1、綜述-利用植物生產疫苗研究進展羅雯，劉瑞琪（西安文理學院生物技術學院，陜西西安710065）要：利用植物生產疫苗已成為當今的研究熱點。本文從植物轉基因的原理、方法、優點及存在問題等方面收稿日期：2013-08-05基金項目：陜西省教殲廳專項科研計劃資助，No.11JKO615：西安市科技局發展引導計劃資助.No.NCH18（3）i國家級大學生創新創業訓練計劃項目資助.No.20121）080003.第一作者簡介：羅雯（1974->.江西南昌人.教授博士.分子微生物學。通信作者：劉瑞琪.摘綜述了轉基因楂物疫苗的研完進展°關鍵詞：疫苗；轉基因植物；生物反應器；研完進展Mason等于

2、1992首次提出用植物生產可食性疫苗，即利用植物基因工程技術構建出可表達特異性抗原的植株，生產出能刺激機體產生特異性免疫應答從而獲得特異抗病能力的疫苗。利用轉基因植物作為生物反應器生產疫苗已成為疫苗研制的熱點領域，目前利用轉基因植物生產的疫苗已達十幾種。利用轉基因植物研制疫苗的研究主要包含兩類：一類是借助植物生物反應器大最產生蛋白質抗原，后經分離純化制備疫苗；另一類是直接構建轉基因植株，將整株或某一部分直接食用，制備成口服疫苗，不需對抗原蛋白進行分離純化。1轉基因植物疫苗的制備原理和方法1.1轉基因植物疫苗研制的一般過程（1）目的基因的克隆；（2）把基因連接入可在植物中表達的載體上，構建高效植

3、物表達載體；（3）通過一定的轉基因方法將外源基因導入植物.使植株攜帶特定抗原的編碼基因，實現植物細胞的遺傳轉化；（4）受體細胞的組織培養與植株再生；（5）檢測抗原蛋白基因在植物中的表達，并對目的產品進行分離純化與純度鑒定；（6）植物表達產物的抗原性及免疫原性檢測。1.2轉基因植物表達系統植物載體表達系統主要分為瞬時表達和穩定表達兩類：（1）瞬時表達系統,由病毒介導外源DNA侵染植物，其表達量較高，但因外源DNA未整合到植物核基因內不能隨植物傳代不穩定.工作量大.且外源基因易丟失。（2）穩定表達系統，有以下兩種方式：一是將目的基因整合到核基因組；二是將目的基因整合到葉綠體基因組。這種方法有利于外

4、源基因定位整合，表達量高，安全性好，但目前只能應用于幾種植物中。1.3轉基因植物疫苗受體植物選擇與疫苗的用途相適應，所選擇的受體植物通常應具備的特點包括：高表達、酎儲藏、可宜接口服等。需根據所表達抗原的類型和疫苗的免疫對象來選擇適宜的植物。國內外實驗室研究常用植物有煙草、谷物類植物、各種蔬菜水果等。K前應用藻類生產疫苗是研究熱點。2利用植物生產的疫苗目前，在轉基因植物中表達的主要有乙型肝炎病毒表面抗原、口蹄疫病毒、死犬病病毒糖蛋白、結核桿曲、輪狀病毒等io多種疫苗。2.1乙型肝炎病毒乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的傳染病.是當前威脅人類健康的重要傳染病。編碼乙型肝炎病毒表面抗原（H

5、BsAg）基因已經在煙草、番茄、馬鈴曹、羽扇豆和茵苣等植物中成功表達。近年來，對乙型肝炎疫苗的研究更加深入。中國研究者成功將HBsAg基因導入櫻桃、蘋果和番茄，獲得轉基因植株并表達出有活性的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。Shulga等構建了含HBsAg基因的植物表達載體，并成功轉化馬鈴磬，表達出抗原蛋白。目前，HBsAg在馬鈴薯中表達量最高。2.2口蹄疫病毒口蹄疫病毒（FMDV）是口蹄疫的病原體，口蹄疫是一種急性、接觸性傳染病，主要感染偶蹄類動物，如牛，羊等家畜及野生動物。口蹄疫結構蛋白VP1含有主要的抗原位點，能誘生機體的保護性免疫應答，包括抗FMDV中和抗體和細胞免疫應答，因此成為基因工程亞單

6、位疫苗研究的首選抗原。在馬鈴落、煙草、番茄、苜蓿、百脈根、玉米、水稻和胡蘿卜植株或葉綠體中表達FMDV病毒VP1衣殼蛋白已取得重要進展。DusSantos等（2002）將FMDVVP1主要抗原表位的肽段和GUS拼接獲得融合基因，將此基因導入苜蓿并成功，免疫小鼠后誘生了特異性抗體應答.該抗體不僅可以與VP1主要抗原表位多肽結合，還可以與VP1蛋白以及FMDV完整病毒顆粒發生特異性免疫結合反應。隨后該研究團隊又將編碼FMDV衣殼蛋白前體的P1基因和蛋白酶3C基因同時轉入紫花苜蓿，免疫小鼠后產生了很強的抗體應答，并能夠完全抵抗強病毒攻擊。2011年，宋東光等3：將FMDV-VP1片段克隆于class

7、Ipatain基因5,區，轉化馬鈴薯塊莖中，獲得了高水平表達的VP1轉基因馬鈴磐植株。2.3狂犬病病毒狂犬病是由狂犬病病毒（RV）引起的急性中樞神經系統傳染病，主要是通過感染動物唾液進行傳播。狂犬病病毒糖蛋白構成病毒表面突起，是RV與細胞受體相結合的部位，又是有效的保護性抗原，能誘導產生中和抗體并刺激細胞免疫。目前，狂犬病病毒糖蛋白已在不同植物中得到表達。多個研究小組“°都探索構建了含狂犬病病毒G蛋白基因的轉基因番茄，對轉基因番茄植株的分析測試表明，轉基因番茄的植株和果實中都轉錄出正確的RNA和能與特異抗血清反應的狂犬病毒抗原蛋白。以波菜為受體植物，Models-ka等皿】用含有狂犬

8、病抗原基因的重組植物病毒顆粒感染葉片，從葉片中提取病毒顆粒對小鼠進行腹膜內免疫，或直接用含有重組病毒顆粒的菠菜葉片口服免疫小鼠，被測小鼠產生了特異IgG和IgA抗體。Ashraf利用煙草作為載體，高效表達了狂犬病病毒糖蛋白，有望構建狂犬病基因工程亞單位疫苗。2.4結核桿菌結核病是由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，是危害人類健康的主要傳染病之一。以結核桿菌分泌蛋白構建轉基因植物亞單位疫苗，通過口服免疫誘發黏膜免疫應答，有望增強卡介苗的免疫效果，并具有較高的安全性。我國研究者*對ESAT-6基因進行修飾改造，在基因兩側分別添加Kozak序列和內質網滯留信號序列，將其最終整合入植物表達載體PCAMBI

9、A1300中，通過葉盤法轉化熱帶水果番木瓜，成功獲得了轉基因植株。Rigano等將ESAT-6與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位在擬南芥中融合表達，飼喂小鼠后檢測到Thl型免疫應答。2.5輪狀病毒輪狀病毒是一種危害人類健康的腹瀉病毒，目前尚缺乏可控性藥物。VP6蛋白是病毒的糖蛋白，VP7蛋白是病毒的主要外殼糖蛋白，決定病毒的血清型，并可誘導中和抗體。目前，已有研究將優化部分密碼子的輪狀病毒VP7基因整合到胡蘿卜植株中，檢測轉VP7基因的胡蘿卜植株，證明在蛋白水平上有目的抗原的表達，并旦可在一定程度增加其表達量：*）Dong等利用人工合成的方法獲得了人A組輪狀病毒VP6基因，并進行了密碼子優化，構建

10、的轉基因苜蓿可表達輪狀病毒VP6抗原。3轉基因植物疫苗的優點及存在的問題3.1轉基因植物疫苗的優點與傳統疫苗相比，利用轉基因植物生產疫苗具有多種優勢：生產成本低廉；可口服，有效誘導黏膜免疫反應；安全無毒性；易于保存和運輸；可快速的大量生產。3.2目前現存問題轉基因植物疫苗現已取得了重要的研究進展，但依舊存在許多問題有待解決。植物疫苗的安全性。不僅僅只指生態安全性問題川、而且還有食用安全性問題。轉基因疫苗的在植物體內的表達量低，效率低。疫苗的耐受性問題。口服疫苗易被消化。雖然細胞壁、細胞膜、次生壁可保護抗原至小腸處再釋放，但其中細節問題仍需研究5】。轉基因植物疫苗的優點使得其具有一定的優勢及光明

11、的前景。相信隨著人們對轉基因植物疫苗的不斷研究，現存為題終會被解決，將其應用于各方面的研究。相信在不遠的將來，轉基因植物疫苗將成為重要的一種疫苗.造福于人類。參考文獻：MASONHS.LAMDMK,ARNTZENCJ.etal.ExpressionofhepatitisBsurfaceantigenintransgenicplantsJj.ProNatlAcadsciUSA.1992.89：11745-11749.2SmithG,WalmsleyA,PolkinghomeI.Plant-derivedimmunocontraceptivevaccinesfJj.ReprodEertilDev.

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15、15)：1838-1843.9 宋東光，張焊松，茂呈榮等.口蹄夜病*VP1基因轉化馬伴薯及其塊莖專一性表達口.生物技術通報.2011.(2)J07-109.A»,».».».A.A-A.AXJ,A,AAA*->.AAAAAAAA八AA.t*tr<Vv»'rVW,r'rvV*wy<,rr"r*vVir»yyyyr(上接第85頁)3結論四種壓榨方法對出油率影響很大，唯冷榨法出油率最高，其工藝簡便，可用于生產。目前，于貓屎瓜籽油壓榨方法的研究資料尚少見，本項研究成為廣泛開發利用貓屎瓜資源的急需彌補

16、了這方面的空白.為貓屎瓜籽油的提取提供了一定的技術參考。_10_.McGarveyPB,HammondJ,DicneltMM,clal.ExpressionoftherabiesvirusglycoproteinintransgenictomatoesJ.Biotechnology(NY).1995；13(13):1484-1487.I1PereaArangoI.LozaRubioE.RojasAnayaE.etal.Expressionoftherabiesvirusnucleoproteininplantsathigh-levelsandevaluationofimmuneresponse

17、sinmiceJj.PlantCellRep.2008j27(4)：677-685.12HuR.ZhangS,FooksAR.etal.Preventionofrabiesvirusinfectionindogsbyarecombinantcanineadenovirustype2encodingtherabiesvirusglycoproteinJMicrobesInfect.2006；8(4)：1090-1097.13 AshrafS,SinghPK,YadavDK,etal.Highlevelexpressionofsurfaceglycoproteinofrabiesvirusinto

18、baccoleavesanditsimmunoprotectiveactivityinmiceJ.JBiotechnol.2005j119(1):1-14.14 張更林.周鵬，郭安平等樗基因番木瓜作為抗姑核植物口服疫苗的初步研究J.云南植物研究.2003j25(2):223-229.(152RiganoMM,DreitzS,KipnisAP.etal.Oralimmunogenicityofaplant-made,subunit,tuberculosisvaccincJ.Vaccine.2006124(5)：691-695.16 劉滿杏，李霓，劉榮堂等.輪狀病*VP7U基因在胡蘿卜中表達的免疫原性分析J.草業科學.2012,29(12),18271831DongJL,LiangEG,JinYS,etal.OralimmunizationwithpBsVp6-transgcnicalfalfaprotectsmiceagainstrotavirusinfectionJ.Virology.2005,339(2):153-163.17 江晚玲,賀竹梅.命守義等.轉基因植物口服疫苗的安全性問題所引發的思考J.醫學與社會.2004,17(2)；17-18,GuanZJ,GuoB*HuoYL.etal.Recentadvancesa