒配方奶粉中核 苷酸的測(cè)定。本方法檢出限：胞嘧啶核苷（CMP 0.04卩g/ mL、脲嘧啶 核苷（UMP 0.05卩g/ mL腺嘌呤核苷（AMP 0.05卩g/ mL 鳥(niǎo)嘌呤核苷（GMP 0.06卩g/ mL次黃嘌呤核苷（IMP） 0.04 卩 g/ mL。本方法線性范圍：胞嘧啶核苷（ CMP 0.99212.4卩g/ mL脲嘧啶核苷（UMP1.1714.6卩g/ mL腺嘌呤核苷（AMP 1.01 12

2、.6 卩 g/ mL、鳥(niǎo)嘌呤核苷（GMP 0.948 12.3 卩 g/ mL次黃嘌呤核苷（IMP） 1.3016.3卩g/ mL。2原理將試樣溶解、去除蛋白后，使用氨基固相萃取柱對(duì)核苷酸進(jìn)行凈化富集，根據(jù)高效液相色譜紫外檢測(cè)器在254nm處的響應(yīng)進(jìn)行定性定量。3試劑除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確定為分析純的試劑和雙蒸水。3.1 甲醇優(yōu)級(jí)純。3.2 乙酸。3.3 磷酸二氫鉀。3.4 磷酸氫二鉀。3.5 季銨鹽固相萃取柱。3.6 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱量經(jīng) 100C, 4h干燥處 理的標(biāo)準(zhǔn)品胞嘧啶核苷（CMP 100mg,脲嘧啶核苷（UMP、 腺嘌呤核苷（AMP、鳥(niǎo)嘌呤核苷（GMP、次黃嘌呤

3、核苷（IMP） 各40mg,加水定容至100mL。3.7 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：將核苷酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用0.25mol/L,pH=3的磷酸二氫鉀稀釋 100倍。4儀器設(shè)備4.1 高效液相色譜儀：附紫外檢測(cè)器（UV）5分析步驟5.1 試樣處理5.1.1 準(zhǔn)確稱取10g試樣于100mL容量瓶中，加入約 50C 熱水80mL,徹底混勻。當(dāng)試樣液達(dá)到室溫后用水定容至刻度。5.1.2 準(zhǔn)確吸取10mL試樣溶液至100mL容量瓶中，加入 0.5 %乙酸5mL水10mL,混勻后靜置5min以沉淀蛋白。用 水定容至刻度，混勻后過(guò)濾，棄去數(shù)mL初濾液后收集約30mL 濾液。5.1.3 將季銨鹽固相萃取柱先用 10mL

4、甲醇、10mL水活化后， 再將20mL試樣濾液過(guò)濾，以1mL水清洗萃取柱，用0.25mol/L,pH=3.5 磷酸二氫鉀溶液洗脫出5mL濾液。全部過(guò)程需要控制流速1滴/秒。5.2 液相色譜參考條件5.2.1 色譜柱：C18 柱 3.9 x 150mm5.2.2 柱溫：25 C。紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。5.2.4 流動(dòng)相：0.01mol/L 磷酸二氫鉀：O.1mol/L 磷酸氫二 鉀=480: 20。5.2.5 流速：0.6mL/min 。5.2.6 進(jìn)樣量：10此。色譜分析：量取10卩L標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液注入色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。5.2.8保留時(shí)間

5、在上述色譜條件下，5種核苷酸的保留時(shí)間見(jiàn)色譜圖，濃度分別為胞嘧啶核苷（CMP 12.4卩g/mL,脲嘧啶核苷（UMP14.6卩g/mL、腺嘌呤核苷（AMP 16.3卩g/mL、鳥(niǎo)嘌呤核苷（GMP 12.6 卩 g/mL、次黃嘌呤核苷（IMP） 12.3 卩 g/mL。5.3 分別配制濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、16.0 卩 g/mL的4種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜 分析，以峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。1分析結(jié)果表述6.1計(jì)算h1 C K 5 100h2 m 1000式中：X - 試樣中核苷酸的含量，mg/100g ;h 1 -試樣峰高或峰面積;K -稀釋倍數(shù)；h 2 -標(biāo)準(zhǔn)溶液峰高或峰面積；m - 試樣量