1、 載體的功能 1.運送外源基因高效轉入受體細胞 2.為外源基因提供復制能力或整合能力 3.為外源基因的擴增或表達提供條件 載體應具備的條件 1.具有對受體細胞的可轉移性2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點5.具有合適的選擇性標記 H1 design of plasmid vectors H2 bacteriophage vectors H3 cosmids and YACs and BACs H4 eukaryotic vectors Characteristics of plasmid vectors Alteratio

2、n of plasmid vectors Type of plasmid vectors Development of plasmid vector research Familiar plasmid vector Independent from nuclear genome Autonomously replicating nucleic acids sequence Genetic stability Eukaryotic bacterial and epiphyte Most of plasmids consist of DNA. Most of plasmids are cccDNA

3、 (covalent, closed, circle) Mw range ：1 - 300 kb 質粒的不相容性 質粒的可轉移性 攜帶特殊的遺傳標記 質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制 質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系 根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型： 嚴緊型復制控制的質粒 stringent plasmid 1 - 3 拷貝 松弛型復制控制的質粒 stringent plasmid 10 - 60 拷貝 任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組成不相容性群 以大腸

4、桿菌的質粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結構，不相容 pSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結構，不相容 p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，不相容 質粒不相容性的分子機制 兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數控制系統的調節，致使兩種質各受自己的拷貝數控制系統的調節，致使兩種質粒的最終拷貝數恒定，因此在經過若干復制周期粒的最終拷貝數恒定，因此在經過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。 兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時兩種含有相似復制子結構的不同

5、質粒，在復制時受到同一種拷貝數控制系統的干擾，致使兩種質受到同一種拷貝數控制系統的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以粒的最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優勢。后的細胞分裂周期中更具優勢。 革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類： 接合型質粒 能在天然條件下自發地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等 非接合型質粒 不能在天然條件下獨立地發生接合作用，如Col、R的其它成員 值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協助下，也能發生DNA轉移，這個過程由 bom 和mob 基因決定 野生型的質粒DNA上往往

6、攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物 物質合成：抗生素、細菌毒素、有機堿 這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義 天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。 目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數幾個野生型質粒構建的： pSC101：8.8 kb，拷貝數5，四環素抗性標記基因 Tcr ColE1：6.5 kb，拷貝數20 30，大腸桿菌內毒素標記基因 E1 RSF2124：ColE1

7、衍生質粒，氨芐青霉素抗性標記基因 Apr 人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類：人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質粒高拷貝質粒:突變拷貝數控制基因，拷貝數突變拷貝數控制基因，拷貝數1000-3000，擴，擴增基因增基因 低拷貝質粒低拷貝質粒:來自來自pSC101,拷貝數小于拷貝數小于10,表達某些毒性基因表達某些毒性基因 溫敏質粒溫敏質粒:在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質 測序質粒測序質粒:含有測序通用引物互補序列和多酶接頭含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker 整合質粒整合質粒:裝有整合促進基因及位

8、點裝有整合促進基因及位點,便于外源基因的整合便于外源基因的整合 穿梭質粒穿梭質粒:裝有針對兩種不同受體的復制子裝有針對兩種不同受體的復制子,便于基因克隆便于基因克隆 表達質粒表達質粒:裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件件 探針質粒探針質粒:裝有報告基因裝有報告基因,便于啟動子等元件的克隆篩選便于啟動子等元件的克隆篩選 第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。 第三階段

9、：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。 pBR322 Blue-white screening pUC pUC18 / 19 pKO pGEM-3Z pBR322 has a circle dsDNA of 4.36kb, and the compositive base sequences have been found out. pBR322 has more than 100 restriction site , and scores of single restriction site for e

10、ach restriction enzyme. It and its derivatives contain two antibiotic resistance genes, ampr and tetA. If a target DNA fragment is ligated into the coding region of one of the resistance genes, say tetA, the gene will become insertionally inactivated, and the presence or otherwise of a recombinant p

11、roduct can be determined by the antibiotic resistance exhibited by the transformants.pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr重組DNAAmprTcs提取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉化 無菌落陽性菌落篩選重組子2)DNA重組無DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切 Inclusion of

12、 tetracycline in the original selection plate will kill off the recombinant colonies in which we are interested. The colonies grown on a normal ampicillin plate are transferred, using an abosorbent pad, to a second plate containing tetracycline. Colonies which grown on this plate probably contain ve

13、ctor plasmids whereas those which do not are likely to be recombinants. The latter may be picked from the ampicillin plate for further analysis. A more sophisticated procedure for screening for the presence of recombinant plasmids. Only on a single transformation plate This method also involves the

14、insertional inactivation of a gene and uses the production of a blue compound as an indicator. The gene in this case is lacZ, which encodes the enzyme galactosidase, and is under the control of the lac promoter. If the host E.coli strain is expressing the lac repressor, then expression of a lacZ gen

15、e on the vector may be induced using IPTG, and the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate X-gal to yield a blue product. Insetional inactivation of lacZ in the production of a recombinant plasmid would prevent the development of the blue color. The transformed cells are spread on to a

16、plate containing ampicillin, IPTG and X-gal, to yield a mixture of blue and white colonies. The white colonies have no expressed -galactosidase and are hence likely to contain the inserted target fragment. The blue colonies probably contain religated vector.pUC質粒 pUC質粒系列也是在pBR322基礎上改建成的。 pUC的結構： 它含有

17、pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復制起始點。去除了pBR322的tetr區段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ 基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker. 三大優點EcoSacKpnSma BamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXba BamSma KpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表達半乳糖苷酶的片段。 LacZ的上游包括乳糖操

18、縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。 lacZ之內是M13的多功能連接器。 分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數（每個細胞含500-700個拷貝）。 含易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZ，可利用-互補原理進行藍白篩選。 多克隆位點區（the multiple cloning site, MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構成。 其MCS區與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉移到M13mp載體，進行DNA測序和體外突變等研究。 重要的大腸桿菌質粒載體重要的大腸桿菌質粒載體 拷貝數拷貝數 2000 - 3000 / cell 裝

19、有多克隆位點（裝有多克隆位點（MCS） 正選擇顏色標記正選擇顏色標記 lacZ 用于基因克隆和測序用于基因克隆和測序 BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII正選擇標記正選擇標記 lacZ 的顯色原理的顯色原理 組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點包括terr。 表達產物催化 Gal + ATP Gal-1-P+ADP 以14C標記的半

20、乳糖作底物,檢測生成的*Gal-1-P的放射性。 在Galk基因上游插入目的基因，根據基因表達產物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動子功能的強弱。 如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強，則說明插入片段不存在有啟動子。 重要的大腸桿菌質粒載體 多拷貝 裝有多克隆位點（MCS） 正選擇顏色標記 lacZ 裝有兩個噬菌體的強啟動子用于外源基因的高效表達 注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3）等 aCl2轉化效率低 克隆片

21、段小于10kb 大量篩選時需要細胞裂解 Characteristics of bacteriophage Bacteriophage M13 Virus 噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態還會相互轉化。 噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發成為基因工程的有用載體，因為： 高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞 自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增 Bacteriophage , which infects E.coli cells, can be used as

22、 a cloning vector. The process of infection by phage Structure of phage -DNA載體的構建載體的構建 -DNA載體的主要類型載體的主要類型 -DNA重組分子的體外包裝重組分子的體外包裝 -DNA及其重組分子的分離純化及其重組分子的分離純化 -DNA作為載體的優點作為載體的優點 大腸桿菌的溫和型噬菌體 由外殼包裝蛋白和-DNA組成 線性dsDNA病毒，具有末端互補的12nt（cos），感染細菌后粘端互補成雙鏈環狀 全長48502個核苷酸 -DNA上至少有50多個基因 結構區：A J共19個基因，長約20kb，其中的基因編碼構

23、成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質 重組區 ：att、int及xis，長約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長所需的序列 調控區:長約10kb，包括啟動子、終止子和N、CI基因。控制溶菌和溶原生長最重要的調控基因和序列、以及DNA復制均在該區域內 O-R 為裂解區 縮短長度縮短長度 刪除并和增加酶切位點刪除并和增加酶切位點 加裝選擇標記加裝選擇標記 構建琥珀密碼子的突變體構建琥珀密碼子的突變體 野生型-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型-DNA的長度，可以提高裝載量。

24、 野生型-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據切除片段長度的不同，可將-DNA分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體 允許外源 DNA 片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱為置換型載體（replacement vectors）。 一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是 9-23kb ，故而該載體主要用來構建基因組文庫。 刪除重復的酶切位點刪除重復的酶切位點 野生型的-DNA鏈上有5個 EcoRI 位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個。 增加新的單一酶切位點增加新的單一酶切位點 為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單

25、一的酶切位點。除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術去除或增添酶位點。 與質粒不同，野生型-DNA上缺少合適的選擇標記，因此加裝選擇標記是-DNA克隆載體構建的重要內容 加裝于-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類： 免疫功能類標記 Imm434 顏色反應類標記 lacZ imm434基因編碼一種阻止-噬菌體進入溶菌循環的阻遏物。 含有完整標記基因的-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態，細菌生長緩慢，形成渾濁斑； 當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活， -重組分子便進入溶菌循環，形成透明斑。 lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。 當外源基因插入到lacZ基

26、因中，基因滅活，不能合成藍色化合物； 而空載體-DNA則產生藍色透明斑 琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG （stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。 將野生型-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當這種-DNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。 插入滅活型載體 ：Charon2、Charon6、gt11 取代型載體：EMBL4、gtlc、

27、NM762、Charon40 正選擇型載體：EMBL1、L47、1059 野生型的-噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受-DNA上的red 和 gam 兩個基因控制。若將外源DNA取代 red 和 gam ，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑。 -DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞。 用于體外包裝的蛋白質必須具備以下成分：A蛋白（有終止復制功能），E蛋白（包裝蛋白），D蛋白（插入蛋白）。 可直接從感染了-噬菌體的大腸桿菌中提取這些蛋白，現已實現商品化。這些包裝蛋白

28、通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養基中培養至對數生長期 加入噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養1小時 用新鮮培養基稀釋，繼續培養4 -12小時。這時噬菌體顆粒密度已達1013 -1014 / L，大腸桿菌細胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放-DNA 乙醇或異丙醇沉淀-DNA 在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌 裝載能力為25 kb，遠遠大于

29、質粒的裝載量 重組-DNA分子的篩選較為方便 重組-DNA分子的提取較為簡便 -DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因。因而-DNA可通過人工加入序列的方法構建pET載體。 表達載體 pET-5a 是典型的 pET 載體，其組成是在載體的基本結構的基礎上加入了 T7 噬菌體啟動子序列及其下游的幾個酶切位點。當外源基因插入到這些酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。 M13噬菌體的生物學結構 M13 噬菌體的基因組 M13 噬菌體結構模型 M13 噬菌體的感染周期 M13 噬菌體的復制過程 M13 噬菌體的構建 M13 DNA載體的特點 M13噬菌體的外型呈絲狀 M1

30、3 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長 M13 DNA全長6407個核苷酸 M13 DNA上至少有10個基因2700個蛋白外殼分子 ssDNA ，6407 個核苷酸組成 （GenBank 注冊號為 V00604） 。基因組 90% 以上的序列可編碼蛋白質，共有 11 個編碼基因，基因之間的間隔區多為幾個核苷酸。較大的間隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之間，其間有調節基因表達和 DNA 合成的元件。 其基因組可編碼 3 類蛋白質，包括復制蛋白（基因 ， 和 ），形態發生蛋白（基因， 和 ），結構蛋白（基因 、 和 ）。基因組 DNA 為正鏈，按

31、基因 至基因 方向合成，與噬菌體的 mRNA 序列同義。 M13 噬菌體顆粒為絲狀長管狀結構，長 880nm ，直徑 6-7nm 。噬菌體顆粒的核心由 2700 個基因 編碼的結構蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因 的產物為由 50 個氨基酸殘基組成的 螺旋蛋白。頂端由 5 個基因 和 5 個基因 產物組成，作用于間隔區中的包裝信號。 5 個基因 蛋白和 5 個基因 蛋白位于絲桿的末端，參與對性纖毛的吸咐。 在宿主細胞內，感染性的單鏈噬菌體 DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉變成環狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復制型 DNA （replicative form

32、DNA） ，即 RFDNA 。通過 復制方式， RFDNA 進行擴增，基因的轉錄也隨即開始。 基因組中的任意一個啟動子都可以啟動基因的轉錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動子和終止子的位置關系使得靠近終止子的基因轉錄更頻繁。 +DNA+DNARFDNARFDNARFDNAII 單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態的 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細胞中純化出來，可以象質粒一樣進行操作，并可通過轉化方法再次導入細胞。 使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外，這在DNA定向突變中非常有用。 M13重組分子篩選簡便。 被M13噬

33、菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。 M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb。 與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病毒基因組DNA。 動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性病毒。按照基因組的結構，可將動植物病毒分成四大類： ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA RNA病毒在自我復制時大多存在相應的DNA中間反應物，這些中間體可作為載體進行常規的DNA重組。 The way to form cosmids Cosmid Phagemid Artificial Chromosomes -

34、噬菌體載體和M13-噬菌體載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5kb，裝載量無法滿足現代基因工程的需要。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關的序列與質粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒。 由于cos質粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。 一類人工構建的含有-DNA cos序列和質粒復制子的特殊類型的載體。 1978年Collins和Hohn發明構建 1.8 kb的-DNA片段 + pBR322片段 粘粒的組成包括質粒復

35、制起點（colE1），抗性標記（ampr）， cos 位點，因而能象質粒一樣轉化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用來克隆大片段 DNA ，裝載范圍為31 - 45 kb。有的粘粒載體含有兩個 cos 位點，在某種程度上可提高使用效率。 同-噬菌體，可進行體外包裝，高效轉染受體細胞 像質粒那樣在受體細胞中自主復制 重組操作簡便，篩選容易 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 不能體內包裝，不裂解受體細胞 噬菌粒是一類人工構建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。 噬菌粒的特點 能像M13一樣體外包裝，并高效轉染受體細胞 能像質粒

36、那樣在受體細胞中自主復制 裝載量比常規的M13mp系列要大很多（10 kb） 通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA 重組操作簡便，篩選容易 pUC118 / 119， pBluescript體外轉錄載體 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 具有多克隆位點、 -互補、噬菌體啟動子和單鏈噬菌體的復制與包裝信號 噬菌體啟動子PT3和PT7 強化外源基因的轉錄 提取出來的單鏈DNA重 組分子在噬菌體RNA聚 合酶的存在下，又可實 現外源基因的體外轉錄 pBluescriptKS（） 一般由 4 個質粒組成一套系統，其差別在于多克隆位點方向相反（根據

37、多克隆位點兩端 Kpn 和 Sac 的順序，用 KS 或 SK 表示），或單鏈噬菌體的復制啟始方向相反（或者說，引導 DNA 雙鏈中不同鏈合成單鏈 DNA ，用 + 或 - 表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位點與 pUC18/19 的不同，且使用 f1 噬菌體的復制與包裝信號序列 。 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數百甚至上千 kb 的DNA片段 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區、分配區、穩定區與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩定的復制并遺傳。 細

38、菌人造染色體（BAC） 酵母人造染色體（YAC） 細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，裝載范圍50 - 300 kb之間。 各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產生，減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用。 pBAC的基因結構 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）結構 構建動植物基因文庫 大腸桿菌的 F 因子是一個約 100kb 的質粒。它編碼60多種參與復制、分配和接合過程的蛋白質。 雖然F因子通常以雙鏈閉環DNA（1-2個拷貝/細胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少3

39、0個位點處進行隨機整合。 攜帶F因子的細胞，或以游離狀態或以整合狀態表達三根發樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細胞之間產生性接觸所必需。 每個環狀 DNA 分子中攜帶： 一個抗生素抗性標記 一個來源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制子 oriS 。 一個易于 DNA 復制的由 ATP 驅動的解旋酶RepE 以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）。 Transfection of eukaryotic cells Shuttle vectors Yeast episomal plasmids Agrobacterium

40、tumefaciens Ti plasmid Virus Yeast Artificial Chromosomes DNA transfection into eukaryotic cells can be more problematic than bacterial transformation, and the efficiency to of the process is much lower. Yeast and plant cells: protoplasts Animal cells: calcium phosphate Electroporation Microinjectio

41、n Gene gun 利用脈沖電場改變細胞膜的狀態和通透性，達到將DNA導入細胞以及促使細胞發生融合的目的。 該技術目前一方面應用于細菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動物細胞的基因轉移，另一方面應用于細胞融合制備雜交細胞和動物克隆等。 將核酸直接發送至細胞內的物理學方法。 PDS-1000/H臺式基因槍可以實現對細胞的原位轉導。 應用于包括培養細胞、組織、器官、植物、動物、細菌和細胞器官等各種不同的目標。 能夠在兩類不同宿主中復制、增殖和選擇的載體。 如有些載體既能在原核細胞中復制又能在真核細胞中復制，或能在 E.coli 中復制又能在革蘭氏陽性細菌中復制。 這類載體主要是質粒載體。 以2質粒為基礎

42、的載體 YEps可以含有完整的2質粒，也可以只含有2質粒的復制起點。 YEp13是一個穿梭質粒，含有2質粒的復制起點和選擇基因LEU2, YEp13還包含pBR322的完整序列，因此可以在大腸桿菌也可以在酵母中進行選擇。 2質粒是非常好的克隆載體，它有6kb大小，在酵母細胞中的拷貝數在70-200之間，利用質粒的復制起始位點進行復制，許多酶由寄主細胞提供，質粒中含有編碼蛋白質的基因REP1, REP2。 2質粒的問題：選擇標記的問題。在實踐中，利用酵母的正常的基因，一般是編碼氨基酸合成的酶，如LEU2基因編碼-異丙基蘋果酸脫氫酶，參與丙酮酸向亮氨酸的轉化。為了利用LEU作為選擇標記，需要用到一

43、種特殊的寄主，寄主必須是LEU-2營養缺陷體這樣的寄主只有在添加亮氨酸的條件下才能生長。質粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培養基上生長。 幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農桿菌感染，而產生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A. tumefaciens）。 其致瘤特性由Ti（tumorinducing）質粒介導的。 農桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質可以誘導Vir（Virulence region)基因的啟動表達，Vir基因的產物將Ti質粒上的一段TDNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產物則與單鏈TDNA結合

44、，形成復合物，轉化植物根部細胞。 Ti質粒基因結構 Ti質粒大約在160240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區在36kb左右。除此之外，Ti質粒上還存在Con區（region encoding conjugation)和Ori區（origin of replication)。 TDNA上有三套基因和左右兩個邊界。 其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。 第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine）

45、，使農桿菌生長必需的物質。 LB和RB是長為25bp的末端反復重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。 T-DNA切除由Vir區編碼的特異性內切酶完成，分別在LB和RB的第三個堿基和第四個堿基之間產生缺口，并形成單鏈T-DNA。 T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的，RB順序與整合有關，而LB無關。 T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯形式排列，但整合位點的特異性尚未確定。 T-DNA克隆在大腸桿菌質粒上，含有E.coli的選擇標記和植物選擇標記Kmr。 首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質粒轉化到農桿菌中，質粒與Ti質粒上的同源序列發生同源重組，將外源

46、基因整合到Ti質粒上，用于侵染植物細胞。T-DNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA上，Kmr篩選轉化細胞。 目前T-DNA轉化植物細胞的標準方法是雙元系統，即穿梭質粒。插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有Ti質粒的根瘤農桿菌，經篩選后直接感染植物細胞。與共整合系統所不同的是，含外源基因的質粒可在農桿菌內自主復制并保留下來。農桿菌侵染植物細胞后，植物的創傷信號啟動Ti質粒上的Vir基因，隨后將穿梭質粒的T-DNA切割下來，轉移到植物細胞中。 Baculovirus SV40 Retroviruses 桿狀病毒侵染昆蟲細胞。 病毒基因組有極強的啟動子，可以啟動外源基因的過表達，生產大量目的蛋白

47、。 典型的桿狀病毒表達系統是利用大腸桿菌中位點特異的轉座或昆蟲細胞中的同源重組來產生重組桿狀病毒。這些過程要求大量的操作時間，周期長達幾周。 BaculoDirect 桿狀病毒表達系統可簡化過程，節省大量時間。 BaculoDirect系統利用快速、簡便的Gateway技術。 BaculoDirect線性DNA包含了attR位點，允許與包含有目的基因的Gateway入門克隆進行有效的重組。 將entry克隆、BaculoDirect線性DNA和Gateway LR Clonase酶混合物稍加混勻，在室溫下反應1小時即可。最終的反應混和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉染昆蟲細胞（

48、sf9或sf21）。 SV40 infects a number of mammalian species. Its utility for transferring large fragments is limited. 反轉錄病毒是一類RNA的病毒，進入受體細胞后，RNA反轉錄成DNA，通過兩端由數百bp組成的長末端重復序列，整合到染色體上，成為原病毒。 反轉錄病毒的DNA基因組的兩端各有一個長末端重復序列(5-LTR和3-LTR)，有一個包裝病毒顆粒時必需的非編碼序列+，同時有三個編碼蛋白質的基因gag、pol和env。 反轉錄病毒載體可容納外源DNA的長度約10 kb，以很高的轉染率感

49、染宿主細胞，特別是分裂中的細胞。轉入宿主的細胞后，反轉錄病毒載體隨即整合到宿主細胞基因組內，這種整合的位點是隨機的。 反轉錄病毒載體在構建時，刪去了poi、env基因和gag基因的3端，但保留了病毒顆粒所需的+序列。其目的是在于提高載體的安全性，防止反轉錄病毒進入宿主細胞后進行增殖并包裝成病毒顆粒對宿主細胞造成可能的傷害。在制備反轉錄病毒載體時，必須有一個輔助細胞系，這種細胞內有缺陷型病毒可以提供包裝用的外殼蛋白，但自身沒有包裝信號。這樣，反轉錄病毒載體就可利用這些外殼蛋白包裝成病毒顆粒在輔助細胞系內大量擴增。 反轉錄病載體多半用于基因治療，由于病毒載體在宿主細胞基因組上隨機插入，可能會引起不安全的后果，這種載體還在不斷改進之中。 是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復制元件構建的載體，其工作環境也是在釀酒酵母中。 釀酒酵母的形態為扁圓形和卵形，生長的代時為 90 分鐘；含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。 YAC載體的必需元件 YAC載體的裝載量為350 - 400 kb 酵母人造染色體的使用 YAC 載體的原理性工作流程YAC載體應含有下列元件 酵母染色體的