1、胚胎植入前遺傳學診斷的失誤及改進20世紀90年代初以來，隨著分子生物學技術的日益完善，胚胎植入前遺傳學診斷(preim plantation genetic diagnosis，PGD)的發展十分迅速，臨床上可以鑒定性別，診斷多種單 基因病及染色體病，全世界已有近百例嬰兒經PGD后誕生。但臨床上PGD仍存在20%左右的誤 診率1，主要在于微活檢技術的有效性不足和PGD常用的兩種分析方法，即聚合酶 鏈反應(PCR)和熒光原位雜交(FISH)在利用單細胞做底物時存在著缺陷。許多學者針對這些 原因開展了一些新的方法，本文就PGD的誤診原因及改進作一綜述。 1顯微活檢技術的有效性PGD無論從卵細胞的極

2、體還是從卵裂球中取材，都需要運用微活檢技術，這是PGD技術的一 個難點。Reubinoff2報道：28%的卵細胞由于活檢操作失誤而不能用于PGD，原因 在于分離緊密連接的卵裂球能損傷細胞膜。Shee3把常規活檢時分別用來固定囊 胚、酸溶透明帶、抽吸卵裂球的3個吸管，減少為用2個，1個仍固定囊胚，另1個先用酸溶蝕 透明帶，然后把酸吸回再抽出卵裂球。這大大縮短了活檢時間，且在透明帶上溶開的孔徑與 吸管直徑相同但略小于卵裂球的直徑，從而避免活檢后細胞質流出和細胞膜破裂。該法使活 檢的有效性提高了10%3。另外，Cieslak報道新開展的三維透明帶部 分切開術用于卵裂球活檢，是在透明帶上做一個V形切開

3、(交叉裂口)，造成一個三角邊口， 足夠微吸管進入胚胎取出裂殖細胞。行胚胎活檢時，轉動胚胎直至V形切口置于3點處，固定 胚胎，微管進入焦距，施少許壓力向上壓開三角形葉片即插入胚胎，能在不扭曲胚胎卵裂球 外形下吸出裂殖細胞，三角葉片在微管離去后復位，在移植過程中可保護胚胎。該術不同于 用微針在透明帶上造一裂口的傳統方法，是一種安全、簡單、有效的機械性透明帶部分切開 造口術。Markus用激光在透明帶上打孔但尚未用于人胚檢查。總之，如何提高顯微活檢技術 的準確性及有效性還需進一步研究。2如何避免PCR中等位基因的缺失及提高PCR的效率1985年PCR技術建立后，Handyside于1990年首先應用

4、于臨床PGD，1994年Ray利用單細胞底 物以PCR診斷囊性纖維病(CF)時，發現了等位基因的缺失現象(allele drop-out，ADO)，即 ：以單細胞底物診斷單基因缺陷病時，如在雜合子的單細胞中，兩個等位基因之一未被擴增 。這是導致PGD誤診的主要原因。ADO在理論上由Navidi和Arnheim在1991年提出，1994年才 在臨床上引起足夠重視。Grifo在1994年、Verlinsky在1996年相繼報道過ADO導致誤診的病 例。Ray在診斷CFF508基因突變時，出現了25%的ADO率4。Levinson在1992年利 用多重PCR鑒定胎兒性別的研究中其ADO率是21%。最

5、低的ADO率是Storm在168個雜合子細胞的 擴增中僅一個表現為ADO(0.6%)1。在原位PCR中，ADO的發生率也有12%5 。ADO發生的原因主要為：染色體嵌合體，尤其是除了具有二倍體細胞外，有些細胞是單 倍體時，易致誤診，減少這類誤診的唯一辦法是從1個囊胚中取2個細胞來分析。在操作前 溶細胞的方法對ADO率的影響較大，用強堿溶解，ADO率較低，Gitlin、Wu等用強堿和DTT及 蛋白酶K兩種方法溶細胞，然后用PCR診斷CFF508時，ADO率分別為10%和19%。PCR開始時 的變性溫度也非常關鍵，變性溫度分別為90、93、96時，用PCR診斷CFF508基因突 變時，ADO率依次

6、為21%、13%、5%6。此外，為了降低ADO率，除了上述嚴格的溶細胞條件、變性溫度外，許多學者建立了一些 新方法。Findlay提出熒光PCR，即PCR產物通過熒光標記的引物被標記上了熒光，較容易檢 測 ，此項技術較常規PCR靈敏7，8。Sermon利用熒光PCR診斷CFF508突變，ADO率 僅5%，用常規PCR對比則為21%1。Kuliev9利用細胞的第一、二極體 診斷-地中海貧血時，從一個雜合子細胞中同時擴增二個突變基因，如擴增結果表現為純 合子，則表明出現了ADO。Sermon又介紹了多態PCR：擴增CFF508突變和其附近的具有多態 性的第六內含子。根據兩個位點的一致性結果來做出診

7、斷是否出現了ADO，從而避免誤診 1。3FISH和原位PCRFISH運用于PGD，首先是鑒別胎兒性別以避免性連鎖遺傳病的發生，因可 同時檢測X、Y染色體，準確性較PCR高；其次可用來診斷染色體非整倍體。重要的是FISH可 以診斷復雜的染色體易位、轉位等畸變，但目前關于這方面的進展不大，主要是卵裂球中期 核染色體不易獲得；且每例病人都要用一種特異的DNA探針，探針的制備又較繁雜，一般實 驗室無法開展。針對這種情況，許多學者進行了嘗試：Munne10用自第一極體中 獲得的涂染染色體去分析第一極體中的染色體易位。共檢測8例平衡易位攜帶者，其中5例已 妊娠，2例健康的新生兒娩出，使平衡易位攜帶者的流產

8、率從95%降到12.5%；Conn11 用點探針檢測羅伯遜易位攜帶者的非整倍體，亦獲得一定效果。但這兩種方法只能檢 測來自母體的易位情況，比較局限。湖南醫科大學介紹了一種新的探針標記方法：直接對涂 染探針進行PCR標記，通過合適的PCR引物擴增，把生物素滲入到被擴增的DNA鏈中，該技術 縮短了探針制備的過程12。有專家預言：隨著DNA探針標記技術、制備技術、雜 交結果及像分析技術的發展以及高分辨的FISH作技術、比較基因組雜交技術的問世，FI SH會得到不斷創新和發展，尤其是染色體平衡易位的診斷將廣泛應用于臨床，從而可大大提 高PGD的準確性和IVF的成功率。為了進一步提高以單細胞底物進行PG

9、D的效率，Thornhill13提出了原位PCR： 在固定于載玻片上的同一個單細胞上，先用PCR原位擴增，再用FISH檢測。該技術可使性別 鑒定、單基因病和染色體病的診斷同在一個細胞上進行，被稱為目前最先進的技術。經過一 段時間的探索和研究，目前PGD中應用原位PCR時，PCR的有效率為65%，FISH達85%。遺憾的 是Rechisty報道ADO率較常規PCR高。相信隨著引物設計及熒光PCR與原位PCR有效的結合，原 位PCR的不足會得到克服且可能逐步替代FISH在PGD中的作用。4結語經過近10年的發展，利用PGD已能成功地診斷囊性纖維化病、-地中海貧血，馬凡綜合征 、Staeinert病

10、、1-抗胰蛋白酶缺乏病、Lesch-Nyhan綜合征等近50種單基因病及染色體 病。據美國的一項問卷調查：PGD避免了流產的痛苦，倫理上易于接受。但在臨床應用中，P GD仍有幾個問題值得重視。首先，由于試管嬰兒成功率較低，妊娠率約20%，分娩率約10%， 而接受PGD的病人一般都有正常的生育率，故對他們而言臨床妊娠率低難以接受。其次，PGD 費用昂貴，其研究工作主要集中在英美等發達國家，如何降低PGD的費用，從而使PG D廣泛開展，也是亟待解決的的問題。最后，PGD的歷史較短，對經PGD而誕生的兒童的未來 健康 狀況，尚需長時間隨訪。有理由相信，隨著分子生物學等技術的日新月異，PGD的前景將是

11、 非常令人振奮的!作者單位：朱前勇(第三軍醫大學附屬大坪醫院婦產科 重慶，400042)顏建華(第三軍醫大學附屬大坪醫院婦產科 重慶，400042)參考文獻1,Willy Lissens ,Karen Sermon.Preimplantation genetic diagnosis:curre nt status and new developments.Hum Reprod,1997;12(80):17562,Reubinoff BE,Shushan A.Preimplantation diagnosis in older patients to biopsy or not to biops

12、y.Hum Reprod,1996;11:207713,Shee U C,Kuang H C,Ming Y W,et al.The simplified two-pipe tte techniqe is more efficient than the conventional three-pipette method for b lastomere biopsy in human embryoes.Fertil Steril,1998;69(3):5694,Ray PF,Winston RML ,Handyside AH.Reduced allele dropout in single -c

13、ell analysis for PGD of cystic fibrosis.J Assist Reprod Genet,1996;13(2):1045,Rechitsky S,Freidine M,Verlinsky Y.Allele dropout in sequential PCR an d FISH analysis of single cell (cell recycling).J Assist Reprod Genet,1996;13(2) :1156,Gitlin SA,Lanzendorf SE,Gibbons WE.PCR amplification specificity

14、: incidence of alllele dropout using different SNA preparation methods for heteroz ygous single cell.J Assist Reprod Genet,1996;13(2):1077,Findlay I,Quirke P,Hall J.Fluorescent PCR:a new technique for PGD of s ex and single gene defcts.J Assist Reprod Genet,1996;13(2):968,Sermon K,Lissens W,Messiaen

15、 L,et al.Preimplantation genetic diagnosis of Marfan syndrome with the use of fluorescent poly merase chain reaction and t he automated laser fluorescence DNA sequencer.Fertil Steril,1999;71(1):1639,Kuliev A,Rechitsky S,Verlinsky O,et al.Preimplantation diagnosis of t halassemias.J Assist Reprod Gen

16、et,1998;15(5):21910,Munne S,Morrison L,Fung J,et al.Reduction of spontaneous abortion aft t er preconception genetic diagnosis of translocations.J Assist Reprod Genet,1998; 15(4):29011,Munne S,Jingly Fung,Michael J,et al.Preimplantation genetic analysis of translocations:case-specific probes for interphase cell analysis.Hum Genet,19 98;102(10):66312,Lily.Constru