1、PCR技術及其在動物科學領域中的運用摘要：聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增。近年來，PCR技術迅速發展并與其他技術結合衍生出了熒光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技術，運用領域也不斷拓寬，已被廣泛地用于微生物學、醫學、免疫學等領域。本文通過介紹PCR技術及其在動物科學領域中的運用，使讀者對PCR技術有初步的了解并對其運用領域有概況性的認識，更是為了今后的科學研究積累了更多的知識和提供了技術上的支持。關鍵詞：熒光定量PCR RT-PCR 探針 引物

2、（一）PCR技術簡介及其運用概述聚合酶鏈式反應（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）， 簡稱PCR。聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何DNA、RNA的地方。聚合酶鏈式反應又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。1、PCR技術原理雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與

3、下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝，在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。2、PCR工作原理 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經加熱至9095一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引

4、物的退火：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至5560，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。3、PCR種類及運用（1）、RT-PCR 原理：首先提起RNA，然后用逆轉錄酶與MRNA為模板進行CDNA第一鏈的合成，其原理同PCR.。RT-PCR

5、是個半定量的試驗，可以確定在MRNA水平的表達差異，即在轉錄水平 。（2）、免疫PCR(immuno polymerase chain reaction , IPCR ) 原理：是用一段已知DNA 分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應,PCR 擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA 分子,電泳定性,根據特異性PCR 產物的有無來判斷待測抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一種抗原檢測方法,理論上可以檢測單個抗原分子,但實踐中它的敏感性受許多因素的影響,如連接分子、顯示系統的選擇、DNA 報告分子的濃度、PCR 循環次數等。由于PCR 產物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體復合物的量成正比

6、,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗。 （3）、巢式PCR 原理：是用內外兩對引物擴增拷貝數較低的片段。先用外引物進行第一輪反應,將產物適當的稀釋,然后用內引物繼續擴增. 巢式PCR比較適合微量DNA或者石蠟組織抽提的DNA 。（4）、實時熒光PCR 原理：利用熒光來檢測PCR產物，PCR每循環一次就收集一個數據，通過實時擴增曲線，準確確定CT值，從而確定其實DNA拷貝數 。實時PCR，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時間內DNA的增幅量為基礎進行DNA的定量分析。實時PCR的定量使用熒光色素，目前有二種方法，一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素，例如SYBR Green熒

7、光染料；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的一種熒光探針（probe），如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時不發光，當反應體系中存在雙鏈DNA時，SYBR Green與雙鏈DNA結合，此時才發光。Taqman探針帶有一個熒光基團和一個淬滅基團，熒光基團連接在探針的5末端，而淬滅基團則在3末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收PCR擴增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，此時熒光基團發出的熒光信號可以被檢測

8、到。real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結合，能用微量的RNA來找出特定時間、細胞、組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”。（5）、原位PCR技術：原位PCR就是在組織細胞里進行PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術的優點，是細胞學科研與臨床診斷領域里的一項有較大潛力的新技術。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等。其基本方法為：固定組織或細胞：將組織細胞固定于預先

9、用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細胞內源性過氧化物酶。蛋白酶K消化處理：用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55消化處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCR擴增:在組織細胞片上，加PCR反應液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進行PCR循環擴增。有的基因擴增儀帶有專門用于原位PCR的裝置。雜交：PCR擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜交。顯微鏡觀察結果，另外還有膜結合PCR、錨定PCR、固著PCR、原位PCR、不對稱PCR、長距離PCR、降落傘PCR、梯度PCR等30幾種PCR。（二）PCR在動物科學領域中的運用1、PCR在動物產品檢測

10、領域的運用隨著人們生活水平的提高，人們開始越來越關注飲食的健康與安全。近年來，我國的畜牧業發展迅速，動物產品的產量連年增長。但發展過程中也出現了不少的問題，動物產品的質量安全問題就尤為突出，學有效的檢測手段成了我們保障飲食健康的一道關卡。PCR技術不斷取得突破，現已成為檢測食品衛生安全的有效手段。唐吉思【9】定量PCR運用于牛乳中金黃色葡萄球菌（S.aureus)的檢測，實驗中，針對S.aureus SEA基因片段設計一對引物，將構建的重組質粒作為陽性對照，建立S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-timePCR的檢測方法。實驗發現該方法具有較好的特異性和敏感性

11、，能夠快速檢測牛乳中的金黃色葡萄球菌。劉勝貴【1】PCR技術檢測豬肉中沙門氏菌，對已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養物均能準確檢測。對不同稀釋度的樣品進行PCR擴增，當DNA含量只有0.01pg時，還能擴增出條帶，說明該方法檢測豬肉中沙門氏菌具有特異性高且靈敏、快速等特點。李敏【2】表明，將免疫磁珠技術（IMS)與多重PCR結合，24h內即可檢測出食品中的單增李斯特菌，最低檢測限可達1cfu/25g(mL)。李苗云【3】冷卻豬肉貯藏過程中微生物的變化，直接提取不同冷藏天數肉樣DNA，對細菌16SrDNA的v6-v8區段進行PCR擴增，通過DGGE及序列分析，結果表明，冷卻豬肉好氧貯藏過程中的

12、主要微生物有：熱殺索絲菌、莫拉式菌、氣單胞菌、假單胞菌、葡萄球菌和節桿菌，快速檢測冷卻豬肉中微生物污染提供了新手段。2、PCR在動物疫病防治領域的運用 PCR（聚合酶鏈反應）是利用DNA聚合酶在體外大量擴增兩段已知序列之間的某一特定DNA片段(又稱模板)的分子生物學技術。這種技術可以利用幾乎所有的臨床樣品探查病原體基因的存在和變異，從而對生物體的狀態和疫病作出診斷。因而,如何從被檢臨床樣品中高效、簡便地提取核酸作為模板，就成為普及、推廣PCR技術檢測動物疫病亟待解決的問題。 近年來，熒光定量PCR在病原體檢測方面得到了廣泛的運用。羅寶正【6】等將TaqMan探針熒光PCR運用到豬副嗜血桿菌的檢

13、測并使HPS和大腸桿菌0517、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌分開，藺文成【11】等利用TaqMan探針熒光RT-PCR方法對豬細小病毒（ppv）感染的ST細胞48小時后JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2mRNA轉錄水平的檢測發現JAK-1和JAK-2轉錄水平顯著上調，STAT-1和STAT-2轉錄水平顯現下調趨勢證實該方法適用于豬細胞傳導因子JAK和STAT的定量檢測，許紅麗【10】等運用熒光定量RT-PCR對犬瘟熱病毒PS株感染犬血清和糞便中病毒的檢測，檢測中，根據犬瘟熱病毒（CDV）核衣殼蛋白（NP）基因序列設計一對特異引物，擴增NP基因，并以NP基因重組質粒作為陽性

14、標準品，建立CDV的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法。實驗結果表明：較常規RT-PCR該方法敏感性提高100倍，可以用于CDV病毒的致病機理及病毒傳播途徑的研究提供快速而敏感的檢測。楊少華【12】等建立了禽流感病毒RT-PCRELISA診斷方法，通過對A型禽流感（AI）保守的M基因設計引物，并分別用地高辛和生物素標記，建立檢測A型AIV的 RT-PCRELISA方法，并對反應條件進行了優化，確定了最適反應條件，使得該方法的敏感性比常規瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高100倍以上且特異性強，克服了樣品含量少的困難，為早禽流感診斷和分子流行病學調查提供了一條新途徑。3、PCR在飼料開發與

15、分析領域的運用在動物生產的過程中飼料的營養均衡至關重要，傳統的谷物飼料一般難以滿足動物對蛋白質的需要，因此需要在飼料中動物源性飼料，以滿足動物生產對蛋白質的需求。近年來，由于各種疫病的流行和新的危害性極大的傳染病的出現，動物源性飼料的安全性難以保證。而PCR技術則為飼料中動物源性成分的檢測提供了有效地手段。于鳳芹【4】等將實時熒光PCR法運用到檢測飼料中雞源性成分，根據雞線粒體DNA 建立Taqman探針實時熒光PCR檢測飼料中雞源性成分方法，并證實該方法特異性高，極具實用價值。4、PCR在動物遺傳育種、基因表達、早期胚胎鑒定領域的運用隨著分子生物學的迅猛發展，研究動物遺傳提供了理論依據和強大

16、的技術支持。其中PCR技術也被廣泛運用于動物遺傳領域的研究。趙秀華【5】R-SSCP方法檢測京海黃雞、AA雞、尤溪麻雞、邊雞4個雞品種STAT5b基因5調控區部分序列的多態性，并分析其對京海黃雞生長繁殖性狀的遺傳效應發現京海黃雞STAT5b基因5控區部分序列的多態性對其生長和繁殖性狀有一定影響。張跟喜【7】PCR-SSCP技術檢測邊雞生長抑制素（MSTN)基因外顯子的3的單核苷酸多態性，并與邊雞的繁殖性狀進行關聯分析發現了MSTN基因可能是影響邊雞繁殖性狀的一個主效基因或是與之存在緊密遺傳連鎖的一個標記。王學清【8】CR技術運用于牛早期胚胎性別的鑒定，在鑒定試驗中裴翠娟等根據GenBank中收

17、錄的牛Y染色體特異序列和牛基因組序列分別設計公牛特異引物和內標引物，通過對引物濃度的組合、dNTP濃度、Mg2+濃度、退火溫度的篩選優化PCR反應體系，擴增牛基因組DNA和胚胎基因組DNA，建立用于牛早期胚胎性別鑒定的多重PCR反應體系，該方法能實現奶牛良種的快速擴繁。綜上所述，PCR技術日新月異的發展極大地推動了動物科學領域的研究，為動物科學分子領域的提供了強大的技術支持。在未來，隨著PCR技術創新，還將運用在動物科學領域其他方面，做出新的貢獻。做為動物科學領域的研究者，我們應該重視PCR技術運用與創新，讓這門技術能夠更好地服務于社會。參考文獻：【1】劉勝貴，魏麟.應用PCR技術檢測豬肉中沙

18、門氏菌的研究J.科學食品，2007,28（3）：254-256.【2】 李敏，孟謹，鄭小平,等.IMS-PCR對食品中單增李斯特菌快速檢測J.乳業科學與技術.2010(3):1030-1032【3】 李苗云，周光宏，徐幸蓮.運用PCR-DGGE研究冷卻豬肉貯藏過程種的優勢菌J.西北農業科技大學學報，2008,36（9）：185-189【4】 于鳳芹，王金玲，龐杰，王芳，姜麗，張瑩.實時熒光PCR法檢測飼料中雞源性成分.中國動物檢疫，2009,05【5】 趙秀華，王金玉，等.STAT5b基因2個SNPs位點與京海黃雞生長和繁殖性狀的關聯分析.中國畜牧雜志，2012,48（1）：1-4【6】 羅寶正，王振全，等.TaqMan探針熒光PCR檢測副豬嗜血桿菌方法的建立和應用J.江蘇農業學報，2011，27（6）：1367-1370【7】 張跟喜，趙秀華，等.肌肉生長抑制素基因外顯子3的多態性及其與邊雞繁殖性狀的關聯分析.中國畜牧雜志，2012,48（1）：9-11【8】 王學清，裴翠娟，等.鑒別牛早期胚胎的多重PCR技術研究.華北農學報，2011,26（6）：89-93【9】 唐吉思，吳金花，等.熒光定量PCR檢測牛乳中金