1、    【摘要】  目的探討畢赤酵母GS115表達的重癥肌無力單鏈抗體A7的一般特性及與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的結合特異性方法采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡試驗，檢測已經轉化至畢赤酵母GS115中的重癥肌無力重組載體pPIC9KScFv A7表達的單鏈抗體A7蛋白的分子質量；應用間接免疫熒光技術確定表達蛋白與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的親和性結果畢赤酵母GS115培養上清液中有目的蛋白的表達，分子質量約為44ku；間接免疫熒光試驗顯示，在大鼠肋間肌細胞間有熒光出現結論單鏈抗體A7可以在畢赤酵母中成功地表達，并且可與大鼠肋間肌乙酰膽

2、堿受體結合. 【關鍵詞】  單鏈抗體 受體 膽堿能 重癥肌無力    ABSTRACT:OBJECTIVETo determine the specificity of expressed single chain variable fragment (ScFv) A7 of antibody against acetylcholine receptor (AChR) in myasthenia gravis in Pichia pastorisMETHODSThe molecular weight of expressed protein (ScFvA

3、7) was analyzed by sodium dodecyl sulfateolyacrylamide gel electrophoresis (SDSAGE) and Western blotting. The affinity of expressed protein to AChR in mouse intercostals muscles was detected using indirect immunofluorescence technologyRESULTSThe target protein was secreted in the supernatant of expr

4、ession culture medium. Its molecular weight was about 44ku. There was fluorescence between the mouse intercostals muscle cellsCONCLUSIONThe target protein has been expressed from Pichia pastoris GS115 successfully and it can bind to the AChR in mouse intercostals muscles.    Key words:sing

5、le chain variable fragment;receptor, cholinergic;myasthenia gravis    重癥肌無力是抗乙酰膽堿受體抗體介導的自身免疫性疾病，目前對它的治療主要以非特異性免疫治療為主，此方法雖然可以在一定程度上減輕患者的臨床癥狀，降低死亡率，但可引起廣泛的免疫抑制等嚴重的副作用.特異性免疫治療還處于動物實驗階段，包括口服或經鼻黏膜給予乙酰膽堿受體誘導免疫耐受，導入融合FasL基因的抗原提呈細胞以殺傷反應性T細胞，而T細胞表位多肽疫苗抑制自身反應性T細胞的增殖，單價抗體特異性封閉抗原，以乙酰膽堿受體為配基制備免疫吸附劑，以去除

6、血液中的致病性抗體等13.由致病性抗體制備的單鏈抗體（single chain variable fragment, ScFv）與乙酰膽堿受體的主要免疫原區結合后可特異性地封閉致病性抗體的結合位點，阻止乙酰膽堿受體發生抗原調變，同時由于單鏈抗體沒有可結晶片段（Fc段），無法激活補體，可以起到保護性作用4.由于單鏈抗體分子質量更小，易于穿過血管壁進入組織，且易于基因操作，因此對它的研究逐漸被受重視.抗乙酰膽堿受體單克隆抗體A7為高致病性抗體5，由它制備得到的單鏈抗體A7應仍然保留著與乙酰膽堿受體較高的結合活性，并能夠抑制致病性抗體對乙酰膽堿受體的結合.本實驗的目的是探討單鏈抗體A7在畢赤酵母表達

7、產物的特性，對重癥肌無力的基因治療研究提供實驗依據.    1  材料與方法    1.1  實驗動物及試劑  實驗動物取Wistar大鼠，由延邊大學醫學部實驗動物科提供.考馬斯亮藍為美國Sigma公司產品，G418、牛血清白蛋白（BSA）及生物素為華美生物工程公司產品，150g/L NextGel蛋白電泳溶液及吐溫20（Tween20）為Amresco公司產品，鼠抗cmyc單克隆抗體為Santa Cruz公司產品，辣根過氧化物酶、異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠抗體、二氨基聯苯氨（DAB）染色液及P

8、BS為北京鼎國公司產品.    1.2  重組表達載體pPIC9KScFv A7的構建及表達  由延邊大學基礎醫學院免疫學與病原生物學研究室構建并表達.應用聚合酶鏈反應技術構建重組表達載體pPIC9KScFv A7，用Sal酶切質粒pPIC9KScFv A7使之線性化后電轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，經斑點雜交試驗檢測證實已有單鏈抗體表達.    1.3  單鏈抗體A7表達產物的一般特性鑒定    1.3.1  含有重組表達載體pPIC9KScFv A

9、7酵母的培養  將攜帶有重組基因表達載體的畢赤酵母GS115復蘇后，利用抗生素G418篩選高拷貝重組子，用YPD培養基傳代培養，再經BMGY，BMMY表達培養基培養3d，每24h添加純甲醇使甲醇終質量濃度為10mL/L誘導表達.在108，120，132h時取樣5mL，以14000r/min離心5min，取上清液經低溫濃縮后于4保存備用.    1.3.2  SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳  取20L濃縮樣品（上清液）和等體積的2×SDS上樣緩沖液混勻，于沸水中變性5min，制備聚丙烯酰胺凝膠，上樣40L，190

10、V電泳2h.將凝膠放入考馬斯亮藍染色液中室溫搖動染色30min.陰性對照用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9kScFv A7蛋白樣品.    1.3.3  蛋白印跡試驗  90V轉印2h.移出硝酸纖維素膜，用去離子水沖洗數次，將洗滌后的硝酸纖維素膜放入盛有100mL PBS20g/L脫脂干奶染缸中，室溫搖動封閉2h，棄掉90mL上述液，加入30mL鼠抗cmyc單克隆抗體，置于4過夜，用PBS0.5g/L Tween20液洗滌3次，再用PBS洗滌2次，每次室溫搖動5min，加入30mL辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，室溫

11、搖動反應2h，再用PBS0.5g/L Tween20液洗滌3次，再用PBS洗滌2次，每次室溫搖動5min，加入底物DAB溶液3mL，室溫搖動反應30min，倒掉底物溶液，用去離子水沖洗510次，將硝酸纖維素膜取出，用濾紙吸干.陰性對照用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9kScFv A7蛋白樣品.    1.4  單鏈抗體A7表達產物的特異性鑒定  應用間接免疫熒光技術.取體重為200g的Wistar大鼠的肋間肌，行OCT包埋，常規冰凍切片，在標本處滴加10mmol/L PBS（pH7.4），10min后棄去，滴加40L

12、牛血清白蛋白，室溫下反應15min，滴加40L 120h酵母培養濃縮上清液覆蓋標本，室溫下反應2h，用10mmol/L PBS（pH7.4）沖洗1,2次，浸洗3次，每次5min，不斷搖動，棄掉上述液并晾干，滴加40L鼠抗cmyc單克隆抗體，室溫下反應2h，用10mmol/L PBS（pH7.4）沖洗1，2次，浸洗3次，每次5min，不斷搖動，晾干后滴加異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠抗體溶液，室溫下反應2h，再次洗滌晾干，滴加1滴緩沖甘油，覆以蓋玻片封片.陰性對照用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9kScFv A7蛋白樣品.用熒光顯微鏡在藍光下觀察標本，照像.   

13、; 2  結果    挑取已經整合至酵母GS115的重組載體pPIC9KScFv A7的陽性轉化子在甲醇誘導下進行表達，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白印跡試驗檢測發現，含有單鏈抗體A7基因的酵母上清液中出現單鏈抗體A7的表達，在陰性對照酵母培養上清液中無抗體的表達（Fig1）.間接免疫熒光技術檢測結果顯示，在大鼠肋間肌細胞膜周圍有綠色熒光出現，而GS115/p PIC9K陰性對照則無熒光出現抗乙酰膽堿受體抗體與神經肌肉接頭處的乙酰膽堿受體結合，可激活補體使突觸后膜乙酰膽堿受體遭到破壞，導致肌肉收縮無力，出現重癥肌無力的癥狀.引起重癥肌無力的病因目前還不

14、清楚，但若給動物免疫乙酰膽堿受體或注射抗乙酰膽堿受體抗體，動物可發生實驗性自身免疫性重癥肌無力6，7.真核表達載體pPIC9KScFv A7是在重組質粒pHEN2ScFv A78上擴增出單鏈抗體A7基因，并與純化的真核表達載體pPIC9K連接而成，單鏈抗體A7基因末端連接有cmyc標簽基因，這一基因可與單鏈抗體A7基因一起表達.因而，鼠抗cmyc單克隆抗體可以與表達的蛋白結合，并且羊抗鼠抗體可與鼠抗cmyc單克隆抗體結合，從而有利于表達產物的鑒定.選擇108，120，132h時的陽性轉化子培養上清液經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發現，在分子質量為44ku處出現了條帶，而陰性對照在相應位置上則未

15、見條帶.測定的表達蛋白的分子質量與理論值29ku的分子質量相比稍大一些，提示有糖基化現象，因為甲醇酵母普遍會對表達蛋白進行糖基化修飾，多為N連接的糖鏈，814個甘露糖加于特征性序列AsnXaaThr/Ser(XaaPro)的Asn上9.采用培養108，120，132h時的陽性轉化子的上清液與大鼠肋間肌冰凍切片孵育，使上清液中的表達蛋白充分與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體結合，再與鼠抗cmyc單克隆抗體結合后加入羊抗鼠熒光抗體.本實驗結果表明，在肋間肌細胞膜周圍有綠色熒光出現，而GS115/pPIC9K陰性對照則無熒光出現，提示所分泌的目的蛋白保留了單鏈抗體與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的親和性，這一結果有重

16、要意義，因為在以后應用單鏈抗體治療重癥肌無力中，單鏈抗體必須可與肌肉中固定的乙酰膽堿受體結合，才能競爭性抑制致病性抗體對乙酰膽堿受體的結合.本實驗對酵母表達的單鏈抗體A7進行了一般特性和特異性的鑒定，為今后研究單鏈抗體A7治療重癥肌無力研究提供了實驗依據.【參考文獻】  1 Wu JM, Wu B, Miagkov A, et al.Specific immunotherapy of experimental myasthenia gravis in vitro:the “guided missile” strategyJ.Cell Immunol,2001,208(2):

17、137.2 PaasRozner M, Sela M, Mozes E.The nature of the active suppression of responses associated with experimentale autoimmune myasthenia gravis by a dual peptide ligand administered by different routesJ.Proc Nad Acad Sci USA,2001,98(22):12642.3 Araga S, Xu L, Nakashima K, et al.A peptide vaccine th

18、at prevents experimental autoimmune myasthenia gravis by specifically blocking T cell helpJ.FASEB J,2000,14(1):185.4 Park SS, Ryu CJ, Kang YJ, et al.Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigensJ.Mol Immunol,2000,37(18):1123.5 孟繁平，楊康鵑，Graus Y,等.AChR單抗（A7）誘導大鼠的實驗性重癥肌無力的分子基礎J.中華微生物學和免疫學雜志，1996，16（1）：45.6 Meng F, Stassen M, Schillberg S, et al.Construction and characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravisJ.Autoimmunity,2002,35:125.7 De Baets M, St