1、.實驗一酸奶的制作與乳酸菌的活菌計數（5 學時）實驗目的：1、學習并掌握酸奶制作的基本原理與方法。2、了解市售酸奶的生產工藝。3、掌握乳酸菌活菌計數方法與操作。實驗原理：乳酸菌在乳中生長繁殖，發酵分解乳糖產生乳酸等有機酸，導致乳的pH 值下降，使乳酪蛋白在其等電點附近發生凝集。乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，在無氧條件下生長繁殖較好，實驗室條件下利用混菌培養的方法，盡可能讓乳酸菌在無氧條件下生長，每個單菌落代表一個微生物細胞。實驗內容：（一）酸奶制作1、10%脫脂奶粉溶解于熱水（80左右）中，充分攪拌均勻，配成調制乳；2、添加蔗糖：為了緩和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在調制乳中加人4-8 的蔗糖。3、

2、滅菌：方法有兩種：將乳加熱至90，保溫5min ；4、接種：往冷卻到43-45 滅過菌的乳中加入乳酸菌，接種量為2%-5%。5、分裝：酸奶受到振動，乳凝狀態易被破壞，因此，不能在發酵罐容器中先發酵然后再進行分裝，須是將含有乳酸菌的牛乳培養基先分裝到小容器中，加蓋后送入恒溫室培養，在小容器中發酵制成酸奶。6、發酵：發酵的溫度保持在40-43，一般發酵時間為3-6h 。發酵終點的確定有兩種方法：1）檢測發酵奶的酸度，達到65-70 T °。2）傾斜觀察，瓶內酸奶流動性差，而且瓶中部有細微顆粒出現。7、冷卻：發酵結束，將酸奶從發酵室取出，用冷風迅速將其冷印到10以下，一般 2 h ，使酸奶

3、中的乳酸菌停止生長，防止酸奶酸度過高而影響口感。8、冷藏和后熟：經冷卻處理的酸奶，貯藏在2-5 的冷藏室中保存。9、感官指標1）色澤：色澤均勻一致，呈乳白色，或稍帶微黃色。2）組織狀態：凝塊稠密結實均勻細膩，無氣泡，允許少量乳清析出。3）氣味：具有清香純凈的乳酸味，無酒精發酵味，無霉味和其他外來不良氣味。（二）乳酸菌活菌檢測、檢測培養基：蛋白胨15g，牛肉膏 5g，葡萄糖 20g，氯化鈉 5g ，碳酸鈣 10g，瓊脂粉 20g ，水 1000ml ，115 121滅菌 20min ，滅菌后放置水浴52保溫備用。.、稀釋：取 10克樣品放入添加 90ml 無菌水的帶 4-6 顆玻璃珠的 250m

4、l 三角瓶中，搖床 180rpm震蕩 30min，即為 10 1 樣品溶液；再從中取 1ml 至添加 9.0ml 無菌生理鹽水三角瓶中，稀釋至10 2，以此類推稀釋至10 8，即稀釋了1 億倍 ;、倒培養平板， 從上述已稀釋了1 億倍的乳酸菌懸液中取1ml，在無菌操作臺上注入9.0cm 培養皿中， 再將已經滅了菌的保持在 52水浴鍋中的呈溶解狀態的培養基，倒入 15 毫升左右于培養皿中，全部浸到培養皿，與菌懸液充分混合均勻（倒入培養基后，馬上用手轉動培養皿，轉動幾下，讓其混合均勻），然后等其凝固再移入培養箱中培養，注意最后一步倒平皿必須在超凈臺無菌操作，以免雜菌污染。每次稀釋均要換滅好菌的移液

5、管。、培養條件：37恒溫培養箱培養4872h。、培養完畢后，取出進行計數，因為是稀釋了1 億倍，所以一個透明圈菌落代表1億/ 克，如果有 200 個透明圈，則是 200 億 / 克。實驗器材及試劑：菌種：市售酸奶試劑：白糖奶粉培養基各成分器材：培養箱、電爐、鋁鍋5L，培養皿，酸奶發酵瓶（自帶）實驗結果：1、 詳細描述自己制作的酸奶結果：答：制作后酸奶與市場所售酸奶比較，比市場所售酸奶更稠密，酸奶的香味與酸味明顯，制作成功2、 記錄個人酸奶中各菌數測定的平行數據，計算最終平均值。答：最終培養基上未出現乳酸菌菌落，全部為雜菌菌落，因此無法統計酸奶中的菌含量3、 同時用圖片記錄實驗過程中各現象與結果

6、并對圖進行注釋。答：制備乳酸菌時，瓶子上方留有一部分空間，并未使乳酸菌完全處于無氧環境中發酵，但乳酸菌是兼性厭氧菌，因此在存在少量氧氣的環境中，乳酸菌也可以生長，酸奶制備成功。但在平板接種時，由于污染雜菌， 乳酸菌并未長出。乳酸菌計數失敗。思考題 ：乳酸菌的保藏通常為低溫條件，這給運輸、保藏帶來很大的成本，請問可采用什么方法使乳酸菌在常溫條件下有很高的存活率？答：在基因水平上對乳酸菌進行基因重組，從而獲得耐高溫乳酸菌。在基因庫里篩選抗高溫的基因并利用基因重組技術將其重組在乳酸菌基因上，對乳酸菌的基因進行修飾使其表達，以此來獲得耐高溫菌株。.實驗二枯草芽孢桿菌固態發酵及活菌數測定（5 學時）實驗

7、目的：1、學習了解固態發酵原理；2、以枯草芽孢桿菌為對象，了解固態發酵的控制技術；3、掌握枯草芽孢桿菌活菌計數方法與操作。實驗原理：作為抗生素的替代品，益生菌和酶制劑等的研究與開發近幾年成為綠色飼料添加劑的熱點，其中益生菌倍受關注。作為益生菌的一種，芽孢桿菌制劑在動物生產中的研究和應用一直都是畜牧業科研和生產人員關注的焦點。目前芽孢桿菌多采用液體深層發酵技術，再經噴霧干燥進行生產，對設備要求高，生產工藝復雜；而固體發酵采用的原料一般是廉價的農副產品 ( 如草粉、麩皮等 ) ，采用的設備也較液體發酵簡單，生產成本大大低于液體發酵。所以近年來各生產廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發酵技術，以求簡化生

8、產工藝，提高產量，降低生產成本。固態發酵定義：指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態基質中，培養一種或多種微生物的生物反應過程，是以氣相為連續相的生物反應過程。枯草芽孢桿菌屬于好氧微生物，實驗室條件下利用稀釋涂布培養的方法，讓菌在有氧條件下生長，每個單菌落代表一個微生物細胞。實驗內容：1、液體種子培養基配制：葡萄糖 0.2%，NaCl 0.5% ，酵母膏 0.5%，蛋白胨1%，pH 7.0 。2、液體種子培養：每 300 mL 三角瓶裝量50 mL 液體種子培養基，在115條件下滅菌30 min 。降溫后從斜面接一環菌苔至種子培養基。置 37控溫搖床培養。 轉速 200 r

9、·min-1 ，至芽孢率達 90%以上時停止 ，約需 24 h 。3、固體發酵培養基： 麩皮 60%，稻草粉 10%，玉米粉 5%，豆粕 25%，硫酸鎂 0.05%，硫酸銨 0.5%，料水比為1:1.1 。4、三角瓶固體發酵培養：每 250 mL 三角瓶裝量20-30 g （濕重），固體發酵培養基原料試劑混合料，加水，料水比為 1:1.1 ，攪拌均勻，培養基經121滅菌 30 min，降溫后接種量為2%(V/M： V液體菌種體積數，M固體發酵培養基的質量) ，然后置37培養箱中靜止培養，間時拍打，使其均勻生長。至脫落芽孢率為80%以上時，停止發酵，約需48 h 。（二）枯草芽孢菌活菌

10、檢測、檢測培養基：葡萄糖 0.2%， NaCl 0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，瓊脂粉 2%，pH 7.0 。 115滅菌 20min，滅菌后放置水浴 52保溫備用。.、稀釋：取 10 克樣品放入添加90ml 無菌水的帶玻璃珠的250ml 三角瓶中，搖床 180rpm震蕩 30min，即為 10 1 樣品溶液；再從中取1ml 至添加 9.0ml 無菌生理鹽水的三角瓶中，稀釋至 10 2 ， 以此類推稀釋至10 8，即稀釋了 1 億倍 ;、倒培養平板，將已經滅了菌的保持在52水浴鍋中的呈溶解狀態的培養基，倒入15 毫升左右于培養皿中，全部浸到培養皿， 待培養基凝固； 從上述已稀釋了1

11、億倍的菌懸液中取 0.2ml 于已凝固的培養基表面，用玻璃刮鏟涂布均勻，靜止10min ，然后再移入培養箱中培養。、培養條件： 37恒溫培養箱培養 2448h；、培養完畢后，取出進行計數。（三） 芽孢率測定 : 采用芽孢革蘭氏染色后顯微鏡下觀察實驗器材及試劑：菌種：枯草芽孢桿菌試劑：培養基成分器材：培養箱、滅菌鍋，培養皿實驗結果：1、 詳細描述枯草芽孢桿菌固態培養物（外觀、氣味、培養物狀態等）：答：枯草芽孢桿菌淡黃色，中間色深，表面較平整，無光澤，邊緣不整齊，形成的菌落為圓形。培養基中的枯草芽孢桿菌有腥臭味，長勢良好，觀察培養基，無明顯染菌現象。2、 記錄活菌測定中各平行數據，計算最終平均值。

12、答：數量稀釋倍數密度（ /g ）第一個平板1125×1075.6 ×109第二個平板655×1073.25 ×109第三個平板225×1071.1 ×109平均值3.32 ×1093、同時用圖片記錄實驗過程中各現象與結果，并對圖進行注釋。菌落成白色，菌落表面有褶皺思考題：在枯草芽孢桿菌固態生產過程中，為了防止霉菌與酵母的污染，可如何進行操作？答：加入抗真菌抑制劑.實驗三、淀粉糖化與酒精發酵（ 5 學時）實驗類型 ：綜合性實驗目的：1了解酒精發酵的主要類型、工藝原理及其控制條件2熟悉酒精生產的工藝流程、掌握酒精發酵的操作方法3

13、. 掌握用酶法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法4. 掌握在實驗室中模擬酒精發酵的工藝流程實驗原理玉米粉、大米粉中可供發酵的物質主要是淀粉，而釀酒酵母由于缺乏相應的酶，所以不能直接利用淀粉進行酒精發酵，因此必須對原料進行預處理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并轉化為可發酵性糖，以便酵母進行酒精發酵。在無氧條件下酵母菌利用可發酵性糖轉化為酒精和二氧化碳的作用，稱為酒精發酵，是生產酒精及各種酒類的基礎，可通過測定發酵過程中產生 CO2 的量和最終產物酒精的量得知酵母的發酵能力。實驗內容1、原料的粉碎將玉米、大米用粉碎機粉碎，玉米淀

14、粉含量為70%，大米淀粉含量為75%。2、蒸煮糊化稱取一定量的粉碎后淀粉質原料，按一定的料水比（100g：200ml），調制淀粉乳， 90-100 條件下恒溫水浴加熱，淀粉乳受熱后，在一定溫度范圍，淀粉粒開始破壞，晶體結構消失，體積膨大，粘度急劇上升，呈粘稠的糊狀，即成為非結晶性的淀粉。3、糖化經蒸煮糊化后的醪液，經過淀粉酶的糖化作用，將原料中的淀粉轉化為可發酵性糖，供酵母利用。酶參考用量：淀粉乳33%，60， ph4.5 ，酶 240U/g 絕干淀粉，糖化時間16h。糊化醪液調整pH4.5 ，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（ 120U/g），60恒溫下不斷攪拌，直至粘度下降

15、到一定程度，淀粉完全糖化4、發酵（ 1）干酵母活化將干酵母按1:20的比例投放于37 的溫水中復水20min 。目的：恢復酵母細胞的正常功能。（2）淀粉醪液糖化后，取400ml 上清液于潔凈的大可樂瓶中，加相同體積的水稀釋，加入活化好的酵母種液5ml，混勻， 28 度培養箱中靜止培養36h 左右。.5、二氧化碳生成的檢驗（1）觀察三角瓶中的發酵液有無氣泡溢出；（2）滴入10%氫氧化鈉1ml 于發酵液試管中，觀察，如氣體逐漸消失，則說明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生產量的測定（1）接種完，擦干瓶外壁，于天平上稱量，記為W1;（ 2）實驗結束， 取出瓶輕輕搖動， 使二氧化碳盡量溢出， 在同一天平

16、上稱量， 記為 W2；（ 3）二氧化碳生成量 = W1-W27、酒精生成的檢驗（ 1）打開瓶塞，嗅聞有無酒精氣味；（ 2）取發酵液 5ml，加 10%硫酸 2ml；（ 3）再加入 1% K2 Cr2 O7 溶液 10-20 滴，如顏色由黃色變為黃綠色說明有酒精產生。K2 Cr2 O7 +H2 SO4+CH3CH2OH CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4 ）3實驗器材及試劑：菌種：活性干酵母試劑：培養基各成分、 大米粉、 活性干酵母、 淀粉酶、糖化酶、大可樂瓶溶液： 10% H2SO4、1%K2Cr2O7、 10%NaOH器材：試管、培養箱、滅菌鍋、三角瓶、水浴鍋、粉碎機、離心機實驗結果

17、：1、 詳細記錄實驗過程中各參數及數據。淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g10g0.17g2.5g2. 對實驗結果的判斷與分析。答:1 二氧化碳生成的檢驗培養約48h 后，觀察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清濃度較稀，靠瓶壁邊緣有一連串微小氣泡2 酒精生成的檢驗打開瓶塞，聞到有濃重酒精氣味。取發酵液 5ml, 加 10%硫酸 2ml, 加 1%K2Cr2O7溶液 10-20 滴，顏色由黃色變為黃綠色，稍加熱后現象產生更快，更明顯。思考題：現有 3 株不同來源的酒精酵母，請設計與本實驗操作不同的實驗，判斷哪株酵母發酵酒精能力最強？答：按實驗步驟配制等量的三組醪液，加入等量糖化酶進行糖化作用

18、，將原料中的淀粉轉化為可發酵性糖，向三組糖化后的淀粉上清中加入等量3 株不同來源的酒精酵母種液，相同條件下培養一段時間，分別測定三組實驗產生的CO2的質量，進行比較。產 CO2越多表示發酵酒精能力越強。.實驗四 黑曲霉固體發酵生產纖維素酶及酶解底物反應（5 學時）實驗目的 ：1、了解黑曲霉固體發酵產酶情況2、掌握微生物固體發酵操作技術3、了解纖維素酶提取方法及酶活性定性測定方法實驗原理 ：纖維素酶是降解纖維素的一組酶的總稱，是起協同作用的多組分酶系，屬于誘導酶，其產生需要纖維素類物質的誘導。實驗中以米曲霉為發酵菌株，稻草作為產酶誘導物。實驗內容1、黑曲霉菌種活化（1）配制 PDA培養基：稱取2

19、00g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml 煮沸半個小時，紗布過濾，再加 20g 葡萄糖和 20g 瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約 5-10ml （視試管大小而定） ， 15 磅蒸氣（ 121）滅菌 20 分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存備用。（2）在無菌超凈臺上接種保藏的黑曲霉于PDA斜面， 28培養 5-7 天，斜面上長滿孢子。2、配制發酵培養基： 15g 麩皮 +10g 稻草粉， 0.5%KH2PO4，0.5% (NH4)2SO4，加 15ml水（加水量40%60%），拌勻，裝瓶；3、滅菌： 121 滅菌 30min，冷卻至室溫。4、黑曲霉孢子懸浮液制備已培養好

20、的黑曲霉孢子斜面一支，加入約 10ml 無菌水， 洗下孢子， 制成孢子懸液。5、接種：用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養基中，于 30 度條件下培養96h，期間每隔12h 搖動三角瓶一次。6、提取粗酶液向瓶中加入無菌水約50ml，浸泡固體曲30min-1h ；過濾得粗酶液。7、酶活性測定（1）配制 1%CMC底物平板：配方： 1g 羧甲基纖維素鈉，1.8g 瓊脂， 100ml ，瓊脂完全溶解后，加入0.03g 曲利本藍，倒平板，每皿約15ml。（2）打孔：打孔器經酒精燃燒滅菌后，每平板打4 孔，并在酒精燈火焰上稍稍加熱打孔處，使孔周圍的培養基微融，然后平放冷卻。（3）加

21、樣：往孔內加入粗酶液適量（約100ul ），同時需設對照。（4）培養（反應）：將加樣后的平板小心平端放入30培養箱， 放置 20 小時左右。（5）觀察結果：可直接觀察透明圈有無、測定透明圈直徑。.實驗器材及試劑：菌種：黑曲霉試劑：土豆、稻草、麩皮、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（CMC）器材：培養箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機、天平、三角瓶實驗結果：1、 仔細觀察固體培養基發酵前后的狀態，并描述；答：固體培養基發酵前：培養基顏色較淺，各成分（麩皮、稻草）新鮮，粘度大成團狀固體培養基發酵后：培養基中產生較多黑色孢子及菌體，培養基營養成分被利用，體積縮小2、 仔細觀察底物平板酶解前后的現象，并測量水解圈

22、大小。現象：紙片周圍出現淺淺的水解圈，打孔培養基未出現水解圈，紙片直徑2.5cm ，水解圈 3cm，直徑比5:6思考題： 纖維素是自然界最豐富的資源，從理論角度分析如何最大限度地通過酶法利用該資源？而現實存在什么問題？目前對纖維素降解有哪些研究進展？答：要想最大限度的利用纖維素，可從兩個方面入手。一是通過生產高性能纖維素酶的方法，二是找到蘊含能量較高的纖維素。而現實中存在的問題是高性能纖維素酶的獲取，而可以通過誘變和篩選獲得可產生纖維素酶的新菌株。目前在纖維素的降解方面，微生物的研究較多，降解纖維素的真菌有很多，如木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬、枝頂孢霉屬、毛殼霉屬和脈孢霉屬等。其中

23、，很多纖維素降解真菌在生長過程中能產生菌絲， 菌絲具有很強的穿透能力，能穿透植物角質層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質上， 增大降解酶與纖維物質的接觸面積，從而加快降解速率。如木霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬為絲狀真菌。目前，木霉屬是迄今所知纖維素酶系最全面和研究較多的一個屬。.實驗五甘露聚糖酶液體發酵及酶解反應（6 學時）實驗目的：1. 了解并掌握液體發酵產酶操作及酶反應條件的控制2. 與固體發酵產酶進行比較分析實驗原理甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，其主鏈是由吡喃甘露糖殘基以1,4- -D 糖苷鍵連接而成。當主鏈的某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過1,6- - 糖苷鍵與甘露糖

24、殘基相連形成分枝，則稱之為異甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纖維素的第二大組分，在自然界中分布廣泛，且多以異甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少見。- 甘露聚糖酶以內切方式降解甘露聚糖主鏈產生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最關鍵的酶。甘露聚糖酶可廣泛應用于食品、造紙、紡織印染等行業。利用- 甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在紙漿制造業，可用于代替堿法進行脫色、漂白。在紡織印染方面，利用- 甘露聚糖酶與其它酶聯合作用，能有效去除產品上粘附的多余染料，降低能耗和對環境的污染等。甘露聚糖酶的工業化生產將在許多行業產生很大的

25、經濟和社會效益。因此，近年來甘露聚糖酶逐漸成為國內外關注和研究的熱點之一。甘露聚糖酶是一種半纖維素酶，其產生需要一定的誘導物存在。本實驗以枯草芽孢桿菌為菌株，以魔芋粉為誘導物。實驗內容1. 菌種活化（ 1）配制 LB 固體培養基：蛋白胨 10g/L ， 酵母提取物 5g/L ，氯化鈉 10g/L ，瓊脂 20g/L ，待瓊脂充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約5-10ml （視試管大小而定），15 磅蒸氣（ 121）滅菌20 分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存備用。（2）在無菌超凈臺上接種保藏的枯草芽孢桿菌于LB 斜面， 28培養 2 天。2. 配制產酶培養基：蛋白胨 10g/L ，

26、酵母提取物 5g/L ，氯化鈉 10g/L ，魔芋粉 30g/L ，3. 以 10%的體積量分裝于三角瓶中（ 25ml 液體培養基 /250ml 三角瓶）， 121 滅菌 20 分鐘；4. 菌懸液的制備已培養好的枯草桿菌斜面一支，加入約10ml 無菌水，洗下菌體，制成菌懸液。5. 接種用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養基中，于37 度200rpm 條件下培養72h。6. 粗酶液提取： 3000rpm 離心收集得到粗酶液7.酶解底物分析：準備兩三角瓶，分別加入50ml 自來水， 46 度水浴保溫.8.往兩三角瓶中各加入1g 魔芋粉，然后其中一個加入粗酶液1ml，另一個加入

27、 1ml 蒸餾水（做空白對照） 。以后每隔5-10min 往兩三角瓶中各加入1g 魔芋粉，前后共加 5g9. 酶解反應 30-60min ，期間觀察反應現象。實驗器材及試劑：菌種：枯草芽孢桿菌 試劑：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、魔芋粉器材：培養箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機、天平、三角瓶實驗結果：1、 仔細觀察液體培養基發酵前后的狀態，并描述；答：發酵之前的液體培養基的狀態：在配制產酶培養基時，魔芋粉難溶解，依舊是固體顆粒。等完全滅完菌后，放正在實驗臺上，等冷卻后，狀態比較像固體培養基，但魔芋粉依舊不溶解，其顆粒均勻地分布于培養基中。經過三天的培養之后，產酶培養基被液化，得到的是含有粗酶液的液體

28、培養基，完全呈黃褐色的液體狀2、 仔細觀察底物水解前后的現象。答：對照組：魔芋粉結成團，透明，具有彈性，黏度很大，無法攪拌，實驗難以繼續。實驗組：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液體狀的酶解產物，溶液呈透明狀。思考題：以本人液體發酵產酶為例，請詳細介紹甘露聚糖酶定量測定的原理與方法。答：原理：樣品中的甘露聚糖酶對底物半乳甘露聚糖進行水解，用 DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）分光光度法測定水解所產生的還原糖量。方法：別向2 支試管中加入1.8mL 底物溶液，置50水浴中保溫5min。在其中一支試管中加入200 L 稀釋酶樣，磁力旋轉攪拌均勻，置于 50水浴中準確保溫5 min 。加入 3.0

29、 mL DNS 試劑至兩支試管中，攪拌均勻。在另一支試管（空白管）中加入200L 稀釋酶樣，同時將兩支試管放入沸水浴中準確保溫5min ，取出置入冷水中冷卻至室溫。于 540 nm處測量酶樣對空白的吸光度，在酶活標準曲線上讀取酶活，再乘以酶樣稀釋倍數。.實驗六從土壤中分離篩選產抗生素放線菌及抗菌譜分析實驗目的：1、從土壤中分離產抗生素的放線菌。2、抗生素產生菌的抗菌譜測定。3、掌握微生物的基本操作。實驗原理：放線菌是重要的抗生素產生菌，主要分布在土壤中，其數量僅次于細菌，一般在中性偏堿性、有機質豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，

30、就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據放線菌的營養、酸堿度等條件要求，常選用合成培養基或有機氮培養基。如果培養基成分改變，或土壤預先處理（120熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數滴10%酚等），都可以使細菌（本實驗加入重鉻酸鉀150 L），霉菌出現的數量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。放線菌可以產生抗生素，抑制其他菌種的生長，挑取純菌落進行抗菌譜分析，指示菌為大腸桿菌（ G-）和枯草芽孢桿菌（ G+）。實驗內容1、高氏一號培養基的制備可溶性淀粉20g ，硝酸鉀

31、1g, 氯化鈉 0.5g ，K2HPO4?3H2O0.5g ，MgSO4?7H2O0.5g ，FeSO4?7H2O 0.01g ，瓊脂 20g ，水 1000ml ，pH7.4 。配制時，先用冷水，將淀粉調成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補足水分至1000ml 。112 滅菌 20 分鐘（實驗中所用無菌器具均在此時滅菌） 。2、土壤取樣及其懸液梯度稀釋選定取樣點（最好是有機質含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數次，然后取2 10cm處的土壤。盛土的容器應是無菌的。將5 點樣品約1kg 充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應盡快投入實驗。3、稱土樣 10g 于盛有 90mL無菌水并裝有玻璃珠的三角