1、大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的超聲表現(xiàn) 作者：吳蔚，卓麗莎，丁俊，何蕓，華興【摘要】 目的 評價大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的超聲表現(xiàn)。方法 建立大鼠心臟同系移植與同種異體移植模型。以14 MHz高頻探頭對手術(shù)后第1、3、6天移植心臟行超聲心動圖檢查，于乳頭肌水平左室短軸切面測量左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室壁厚度（LVT）、室壁增厚率（LVTR）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），并比較同系移植與同種異體移植間差異。結(jié)果 同系移植組移植心無急性排斥反應(yīng)發(fā)生；同種移植組術(shù)后第3天的移植心病理分級為III級；移植后第6天的病理分級為IIIIV級。同系移植組中，術(shù)后第1、3、6天動態(tài)觀察各超聲指標(biāo)無明

2、顯變化（P>0.05）。同時段兩組間比較，LVDd無顯著差異（P>0.05）；術(shù)后第6天，同種異體移植組LVEF明顯低于同系移植組（P<0.05）；術(shù)后第3、6天，同種異體移植組LVT明顯高于同系移植組（P<0.01），而LVTR則明顯較低（P<0.01）。結(jié)論 高頻超聲檢查可動態(tài)顯示大鼠心臟移植的解剖形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的改變，判斷不同程度急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，LVT和LVTR可作為其評價的敏感指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】 心臟移植；急性排斥反應(yīng)；超聲檢查 Abstract: Objective To evaluate the ultra

3、sonography of acute rejection of heart transplantation in rat model. Methods Models of isotransplantation and allotransplantation in rats were established with Brown Norway rats as donors and Lewis rats as acceptors. Ultrasonography was performed at day 1,3,6 after heart transplantation with a trans

4、ducer of 14 MHz. Left ventricular diastolic diameter (LVDd), left ventricular thickness (LVT), left ventricular thickening rate (LVTR) and left ventricular ejection fraction (LVEF) were detected at the view of the short axis of the left ventricle and comparisons were made between isograft model and

5、allograft model. Results No rejection was showed in isograft model while rejection of 12 level and 34 level were detected in allograft model at day 3,6 after transplantation respectively. Little ultrasonographic changes were observed in isograft model at day 1,3,6 after heart transplantation (P&

6、gt;0.05). There was no significant difference of LVDd between two models at the same time(P>0.05),howerver, LVEF was significantly lower in allograft model at the 6th day (P<0.05), LVT was obviously higher in allograft model and LVTR was remarkably lower in allograft model at the 3rd a

7、nd 6th day (P<0.01). Conclusion Ultrasonography of high frequency can realtime reflect the changes of anatomic form, structure and function of the transplanted heart and LVT and LVTR can be employed as the sensitive indices when judging the occurence of acute rejection. Keywords: heart transp

8、lantation; acute rejection; ultrasonography 目前，同種異體心臟移植已成為臨床上治療終末期心臟病的一種較為有效的方法。術(shù)后排斥反應(yīng)，尤其是急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）已經(jīng)成為繼供心保存、外科手術(shù)、術(shù)后感染之后阻礙心臟移植成功的最主要因素12。大鼠心臟移植模型是研究心臟移植后AR的良好動物模型，但由于急性排斥反應(yīng)是一個動態(tài)進(jìn)展過程而大鼠心臟體積較小，故臨床檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”心內(nèi)膜心肌活檢，有創(chuàng)且操作難度較大，不適用于實(shí)驗(yàn)條件下大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的動態(tài)監(jiān)測與評價。超聲檢查是一項(xiàng)無創(chuàng)、直觀、操作簡便且重復(fù)性較好的影像學(xué)檢查方法

9、。本研究以高頻超聲對大鼠移植心臟進(jìn)行檢查，觀察其聲像圖特點(diǎn)，測量并比較相關(guān)指標(biāo)，以評價超聲在評價大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型中的價值。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動物 隨機(jī)采用近交系大鼠，Brown Norway大鼠為供體，Lewis大鼠為受體。實(shí)驗(yàn)動物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，均為雄性，體重（225±34）g，SPF級。1.2 超聲儀器 采用德國西門子公司Sequoir 512彩色多普勒診斷儀，15L8WS探頭，頻率14 MHz，自帶心臟條件，深度2 cm，聚焦于1.5 cm，平均灰度65 dB。實(shí)驗(yàn)過程中儀器設(shè)置不變。1.3 分組 首先建立6只Brown Norway到

10、Lewis大鼠的同種異位心臟移植模型，其移植心存活時間分別為5、7、5、7、6、6 d，中位數(shù)是6 d。取其中位數(shù)，作為以下分組的依據(jù)。同種移植組（n=18），建立Brown Norway到Lewis大鼠的同種異位心臟移植模型，分別于術(shù)后第1、3、6天各抽取4只行超聲檢查，然后活殺取移植心；剩余6只大鼠待移植心停跳后取移植心。同系移植組(n=18)，建立Lewis到Lewis大鼠的同系異位心臟移植模型，分別于術(shù)后第1、3、6天各抽取4只行超聲檢查，然后活殺取移植心；剩余6只大鼠觀察移植心存活時間并于術(shù)后60 d時活殺。1.4 大鼠異位心臟移植模型的建立 采用Ono氏法建立大鼠腹腔異位心臟移植模

11、型1。先游離受體大鼠腹部供吻合的腹主動脈和下腔靜脈段，然后切取供心，進(jìn)行異位心臟移植手術(shù)，供心的主動脈及肺動脈分別與受體腹主動脈和下腔靜脈端側(cè)吻合。恢復(fù)血液供應(yīng)后，若移植心搏動良好且無明顯出血則關(guān)腹。1.5 觀察指標(biāo)1.5.1 移植心存活時間術(shù)后通過觸摸監(jiān)測移植心存活情況，以移植心停跳判定為排斥反應(yīng)及移植物存活終點(diǎn)。1.5.2 超聲檢測指標(biāo)于乳頭肌水平左室短軸切面測量，左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd），取左右徑與前后徑的平均值；舒張末期左室壁厚度（LVDT）、收縮末期左室壁厚度（LVST），取左室后壁與室間隔厚度的平均值為左室壁厚度（LVT）；計(jì)算室壁增厚率（LVTR）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

12、由于移植心臟心電圖無法引出，舒張末期與收縮末期時間點(diǎn)分別設(shè)為心腔舒張擴(kuò)大至最大和收縮至最小時刻。所有測量值取3次測量的平均值。1.5.3 排斥反應(yīng)的診斷和分級各組受體活殺后，切取移植心，用質(zhì)量濃度為100 g/L的甲醛溶液固定，石臘包埋切片，HE染色，光鏡下觀察各組移植心的病理學(xué)改變，采用Stanford標(biāo)準(zhǔn)對移植心排斥反應(yīng)進(jìn)行組織學(xué)分級2。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，同系移植與同種異體移植組間各指標(biāo)的比較采用非配對t檢驗(yàn)，同一組內(nèi)部各指標(biāo)隨時間的變化采用方差分析。P<0.05為差異有顯著性意義，P<0.01為差異

13、有非常顯著性意義。2 結(jié)果2.1 各組移植心存活時間 同種移植組移植心存活時間5.387.63 d，平均存活時間為（6.41±0.78）d，同系移植組移植心存活時間均大于60 d，兩組比較有非常顯著性差異（P<0.01）。2.2 各組移植心組織病理學(xué)改變 同種移植組排斥終末期移植心心肌組織均呈III BIV級急性排斥反應(yīng)，同系移植組術(shù)后60 d活殺取移植心，其心肌組織均未見明顯急性排斥反應(yīng)跡象。兩組各時間點(diǎn)病理學(xué)分級對比見表1。表1 各時間點(diǎn)組織病理學(xué)分級（略）2.3 超聲檢查 30例成功移植的大鼠心臟均可顯示清晰的左室短軸切面（圖1）。術(shù)后第6天，3只同系移植心臟觀察

14、到左室內(nèi)血栓形成，3只同種異體移植心臟觀察到左室內(nèi)血栓形成，其中2只同種異體移植心臟觀察到心臟周圍積液。 同系移植組與同種異體移植組超聲檢查各指標(biāo)測值隨時間變化情況見表2。同系移植組中，術(shù)后第1、3、6天動態(tài)觀察各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化（P>0.05）。同時段兩組間比較，LVDd無顯著差異（P>0.05）；術(shù)后第6天，同種異體移植組LVEF明顯低于同系移植組（P<0.05）；術(shù)后第3、6天，同種異體移植組LVT明顯高于同系移植組（P<0.01），而LVTR則明顯較低（P<0.01），且隨著移植時間的增加，LVT和LVTR分別呈現(xiàn)逐

15、漸增加和逐漸降低的趨勢。表2 同系移植組與同種異體移植組超聲檢查各指標(biāo)不同移植時間比較(略)3 討論 心臟移植是公認(rèn)的治療終末期心臟病最有效的方法,50%的心臟移植術(shù)后會發(fā)生AR。AR是導(dǎo)致器官移植失敗和病人死亡的主要原因之一3。AR是同種異基因器官移植中最常見的一類排斥反應(yīng)，一般在移植術(shù)后數(shù)天至兩周左右出現(xiàn)，80%90%發(fā)生在術(shù)后1個月內(nèi)。大鼠基因背景清楚，培養(yǎng)較容易且價格相對低廉，是目前心臟移植的實(shí)驗(yàn)研究中最常用的動物。其心臟移植模型能良好反映急性排斥反應(yīng)病理變化4。基因型完全相同的鼠個體之間的移植為同系移植，移植后不會發(fā)生排斥反應(yīng)，基因型不同的鼠個體之間的移植為同種(異體)移植，由于其遺

16、傳背景完全不同，會發(fā)生排斥反應(yīng)，且發(fā)生的排斥反應(yīng)強(qiáng)度基本一致。由于該模型AR的病程較短，一般為57 d，故尋找一種簡便有效的評價方法對于該模型的動態(tài)觀察及實(shí)驗(yàn)運(yùn)用十分重要。雖然目前心內(nèi)膜心肌活檢（endomyocardial biopsy，EMB）是心臟移植后診斷排斥反應(yīng)和監(jiān)測免疫抑制治療的唯一“金標(biāo)準(zhǔn)”，但EMB是有創(chuàng)的檢查，并且有可能導(dǎo)致小動物的死亡，因而EMB在動態(tài)監(jiān)測方面的應(yīng)用受到很大限制。常用的診斷方法中，臨床癥狀和體征、心電圖和X光片等常規(guī)檢查均可提示AR的發(fā)生，但敏感性均較低。臨床上常用的免疫學(xué)檢測指標(biāo)有淋巴細(xì)胞亞群百分比和功能測定與免疫分子水平測定，存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高等

17、問題，而且不利于小動物的反復(fù)檢測。 超聲檢查是一項(xiàng)操作簡便、無創(chuàng)的影像學(xué)檢查方法，可實(shí)時觀察心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)及運(yùn)動情況，并能精確測量室壁心腔徑線大小5。大鼠心臟的體積遠(yuǎn)小于人類心臟，本實(shí)驗(yàn)采用高頻探頭（14 MHz），顯著提高了超聲檢查的分辨率，可清晰顯示和測量大鼠心臟的二維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，由于同系移植未產(chǎn)生排斥反應(yīng)，故各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化。而同種異體心臟移植的大鼠，于手術(shù)后第3、6天（即IIIV級排斥反應(yīng)），除LVDd外，其余三項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的變化。反映收縮功能的指標(biāo)LVEF，僅在急性排斥反應(yīng)的終末期才有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明收縮功能的改變對于急性排斥反應(yīng)的早期診斷意義不大。而且大鼠心臟移植非原位

18、移植，移植心臟本身并不做功，左室屬于曠置腔室，因此同系移植心臟與同種異體心臟左室中均可見血栓的形成。而血栓的形成又可影響心室壁的搏動，從而影響到LVEF超聲測量的不準(zhǔn)確性。相對于LVEF，反映左室質(zhì)量的LVT及LVTR的變化更為敏感。其可能原因?yàn)椋毙耘懦夥磻?yīng)發(fā)生后，心肌細(xì)胞及間質(zhì)水腫，大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致心肌厚度和質(zhì)量的增加，而心肌彈性的降低，則會導(dǎo)致室壁舒縮厚度變化的降低6。目前實(shí)驗(yàn)研究中常用的觸診法，以觸診感覺移植心臟的搏動來判斷排斥反應(yīng)的發(fā)生。與之相比，超聲檢查操作同樣簡便，但LVT及LVTR能更敏感、更早期地反映急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。 高頻超聲檢查可動態(tài)顯示大鼠心臟移植的解

19、剖形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的改變，判斷不同程度急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，LVT和LVTR可作為其評價的敏感指標(biāo)，也為大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用的定量控制，提供了一個簡便、無創(chuàng)且重復(fù)性好的方法78。【參考文獻(xiàn)】 1 Ono K, Lindsey ES. Improved technique of heart transplantation in ratsJ. J Thorac Cardiovasc Surg, 1969,57(2):225-229.2 Billingham ME, Cary NR, Hammond ME, et al. A working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart and lung rejection: Heart Rejection Study Group. The