1、大腸癌中MTA1和HIF-1的表達與淋巴管生成的關系 作者：楊珍玉 周序瓏 夏明汗 蔣光喻 鐘雪云 杜彬【摘要】 【目的】 探討大腸癌中轉移相關基因1(MTA1)、缺氧誘導因子-1(HIF-1)蛋白的表達及其與淋巴管生成的關系。【方法】 用免疫組織化學SP法檢測81例大腸癌中MTA1、HIF-1蛋白的表達及D2-40標記的淋巴管密度。【結果】 81例大腸癌中MTA1、HIF-1陽性表達率分別為66.7%和63%，MTA1和HIF-1的表達均與大腸癌Duke?蒺s分期和淋巴結轉移相關(P < 0.05)而與組織學分級和浸潤深度無關(P > 0.05)，大腸癌中MTA1

2、和HIF-1蛋白表達呈正相關(P < 0.05)，MTA1和HIF-1蛋白過表達病例腫瘤旁淋巴管密度分別為18.4 ± 4.9、18.0 ± 5.3，高于MTA1和HIF-1不表達和弱表達病例(15.6 ± 4.5、15.4 ± 4.2)，兩者的差異有統計學意義(P < 0.05)。【結論】 MTA1和HIF-1蛋白的過表達可能促進了大腸癌旁淋巴管的生成，在腫瘤淋巴結的轉移中起一定作用。 【關鍵詞】 結直腸癌; MTA1; HIF-1; 淋巴管密度Abstract： 【Objective】 To investigate the

3、 expression of metastasis-associated gene 1 (MTA1)， hypoxia inducible-factor l alpha (HIF-1) in human colorectal cancer and to explore the relationship between their expression and lymphangiogenesis. 【Methods】 The expression of MTA1 and HIF-1， and D2-40 marked lymphatic vessel density (LVD) were det

4、ected by immunohistochemical staining in eighty-one human colorectal cancer cases. 【Results】 The positive rates of MTA1 and HIF-1 expression were 66.7% and 63.0 % respectively in the eighty-one human colorectal cancer cases. The expression of MTA1 and HIF-1 were both correlate with Dukes stage and l

5、ymph node metastasis (P < 0.05) but did not correlate with the pathological grade and depth of invasion (P > 0.05). In addition， MTA1 and HIF-1 expression has a positive correlation in human colorectal cancer (P < 0.05). In MTA1 and HIF-1 over-expression cases， the peritumoral L

6、VD was 18.4 ± 4.9 and 18.0 ± 5.3 respectively and was higher than that of the MTA1 and HIF-1 expression none or weak cases (15.6 ± 4.5， 15.4 ± 4.2)， the difference has statistically significance (P < 0.05). 【Conclusion】 The overexpression of MTA1 and HIF-1 in colorectal ca

7、ncer possibly promote the cancer lymphangiogenesis and play a role in lymph node metastasis.淋巴道轉移是大腸癌轉移的重要途徑，而淋巴管的生成則是促進大腸癌淋巴道轉移的主要因素。MTA1(metastasis-associated gene 1)是近年來發現的一個與腫瘤轉移密切相關的癌基因，MTA1可促進大腸癌侵襲轉移，但其與淋巴管生成的關系尚不明確1。HIF-1是一種腫瘤細胞缺氧條件下誘導的核轉錄因子，已有研究表明HIF-1與乳腺癌、胰腺癌的淋巴管生成相關2-3。特別值得注意的是，MTA1可直接影響HI

8、F-1蛋白的穩定性和轉錄活性來促進乳腺癌的轉移4，那么大腸癌中MTA1和HIF-1的表達是否有相關性及其與淋巴管生成的關系值得進一步深入研究。本研究用免疫組織化學的方法檢測81例大腸癌切除腫瘤組織中MTA1和HIF-1的表達及用淋巴管特異性標記物D2-405標記的腫瘤淋巴管密度，探討大腸癌中MTA1和HIF-1的表達與淋巴管生成的關系。1 材料與方法1.1 臨床資料收集暨南大學附屬第一醫院2007年9月至2008年12月81例大腸癌手術切除標本。其中男性患者45例，女性患者36例，年齡從21歲到93歲，平均年齡61.2歲。81例大腸癌中，高中分化癌59例，低分化癌19例，另外3例粘液腺癌并為低

9、分化癌，有淋巴結轉移者40例，其中一例有肝轉移，無淋巴結轉移者41例。患者在手術前均未接受過放化療。所有標本經100 mL/L甲醛固定，常規石蠟包埋，4 m厚連續切片，分別做常規HE染色和免疫組織化學染色。1.2 主要實驗試劑鼠抗人MTA1單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體和兔抗人HIF-1多克隆抗體分別購自美國Santa Cruz公司，福州邁新生物技術開發公司和武漢博士德生物工程公司。羊抗鼠和羊抗兔SP試劑盒購自福州邁新技術開發公司，DAB顯色液購自中杉金橋生物技術公司。1.3 免疫組織化學染色染色方法按照鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法試劑盒說明書步驟進行。用已知陽性表達的癌組

10、織做陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。組織均用pH 6.0的檸檬酸修復液微波修復抗原處理。鼠抗人MTA1單克隆抗體經1：50稀釋后用于實驗，其它兩種抗體均為即用型工作液。1.4 結果判定1.4.1 MTA1和HIF-1陽性判定MTA1和HIF-1均為細胞漿或核表達。胞漿或胞核內出現棕黃色顆粒為陽性。判定標準綜合染色強度和著色細胞數量進行分級：著色略高于背景和著色細胞數 > 10%為陽性;細胞數 < 25%，著色較弱為弱陽性;細胞數為25% 50%，著色較強為中度陽性;細胞數 > 50%，著色強為強陽性。其中，中度和強陽性為過表達。1.4.2 淋巴管計

11、數方法參照Vermeulen等6-7所用方法，先在40倍視野下尋找淋巴管密度最多的區域，再在200倍視野下計數D2-40陽性的淋巴管個數。取3個視野淋巴管的平均值即為所計淋巴管密度。1.5 統計學方法采用SPSS 13.0統計學軟件，率進行2檢驗，淋巴管密度的比較用t檢驗，相關分析采用Spearman檢驗， P < 0.05為有統計學意義。2 結 果2.1 MTA1和HIF-1的表達和臨床病理指標的關系MTA1和HIF-1的陽性表達均以胞漿為主，僅很少量核表達(圖1A，B)。MTA1表達陽性率為66.7%，其中中度和強陽性病例有23例，弱陽性有31例，陰性有27例;HIF-1陽性

12、率為63%，中度和強陽性有28例，弱陽性有23例，陰性有30例。MTA1和HIF-1的陽性表達均與分化程度無關(2 = 1.529，P > 0.05; 2 = 0.353， P > 0.05)，與浸潤深度無關(2 = 0.368， P > 0.05; 2 = 0.732，P > 0.05)，但與淋巴結轉移和Duke?蒺s分期相關(2 = 4.173，P < 0.05;2 = 4.910，P < 0.05，表1)。2.2 MTA1和HIF-1表達的相關性MTA1陽性的54例大腸癌中，HIF-1陽性率為72.2%(

13、39/54);MTA1陰性的27例中，HIF-1陽性率為44.4%(12/27)。MTA1和HIF-1的表達存在正相關性(rs = 0.271，P < 0.05，表2)。2.3 淋巴管的觀察淋巴管被染成棕黃色，腫瘤旁比較明顯，大多都呈擴張狀態，管腔不規則，管壁很薄，為扁平的內皮細胞所圍成，不見肌層(圖1C)。有淋巴結轉移的病例，腫瘤旁淋巴管密度為18.1 ± 5.3，無淋巴結轉移的病例，腫瘤旁淋巴管密度為15.2 ± 3.9。經統計學分析，有、無淋巴結轉移的病例腫瘤旁淋巴管密度的差異有統計學意義(t = 2.508，P < 0.05)。2.4 M

14、TA1和HIF-1的表達與腫瘤旁淋巴管密度的關系MTA1中度和強陽性的病例腫瘤旁淋巴管密度為18.4 ± 4.9，MTA1陰性和弱陽性的病例腫瘤旁淋巴管密度為15.6 ± 4.5，低于MTA1過表達的病例， 兩者腫瘤旁淋巴管密度的差異有統計學意義(t = 2.183，P < 0.05);同樣HIF-1中度和強陽性的病例腫瘤旁淋巴管密度(18.0 ± 5.3)高于HIF-1弱和不表達病例(15.4 ± 4.2)，其差異有統計學意義(t = 2.230，P < 0.05，圖2)。3 討 論3.1 MTA1及HIF-1與大腸癌淋巴管

15、生成的關系淋巴道轉移是大腸癌等上皮性腫瘤發生轉移的主要方式，淋巴管生成則是腫瘤淋巴道轉移的重要機制。引起淋巴管生成的分子機制尚未明了，MTA1和HIF-1可能都是影響淋巴管生成的因素。目前已明確，MTA1是促進大腸癌等多種腫瘤轉移的關鍵分子。Toh等1人和本研究組前期研究8分別從mRNA與蛋白質水平證實，大腸癌組織中MTA1過度表達與淋巴結轉移陽性率顯著相關。本研究的結果顯示MTA1過表達時大腸癌旁淋巴管密度LVD增加，則進一步提示MTA1可能通過影響淋巴管生成來促進大腸癌淋巴道轉移。HIF-1是缺氧狀態引起腫瘤細胞轉移的關鍵分子。正常氧條件下，HIF-1易被泛素蛋白酶體系統降解。缺氧時，HI

16、F-1降解受阻，蛋白量增多，HIF-1與靶基因中的缺氧反應元件結合啟動了靶基因的轉錄9。HIF-1可通過調控這些靶基因來影響腫瘤淋巴管的生成，從而促進腫瘤細胞的轉移 。Katsuta等10在食管癌組織中用免疫組織化學的方法證明：HIF-1的表達能促進血管內皮生長因子VEGF-C的表達，且HIF-1的表達與腫瘤細胞浸潤淋巴管有關，提示HIF-1可能通過調節VEGF-C的表達在腫瘤淋巴管的轉移中起一定的作用。Schoppmann等2也用同樣的方法在乳腺癌組織中研究認為HIF-1與VEGF-C的表達和淋巴管的生成有關。另外在胰腺癌、口腔鱗狀細胞癌等腫瘤中也有報道HIF-1能促進淋巴管生成3，11。我

17、們研究也發現HIF-1過表達增加大腸癌旁淋巴管密度LVD，可見HIF-1可通過促進腫瘤淋巴管的生成而促進腫瘤細胞淋巴結轉移。3.2 大腸癌中MTA1和HIF-1表達的相關性關于MTA1和HIF-1的相關性目前研究尚不多見。MTA1可參與組成NuRD復合物，與HDAC1、HDAC2相互作用使組蛋白去乙酰基、核小體重塑從而抑制基因的表達12。最近有報道HDAC1/MTA1復合物能使HIF-1去乙酰基而穩定，同時也增強了HIF-1轉錄活性而使血管生成增加，為腫瘤的生長和轉移提供了有利條件13。朱曉霞等14報道在肺癌組織中MTA1的表達與HIF-1的表達有顯著相關性。我們研究發現大腸癌中MTA1和HI

18、F-1的表達呈正相關，且促進了大腸癌淋巴結轉移，這再次提示MTA1可能通過穩定HIF-1蛋白促進了大腸癌轉移。特別是，我們還發現MTA1過表達的病例，大腸癌旁淋巴管密度增多，提示MTA1可能通過HIF-1的表達誘導淋巴管生成。綜上所述，MTA1和HIF-1的過表達與大腸癌淋巴道轉移密切相關，兩者都是判斷大腸癌預后的重要指標。而且MTA1很可能通過穩定HIF-1蛋白來促進大腸癌旁淋巴管的生成，從而有利于大腸癌轉移。【參考文獻】 Toh Y， Oki E， Oda S， et al. Overexpression of the MTA1 gene in gastrointestinal carci

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