1、響應曲面法優化五倍子生料發酵產單寧酶的條件摘要： 單因素實驗表明五倍子含量、初始加水量、培養溫度是顯著影響黑曲霉 B0201 利用五倍子生料固體發酵產單寧酶的因子。在此基礎上采用中心旋轉組合設計，建立了五倍子生料發酵產單寧酶的二次多項數學模型，探討了主要因素的影響效應及其交互作用，優化出最佳條件為：五倍子含量 17%、液固比為 1.51、溫度 32 ，并驗證了模型的有效性，從而表明響應曲面優化的模型適合于五倍子生料發酵工藝。關鍵詞： 響應曲面；中心旋轉組合設計；單寧酶；五倍子；生料發酵ptimizatin f cnditins f tannase prductin with Gallnut b

2、yunsterile fermentatin using respnse surface methdlgyAbstract: The results f factrial eperiment shwed that the cntent f Gallnut, initial misture and incubatintemperature were the significant factrs that severely affected Aspergillus Niger B0201 prducing tannase withunsteriled Gallnut by slid-state f

3、ermentatin. Based n the results, central cmpsite rtatable design(CCRD)was emplyed. A secnd rder quadratic equatin fr unsterile fermentatin f Gallnut was built and effect fmain factrs and their crrespnding relatinships were studied in the present wrk The ptimal cnditinswere 17% Gallnut cntent, 11.5 f

4、 the liquid-slid rati, 32 in temperature. The applicability f the mdelequatin fr predicting the ptimum respnse values was verified effectively by the validatin data, thusindicating the suitability f respnse surface methdlgy (RSM) in ptimizing the prcess f unsterile fermen-tatin f Gallnut were well.K

5、ey wrds: respnse surface methdlgy(RSM); central cmpsite rtatable design(CCRD); tannase;Gallnut; unsterile fermentatin單寧酶可水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧 鍵，生成沒食子酸和葡萄糖1。單寧酶廣泛地應用響應曲面法優化五倍子生料發酵產單寧酶的條件于飲料、釀酒、醫藥、制革、化妝品等領域， 特別是在制備藥用中間體沒食子酸和食品抗氧化劑沒食子酸丙酯 (PG)，以及在處理茶葉的“冷后渾”和啤酒沉淀等方面，有重要應用價值。美國食品 與藥物管 理局(FDA)已確定 單寧酶 為 安全產品，在日本

6、單寧酶也通過批準應用于食品工業2，3。但目前生產單寧酶的效率不高，市場價格昂貴，阻礙了單寧酶的應用，因此單寧酶發酵生產的研究具有重要的意義。本課題組發現了一種實用性很強的生產單寧酶的新方法，即黑曲霉 B-0201 利用五倍子生料固體發酵生產單寧酶。此生料發酵工藝非常適合利用五倍子為誘導物生產單寧酶，避免了高溫對五倍子的破環，簡化了設備和生產流程，節約了成本，且大幅度地提高了單寧酶的生產效率，單寧酶活力是常規滅菌工藝的 3.6 倍。本文在單因子實驗研究的基礎上，采用 Design -Epert7.0 中 Central Cmpsite Rtatable Design(CCRD)即中心旋轉組合設計

7、原理4，對影響黑曲霉利用五倍子生料固體發酵產單寧酶的顯著因子五倍子的含量、初始加水量和培養溫度進行了進一步的探索，建立了五倍子生料發酵新工藝的二次多項數學模型，獲得生產單寧酶的最佳工藝條件，為五倍子生料發酵工藝在生產單寧酶中的應用提供理論依據。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌種 黑曲霉 B-0201(Aspergillus niger)：由貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室紫外誘變原始黑曲霉菌株篩選出來，菌種在 4 條件下保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上。1.1.2 固體發酵培養基 稱取五倍子粉 1 g、麩皮4 g 裝入 250 mL 的三角瓶作為培養基基礎，加入1% (w/w) (

8、NH4)2S4、0.1%(w/w)MgS4·7H2、 0.1%(w/w) NaCl、 8 mL 蒸餾水，調節初始 pH 為 6.0，攪拌均勻。1.1.3 主要儀器與設備 UV2550 紫外可見分光光度計，恒溫培養箱。1.1.4 主要試劑 沒食子酸丙酯：湖南省張家界貿源化工有限公司；繞單寧：上海君創化工有限公司；五倍子：貴州省遵義市余慶縣；試劑均為化學純。1.2 實驗方法1.2.1 培養條件 五倍子生料發酵：發酵培養基配好后，不經高壓蒸氣滅菌，直接接種 1 mL 黑曲霉孢子懸液(1108個孢子)，混勻后置于 30 培養箱中靜置培養 96 h。1.2.2 粗酶液提取 取出 250 mL

9、的三角瓶，在三角瓶中加入 100 mL pH5.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，30 條件下 150 r/min 振蕩浸提 1 h，用定性濾紙過濾即得粗酶液。1.2.3 酶活檢測方法 根據文獻7測定單寧酶活力的方法測定。單寧酶在 pH5.0、30 條件下每分鐘產生 1 ml 沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。1.3 實驗設計影響黑曲霉利用五倍子生料固體發酵產單寧酶的主要因素為五倍子的含量、加水量、溫度、接種量、裝量、初始 pH、碳氮源、磷酸鹽和培養時間。用 SPSS 16.0 fr Windws 對單因素實驗數據進行方差分析5，將影響較小的因素和定性因素取為常量，選出顯著影響的變量因素

10、為五倍子含量、初始加水量和培養溫度。優化實驗設計采用響應曲面法(RSM)，所用軟件為 Design-Epert 7.0，實施模型為中心旋轉組合設計(Central Cmpsite Rtatable Design，CCRD)。選取五倍子含量：初始加水量和培養溫度 3 個因素，采用 3 因素 3 水平的響應面分析方法，根據單因素結果選取因素水平。實驗因素與水平設計見表 1。對五倍子含量：初始加水量和培養溫度作如下換算：1=五倍子含量，2=液固比，3=培養溫度。按方程 i=(i-0)/ 對自變量進行編碼，i為自變量的編碼值，i為自變量的真實值。0為實驗中心點處自變量的真實值， 為自變量的變化步長，其

11、中 alpha=1.68179。2 響應面優化結果與分析2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗采用多元回歸技術，擬合二次多項模型的表 1 響應面設計因素水平表編碼水平(i)-alpha 11.591 1.26364 21.591-1 15 1.4 250 20 1.6 301 25 1.8 35alpha 28.409 1.93636 38.40因素1五倍子含量/% 2液固比 3溫度/生物工程·10·FD SCIENCE AND TECHNLGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 7 期CCRD 設計與結果見表 2。以 3 次實驗所得單寧酶酶活力的平均值為響應值(Y)

12、。采用 Design-Epert7.0 程序對表 2 響應值與各因素進行回歸擬合后，得到單寧酶活力對五倍子含量(1)、初始加水量(2)和培養溫度(3)編碼值的二次 多 項 回 歸 方 程 為 ： Y =53.56 -3.711-2.992+9.853+0.88120.7213+2.30233.89211.662213.7523。對該模型進行方差分析，結果見表 3，回歸方程系數顯著性檢驗結果見表 4。回歸方程中各變量對指標(響應值)影響的顯著性，由 F 檢驗來判定，概率 P 的值越小，則相應變量的顯著程度越高。由表 3 可以看出，模型 P<0.0001，表明回歸模型極顯著，失擬項 P=0.

13、1592>0.05，模型失擬度不顯著，其校正決定系數 RAdj2=0.9552，表明僅有總變異的 4.5%不能由該模型進行解釋。相關系數 R2=0.9764，表明該模型擬合程度良好，實驗誤差小，該模型是適合的，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該模型可以確定最佳發酵培養基及發酵條件。Adeq PreciSin 值為 23.921，遠大于 4，說明模型完全可以用來對實驗結果進行擬合。從表 4 中可以看出，在本實驗的水平范圍內顯著的因素為一次項 1、2、3，二次項 21，23，交互相不顯著。對編碼值的回歸方程取一階偏導數，整理可得到如下三式：-3.71+0.8820

14、.7237.781=0 (1)-2.99+0.881+2.3033.322=0 (2)9.850.721+2.30227.53=0 (3)式(1)、式(2)、式(3)聯立方程組，解得 1=-0.589、2=-0.85、3=0.3，換算成真實值 117.01，21.43、331.5。綜合考慮實際操作的便利，將黑曲霉固體發酵最佳產酶條件修正為：五倍子含量為 17%、液固比為 1.51、溫度為 32 。在此條件下進行發酵產酶，由回歸方程預測酶活力為57.18 U/gds。2.2 五倍子生料發酵工藝的響應面分析及優化通過模型方程所作的三維響應面圖及與之對應的等高線圖 1圖 3 能比較直觀地解釋各變量和

15、變量之間對響應值的影響6。利用該圖可以將其 3個變量中的 1 個變量固定在中心水平值，而對另外 2 個變量交互影響單寧酶的產生進行分析與評價。等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱，表 2 響應面實驗設計與結果實驗號因素 Y 酶活/(U/gds)123實驗值 預測值1 1 -1 1 40.89 39.492 alpha 0 0 38.01 36.323 0 0 -alpha 2.28 -1.904 -1 1 -1 18.46 21.235 0 0 0 56.4 53.566 -1 1 1 46.4 46.977 0 0 alpha 28.97 31.238 0 0 0 52.43 53.569

16、0 0 0 51.9 53.5610 -1 -1 1 54.97 50.1111 1 1 1 39.2 39.8712 -alpha 0 0 49.03 48.8013 1 -1 -1 25.03 25.8314 -1 -1 -1 32.89 33.5715 0 0 0 55.6 53.5616 1 1 -1 13.14 17.0117 0 -alpha 0 51.8 53.8918 0 0 0 52.6 53.5619 0 0 0 50.0 53.5620 0 alpha 0 47.83 43.83表 3 回歸模型方差分析表方差來源自由度平方和 均方 F 值 P 值顯著性模型 9 4504.

17、94 500.55 46.02 <0.0001高度顯著殘差 10 108.76 10.88失擬項 5 78.52 15.70 2.60 0.1592不顯著純誤差 5 30.24 6.05總和 19 4613.70注：R2=0.9764，RAdj2=0.9552， RPred2=0.8612， Adeq Precis in=23.921。表 4 回歸方程系數顯著性檢驗表系數項系數估計值自由度標準誤差F 值 P 值顯著性常數項 53.56 1 1.351-3.71 1 0.89 17.25 0.0020 2-2.99 1 0.89 11.25 0.0073 39.85 1 0.89 121.

18、71 <0.0001 120.88 1 1.17 0.57 0.467213-0.72 1 1.17 0.38 0.5527232.30 1 1.17 3.90 0.076421-3.89 1 0.87 20.05 0.0012 22-1.66 1 0.87 3.67 0.084423-13.75 1 0.87 250.59 <0.0001 注：+ 為顯著(P<0.05)， 為高度顯著(P<0.01)。生物工程·11·FD SCIENCE AND TECHNLGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 7 期橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形

19、則與之相反。圖 1 顯示，在溫度位于中心水平值即 30 時，五倍子含量、初始加水量及其交互作用對單寧酶活力影響的響應面和等高線圖。從圖 1 中可以看出，兩者交互作用不明顯，隨著五倍子含量和初始加水量的增加，單寧酶的活力都是先增加后減小。在本實驗范圍內單寧酶酶活都較高。確定最佳水平范圍五倍子含量為 15%22%、液固比為 1.411.71 時，此時單寧酶的活力大于 50 U/gds。圖 2 顯示，在初始加水量位于中心水平值即液固比為 1.61 時，五倍子含量、溫度及其交互作用對單寧酶活力影響的響應面和等高線圖。從圖 2中可以看出，兩者交互作用不明顯。溫度對單寧酶活力的影響很大，溫度較低時，單寧酶

20、的活力很低，在本實驗范圍內隨著溫度的增加，單寧酶活力先增加后減少。確定最佳水平范圍五倍子含量為 15%23%，溫度為 3035 。圖 3 顯示，在五倍子含量位于中心水平值即20%時，初始加水量、溫度及其交互作用對單寧酶活力影響的響應面和等高線圖。溫度對單寧酶活力的影響很大，控制溫度在合適的范圍，加水量在本實驗水平范圍內對酶活影響不大。確定最佳水平即液固比為 1.411.751，溫度為 3033 。2.3 驗證實驗為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，在上述響應面分析法求得的最佳條件下進行固體發酵重復實驗 5 次，實際測得的平均單寧酶活力為5752.2547.542.751.8038酶活1.701.

21、601.501.40 15.0017.5020.0022.5025.00B:液固比 A:五倍子含量35.0032.5030.0027.5025.0015.00 17.50 20.00 22.50 25.00A:五倍子含量C:溫度酶活645.247350.788245.247339.706428.624634.1655圖 2 五倍子含量、培養溫度及其交互作用對單寧酶活力影響的響應面和等高線圖5743.2529.515.75235.0032.5030.0027.5025.00C:溫度15.0017.5020.0022.5025.00A:五倍子含量酶活5743.2529.515.75235.0032

22、.5030.0027.5025.00 1.401.501.601.701.80C:溫度B:液固比酶活35.0032.5030.0027.5025.001.40 1.50 1.60 1.701.80C:溫度B:液固比酶活650.56250.56245.050139.538134.026128.5142圖 3 初始加水量、培養溫度及其交互作用對單寧酶活力影響的響應面和等高線圖圖 1 五倍子含量、初始加水量及其交互作用對單寧酶活力影響的響應面和等高線圖49.21651.558653.901244.530849.21646.8734酶活1.81.71.61.51.46 B:液固比15.00 17.50

23、 20.00 22.50 25.00A:五倍子含量生物工程·12·FD SCIENCE AND TECHNLGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 7 期56.2 U/gds，與理論預測值相比誤差為 1.7%，實驗值在 95%的置信區間符合預測值，從而表明 RSM優化的模型適合于五倍子生料發酵工藝。因此，基于響應曲面優化的五倍子生料發酵工藝參數準確可靠，具有實用價值。3 結論利用實驗設計軟件 Design-Epert7.0，采用響應曲面設計中的中心旋轉組合設計，建立了黑曲霉 B0201 利用五倍子生料固體發酵產單寧酶的二次多項數學模型，經檢驗證明是合理可靠的。同時

24、利用模型的響應面及等高線對影響五倍子生料發酵的關鍵因子及其相互作用進行探討，確定了因素的最佳水平范圍，優化出產單寧酶的條件為：五倍子含量為 17、初始加水量液固比為 1.51、溫度為 32 。參考文獻：1 Kenji Aki, Ryu Shlnke, Hirshi Nishira. Purificatin andsme prperties f yeast tannaseJ. Agri Bil Chem,1976,40(1):79-852 李秧針,邱樹毅,保玉心,等.單寧酶發酵生產的研究進展.中國釀造,2008,(11):1-63 A Sabu, A Pandey, M Jaafar Daud,

25、 et al. Tamarind seedpwder and palm kernel cake: tw nvel agr residues frthe prductin f tannase under slid state fermentatin byAspergillus niger ATCC 16620J. Biresurce Technlgy,2005,(96):1223-12284 朱偉勇.最優設計理論與應用M.沈陽:遼寧人民出版社,19815 高惠璇.SASSTAT軟件使用手冊M.北京:中國統計出版社,19976 高璃瓏,王允祥,江漢湖.響應曲面法優化超高壓殺滅金黃色葡萄球菌條件的研

26、究J. 高壓物理學報,2004,18(3)7 保玉心,邱樹毅,李秧針,等.一種胞外單寧酶的活力檢測方法.精細化工,2008,25(6)Fd Inf食事傳遞生物工程近日從 CFE2008 組委會獲悉， 雖然距正式開展還有 4個月的時間， 但展位銷售已突破 70， 參展勢頭超出原計劃。 為了進一步促進展會現場洽談與交易， 提升展會品質，組委會近期將推出系列精彩配套活動為展會添彩。強強對話打造調味品營銷品牌論壇。 作為展會的重要活動之一的營銷高峰論壇， 已作為展會的一個標志性品牌活動延續下來， 與此同時， 借助中國調味品經銷商會年會的同期舉辦， 調味品各界人士匯聚一堂， 屆時著名調味品企業家、 業內營銷精英、 企業管理專家， 以及國內大型調味品專業經銷商， 共同探討行業內共同關注的前瞻性熱點話題， 經銷商 “舌戰” 廠家場面再次上演。饕餮大餐餐飲活動喜迎盛世。 2008 年， 在我國經濟形勢出現困難的情況下， 全國住宿餐飲業零售額仍然增長 24.7%， 增幅比上年高出 5.3 個百分點。 這些數據說明餐飲業作為民生產業的地位正在逐步提升、 拉動消費、 繁榮市場 、 創 造 需 求 方 面 ， 帶 動 經 濟 發 展 的 作 用 日 益 凸 顯 。CFE200