1、PDTC對壓力負荷過度誘導小鼠心肌肥大的防護作用及其機制研究 06-07-01 16:27:00 作者：李躍華，李菁，闕玲俐編輯：studa20【摘要】 目的 觀察吡咯烷二硫基甲酸鹽（PDTC）對心肌肥大發生發展的影響并探討其機制。方法 以縮窄小鼠主動脈弓(TAC)誘導的心肌肥大為模型，觀察PDTC對心肌肥大發生發展的影響，并采用EMSA檢測心肌組織中NF-B結合活性，應用Western blot方法分析心肌組織中phospho-GSK3的表達水平。結果 (1)縮窄小鼠主動脈弓2周后，心臟重量/體重比值與假手術組相比增高48.7% (P0.01)，而且肥大心肌組織中NF-B結合活性和phosp

2、ho-GSK3(Ser9)蛋白表達明顯高于假手術組(P0.01)。(2)PDTC可明顯減輕TAC誘導的心肌肥大，與TAC模型組相比可以使小鼠心臟重量/體重比值下降16.4%(P0.05)。PDTC可抑制心肌組織中NF-B活性，與TAC模型組相比降低了34.3%(P0.01)，同時亦可抑制心肌組織中GSK3(Ser9)磷酸化水平，p-GSK3(Ser9)/ GSK3比TAC模型組降低了22.1%(P0.05)。結論 PDTC可以通過抑制NF-B結合活性和GSK3（Ser9）磷酸化水平延緩心肌肥大的發生發展。 【關鍵詞】 心肌肥大；吡咯烷二硫基甲酸鹽；核因子B； 糖原合成激酶-3 【Abstrac

3、t】 Objective To investigate the role and mechanism of PDTC on the development of cardiac hypertrophy in vivo.Methods PVB/N mice were employed and cardiac hypertrophy was induced by transverse aortic constriction for 2 weeks.Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to determine NFkB bindi

4、ng activity with nuclear proteins extracted from heart tissues； Western blots were performed to examine the phosphorylation of GSK-3. In a separate experiment， PDTC was administered into mice subjected to transverse aortic constriction for 2 weeks.Results (1)Transverse aortic constriction(TAC) signi

5、ficantly increased the ratio of HW/BW. Two weeks after TAC， the ratio of HW/BW was significantly increased by 48.7%(P0.01)， compared to age-matched sham control. NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3(Ser9) were significantly increased at 2 weeks following TAC compared to age-matched

6、sham control (P0.01).(2)Administration of PDTC into TAC mice for 2 weeks， significantly reduced the ratio of HW/BW by 16.4%(P0.05)， compared to non-treated TAC mice. NFkB binding activity was significantly reduced by 34.3% (P0.01) in the hearts administered with PDTC for 2 weeks， compared to non-tre

7、ated TAC group. In addition，administration of PDTC also decreased the level of phospho- GSK-3(Ser9)/ GSK-3 by 22.1%(P0.05) compared to non-treated TAC group.Conclusion PDTC inhibit the NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3(Ser9) in hypertrophic heart tissues and thereby attenuates th

8、e development of cardiac hypertrophy. 【Key words】 cardiac hypertrophy；pyrrolidine dithiocarbamate；NF-B；GSK-3 心肌肥大是心臟對生物機械牽張和神經體液刺激的一種主要反應。雖然早期心肌肥大是心臟維持有效心輸出量的一種代償性機制，但持久的心肌肥大會導致心臟進入失代償階段，繼而發生不可逆轉的心肌肥大和擴張，心肌收縮力下降，導致心力衰竭1，2。調控心肌細胞肥大的詳細分子機制及關鍵的信號轉導通路迄今尚未闡明。最近的研究提示核因子-B（nuclear factor kappa B，NF-B）信號通路可

9、能在心肌肥大的發生發展中起著重要作用2，3。吡咯烷二硫基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate ，PDTC）是NF-B抑制劑，通過其抗氧化作用可抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）誘導的反應性氧自由基的產生和NF-B活性4。Dechend等也報道抗氧化劑可通過抑制NF-B活性而解除Ang所誘導的心肌細胞肥大性反應5。然而，Hayakawa等報道PDTC抑制NF-B活性與抗氧化功能無關6。為此，本研究以壓力負荷增加誘導的小鼠心肌肥大為模型，進一步探討PDTC抑制NF-B活性的機制，并觀察PDTC對心肌肥大發生發展的影響。 1 材料與方法

10、1.1 材料 藥品與試劑：水合氯醛、PDTC(Sigma 公司產品)；NF-B寡核甘酸、T4 Polynucleotide kinase、Gel Shift Banding 5xBuffer(Promega公司產品)；Pierce BCA蛋白分析試劑(Pierce化學公司產品)；-32pATP(3000Ci/mmol)(Amersham公司產品)；p-GSK3(Ser9)、 anti-Rabbit IgG HRP-Linked抗體(Cell Signaling公司產品)；GSK3(H-76)(Santa Cruz Biotechnology公司產品)；ECL化學發光試劑盒(Amersham，P

11、iscataway，NJ)；Kaleidoscope Prestained Standards蛋白質Marker(BIO-RAD公司產品)；SDS、丙烯酰胺、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)(Sigma公司產品)。實驗動物：雄性PVB/N小鼠，美國東田納西州大學實驗動物中心提供。 1.2 方法 小鼠心肌肥大模型的建立 PVB/N小鼠周齡達67周時，經水合氯醛麻醉后，通過氣管插管與嚙齒動物呼吸機連接，進行人工通氣。于胸部左側第23肋間打開胸腔，分離主動脈弓并在其下穿一絲線，按統一標準使主動脈縮窄(Transverse aortic constriction，TAC)，關閉胸腔。假手術組除了不

12、進行TAC外，其余手術程序完全與模型組相同。 實驗分組及給藥 實驗分為3組：(1)假手術組：假手術組除了不進行主動脈縮窄外，其余手術程序完全與模型組相同；(2)TAC模型組：縮窄主動脈弓二周；(3)PDTC處理組：小鼠于TAC前1h開始腹腔注射PDTC，劑量120mgkg-1d-1，持續2周。 樣本的收集與檢測 (1)心臟重量/體重比值：TAC 2周后，用水合氯醛麻醉小鼠后，取出心臟，統一標準修剪心臟、稱重，計算心臟重量/體重比值，作為評估心肌肥大的指標。取左心室，-70保存待用；(2)胞漿、胞核蛋白的提取：左心室肌組織中加入Buffer A充分勻漿，在冰上放置1530min，再加入適量的10

13、%NP-40，混勻1min，4、10000r/min離心3min，上清即為胞漿蛋白。沉淀用Buffer C懸浮混勻，冰上放置12h，不時振動，再在4、14，000轉/min離心10min，上清即為核提取物。采用Bradford方法，以BSA作標準測定胞漿和胞核蛋白濃度。胞漿和胞核蛋白提取物于-80保存備用；(3)NF-B活性的檢測：采用凝膠遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay， EMSA）方法。本實驗中NF-B同序寡核苷酸探針如下：3-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5；5-AGT TGA GGG GAC TTT CC

14、C AGG C-3，采用T4寡核苷酸激酶法以-32P-ATP（3000Ci/mmol）標記探針。核蛋白-DNA探針結合反應體系為：等量核蛋白提取物（30g），35 fmols-32p標記的雙鏈NF-B寡核苷酸，反應總體積為15l。室溫靜置20min后加入加樣緩沖液，經6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。干膠后，-80放射自顯影，圖像采用Bio-Rad公司的phosphor-圖像分析系統進行定量分析。(4)Western blot分析：經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離待測蛋白，并將其轉移至硝纖膜上，用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉，0.05%Tween-20 TBS) 封閉1h，然后

15、與相應的特異性抗體孵育，4過夜。次日用封閉緩沖液漂洗3次，再與辣根過氧化物酶標記的相應二抗于室溫孵育1h后，用0.05%Tween-20 TBS 漂洗3次。按0.125ml/cm2膜加上化學發光試劑，靜置12min后，壓X光片作為顯影記錄。采用phosphor-圖像分析系統，進行定量輝度掃描分析。 統計學處理 本實驗中所有數據均采用xs表示，經方差齊性檢驗后，組間分析采用t檢驗。 2 結果 2.1 PDTC降低TAC小鼠心臟重量/體重比值 小鼠TAC 2周后，心臟重量/體重比值明顯增加，與假手術對照組相比增加了48.7%6.781.14(mg/g) VS. 4.560.34(mg/g)，n=10，P0.01。PDTC處理組與TAC模型組相比可以使小鼠心臟重量/體重比值下降16.4%5.670.49 (mg/g) VS. 6.781.14